白头翁体外抗肿瘤实验研究
作者：蔡鹰 唐永明 梁秉文
单位：蔡鹰 唐永明 梁秉文 解放军第454医院(南京210002)
关键词：白头翁；人肝癌7721细胞株；人宫颈癌Hela细胞株；人胃癌MKN-45细胞株；抗肿瘤
990619 摘 要 通过活细胞计数法、MTT法、集落形成试验，研究了白头翁水提液(PWE)和醇提液(PAE)的体外抗肿瘤作用。结果：活细胞计数表明PWE对7721、Hela、MKN-45细胞株72 h IC50分别为0.88、0.28、0.86 mg/mL，PAE 5 mg/mL对3种细胞48 h生长抑制率分别为78.7%、89.5%、58.9%；PWE对3种细胞降解MTT IC50值分别为0.82、0.60、0.81 mg/mL，PAE 5 mg/mL对3种细胞降解MTT抑制率分别为90.3%、95.6%、62.1%；PWE 2 mg/mL对3种细胞集落抑制率分别为47.8%、63.4%、43.6%；PAE 5 mg/mL对3种细胞集落抑制率分别为61.7%、54.6%、45.3%。提示PWE、PAE有直接细胞毒作用，并和时间、剂量呈正相关，且PWE作用比PAE强。
, 百拇医药
白头翁为毛茛科植物Pulsatilla chinensis (Bge) Regel的干燥根，有清热解毒、凉血止痢的功效，多用于热毒血痢症(如细菌性痢疾、阿米巴痢疾)，药理实验证明其有抗阿米巴原虫、抗菌、抗滴虫作用。曾有报道对肺部鳞癌、黑色素瘤有一定疗效[1]，但临床一般不作重要抗癌中草药使用，笔者在进行体外抗肿瘤药物筛选时，发现其有较高的抗癌活性，现报道如下。
1 材料
1.1 药物：白头翁为本院中药房提供，南京中医药大学中药学院刘文亮教授鉴定，符合药典正品标准。①水提液(PWE)的制备：白头翁5 g，加蒸馏水适量，100℃加热6 h，过滤，滤液浓缩至1 g生药/mL浓缩液，过滤除菌，用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基稀释成不同浓度的药液(根据预试验结果而定，浓度均以相当的生药量表示)，4℃冰箱保存备用。②醇提液(PAE)的制备：白头翁5 g，95%乙醇浸泡48 h，滤液浓缩至干，用5 mL蒸馏水溶解，过滤除菌，用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基稀释成不同浓度的药液，4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
1.2 瘤株及试剂：人肝癌7721细胞株由解放军81医院提供；人宫颈癌Hela细胞株由南京师范大学生物学系提供；人胃癌MKN-45细胞株由上海细胞所提供。RPMI 1640，GIBCO产品，MTT，Sigma产品。
2 方法与结果
2.1 细胞计数法试验：取对数生长期形态佳的3种瘤细胞，分别用0.25%胰酶消化后，用含10%小牛血清1640培养液将瘤细胞制成2×105/mL(7721细胞)、1.5×105/mL(Hela细胞)、4×105/mL(MKN-45细胞)的悬液，加入24孔培养板，每孔1 mL，置5%CO2、37℃的培养箱中，培养24 h后，吸出培养液，按实验设计分别加入药液，阴性对照用相应培养液代之，每24 h镜检、照相记录，台盼蓝染色法作活细胞计数，绘制细胞的生长曲线，并计算细胞生长抑制率[%=(1-给药组细胞数/对照组细胞数)×100%]。
, 百拇医药
2.1.1 PWE对3种瘤细胞生长增殖曲线的影响：见图1～3。
1-对照 2-0.651 mg/mL 3-0.911 mg/mL
4-1.276 mg/mL 5-1.786 mg/mL 6-2.500 mg/mL
图1 PWE对7721细胞生长增殖曲线的影响
1-对照 2-0.651 mg/mL 3-0.911 mg/mL
4-1.276 mg/mL 5-1.786 mg/mL 6-2.500 mg/mL
, 百拇医药
图2 PWE对Hela细胞生长增殖曲线的影响
1-对照 2-0.911 mg/mL 3-1.276 mg/mL
4-1.786 mg/mL 5-2.500 mg/mL 6-3.500 mg/mL
图3 PWE对MKN-45细胞生长增殖曲线的影响
2.1.2 PWE对细胞倍增时间(tD)的影响：在指数生长期细胞生长tD=0.301 t/logNt-logNo, t为细胞培养时间(h)，No及Nt分别代表接种时及培养t h的细胞数。PWE 2.5 mg/mL tD及延长率见表1，表明PWE能明显延长3种细胞倍增时间，影响存活细胞的生长特性。
, 百拇医药
表1 PWE对3种细胞tD的影响 细胞种类
对照组
tD(h)
用药组
tD(h)
延长率
(%)
7721
18
31
72
Hela
, 百拇医药
17
39
124
MKN-45
21
41
95
2.1.3 对细胞生长抑制率的影响：随着时间和剂量的增加，PWE、PAE对3种细胞生长抑制率也增加，呈量效时效关系。PWE对3种细胞生长24、48、72 h的半数抑制浓度IC50见表2，PAE(5 mg/mL)对3种细胞生长抑制率见表3，说明PWE作用比PAE强。 表2 PWE对3种细胞生长不同时间的半数抑制浓度IC50(mg/mL) 细胞种类
, 百拇医药 24 h
48 h
72 h
7721
3.61
1.60
0.88
Hela
3.04
0.79
0.28
MKN-45
3.78
, 百拇医药
1.97
0.86
表3 PAE(5 mg/mL)对3种细胞生长抑制率(%) 细胞种类
24 h
48 h
7721
33.6
78.7
Hela
46.2
89.5
MKN-45
, 百拇医药
21.2
58.9
2.2 MTT法测细胞增殖抑制率：分别收集对数生长期的3种细胞(1×104 /mL)，种入96孔培养板，每孔100 μL，置5%CO2、37℃的培养箱中，培养24 h后，吸出培养液，分别按设计加入药液，阴性对照用相应培养液代之，72 h后，每孔加入10 μL MTT (5 g/L)，37℃作用4 h，除去上清液，加入DMSO溶解，平板振荡仪振荡10 min，酶联免疫仪570 nm波长检测各孔吸光度(A)值，按公式计算抑制率[%=(1-实验组A值均数/对照组A值的均数)×100%]。PWE作用结果见表4。PAE 5 mg/mL对7721、Hela、MKN-45细胞降解MTT抑制率分别为90.3%、95.6%、62.1%。表4 PWE对3种细胞降解MTT的影响(n=3) 分组
浓度
, http://www.100md.com
(mg/mL)
吸光度
(A)
7721
抑制率
(%)
IC50
(mg/mL)
吸光度
(A)
Hela
抑制率
(%)
, 百拇医药
IC50
(mg/mL)
吸光度
(A)
MKN-45
抑制率
(%)
IC50
(mg/mL)
对照组
-
0.46±0.15
, http://www.100md.com
0.49±0.03
0.38±0.09
PWE
1.786
0.09±0.04
80.43
0.03±0.14
93.88
0.02±0.03
94.73
1.276
0.15±0.12
, 百拇医药
67.39
0.82
0.09±0.02
81.63
0.60
0.08±0.04
78.94
0.81
0.911
0.19±0.05
58.70
0.17±0.08
, 百拇医药
65.31
0.12±0.12
68.42
0.651
0.25±0.11
45.65
0.21±0.15
57.14
0.17±0.05
55.26
0.465
0.31±0.13
, http://www.100md.com
32.61
0.31±0.13
36.73
0.23±0.11
39.47
2.3 集落形成试验：将300 cell/mL对数生长期的单个分散细胞接种到6孔细胞培养板中(培养液含20%FBS)，待细胞开始分裂时，吸出培养液，分别加入药液，阴性对照用相应培养液代之，5 d后，更换培养液和相同量药物，10 d后用氨基黑染色，计数集落数，计算集落抑制率[%=(1-给药组集落数/对照组集落数)×100%]。结果见表5。表5 PWE、PAE对3种细胞集落形成的抑制率(n=3)
浓度 (mg/mL)
细胞种类
, 百拇医药
抑制率 (%)
PWE
2
7721
47.8
2
Hela
63.4
2
MKN-45
43.6
PAE
5
, http://www.100md.com
7721
61.7
5
Hela
54.6
5
MKN-45
45.3
3 讨论
3种方法结果一致，均表明PWE、PAE对3种肿瘤细胞有较强的抑制作用，PWE 2 mg/mL左右就可产生非常显著的抑制肿瘤细胞生长作用，提示白头翁抗肿瘤作用主要通过其直接作用于肿瘤细胞所致，有无诱导细胞分化作用，有待进一步研究。
, 百拇医药
白头翁成分复杂，主要有白头翁素、白头翁英、白关翁灵、23-羟基白桦酸、白头翁皂苷A3、B4等，白头翁英、白头翁灵，有类似洋地黄强心作用，新鲜的白头翁含原白头翁素，对皮肤粘膜有强烈刺激性，干燥久存的白头翁因原白头翁素聚合为白头翁素，局部刺激作用大为降低[2]，白头翁煎剂及其皂苷毒性很低，对大鼠几无毒[3]，所以在临床剂量下组织药物浓度可达到有效抗肿瘤浓度。再根据5 g白头翁生药可制得PWE约0.4 g计算，对3种肿瘤细胞72 h的IC50值(实际PWE浓度)分别为70.4、22.4、68.8 μg/mL，亦符合IC50<100 μg/mL认为有用的要求[4]，说明白头翁在临床抗肿瘤方面有潜在价值，值得进一步研究。
实验结果还表明PWE作用比PAE强，提示白头翁抗肿瘤活性成分系水溶性物质，亦可部分溶于乙醇。究竟哪些成分是抗肿瘤活性成分，现在尚难定论，小鼠体内试验正在进行，将另文发表。
参 考 文 献
1 王浴生主编.中药药理与应用.北京：人民卫生出版社，1993：330
2 李仪奎主编.中药药理学.北京：中国医药出版社，1992：215
3 江苏新医学院编.中药大辞典.上册.上海：上海人民出版社，1997：705
4 徐叔云主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982：1138
(1998-11-20收稿), 百拇医药
单位：蔡鹰 唐永明 梁秉文 解放军第454医院(南京210002)
关键词：白头翁；人肝癌7721细胞株；人宫颈癌Hela细胞株；人胃癌MKN-45细胞株；抗肿瘤
990619 摘 要 通过活细胞计数法、MTT法、集落形成试验，研究了白头翁水提液(PWE)和醇提液(PAE)的体外抗肿瘤作用。结果：活细胞计数表明PWE对7721、Hela、MKN-45细胞株72 h IC50分别为0.88、0.28、0.86 mg/mL，PAE 5 mg/mL对3种细胞48 h生长抑制率分别为78.7%、89.5%、58.9%；PWE对3种细胞降解MTT IC50值分别为0.82、0.60、0.81 mg/mL，PAE 5 mg/mL对3种细胞降解MTT抑制率分别为90.3%、95.6%、62.1%；PWE 2 mg/mL对3种细胞集落抑制率分别为47.8%、63.4%、43.6%；PAE 5 mg/mL对3种细胞集落抑制率分别为61.7%、54.6%、45.3%。提示PWE、PAE有直接细胞毒作用，并和时间、剂量呈正相关，且PWE作用比PAE强。
, 百拇医药
白头翁为毛茛科植物Pulsatilla chinensis (Bge) Regel的干燥根，有清热解毒、凉血止痢的功效，多用于热毒血痢症(如细菌性痢疾、阿米巴痢疾)，药理实验证明其有抗阿米巴原虫、抗菌、抗滴虫作用。曾有报道对肺部鳞癌、黑色素瘤有一定疗效[1]，但临床一般不作重要抗癌中草药使用，笔者在进行体外抗肿瘤药物筛选时，发现其有较高的抗癌活性，现报道如下。
1 材料
1.1 药物：白头翁为本院中药房提供，南京中医药大学中药学院刘文亮教授鉴定，符合药典正品标准。①水提液(PWE)的制备：白头翁5 g，加蒸馏水适量，100℃加热6 h，过滤，滤液浓缩至1 g生药/mL浓缩液，过滤除菌，用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基稀释成不同浓度的药液(根据预试验结果而定，浓度均以相当的生药量表示)，4℃冰箱保存备用。②醇提液(PAE)的制备：白头翁5 g，95%乙醇浸泡48 h，滤液浓缩至干，用5 mL蒸馏水溶解，过滤除菌，用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基稀释成不同浓度的药液，4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
1.2 瘤株及试剂：人肝癌7721细胞株由解放军81医院提供；人宫颈癌Hela细胞株由南京师范大学生物学系提供；人胃癌MKN-45细胞株由上海细胞所提供。RPMI 1640，GIBCO产品，MTT，Sigma产品。
2 方法与结果
2.1 细胞计数法试验：取对数生长期形态佳的3种瘤细胞，分别用0.25%胰酶消化后，用含10%小牛血清1640培养液将瘤细胞制成2×105/mL(7721细胞)、1.5×105/mL(Hela细胞)、4×105/mL(MKN-45细胞)的悬液，加入24孔培养板，每孔1 mL，置5%CO2、37℃的培养箱中，培养24 h后，吸出培养液，按实验设计分别加入药液，阴性对照用相应培养液代之，每24 h镜检、照相记录，台盼蓝染色法作活细胞计数，绘制细胞的生长曲线，并计算细胞生长抑制率[%=(1-给药组细胞数/对照组细胞数)×100%]。
, 百拇医药
2.1.1 PWE对3种瘤细胞生长增殖曲线的影响：见图1～3。
1-对照 2-0.651 mg/mL 3-0.911 mg/mL
4-1.276 mg/mL 5-1.786 mg/mL 6-2.500 mg/mL
图1 PWE对7721细胞生长增殖曲线的影响
1-对照 2-0.651 mg/mL 3-0.911 mg/mL
4-1.276 mg/mL 5-1.786 mg/mL 6-2.500 mg/mL
, 百拇医药
图2 PWE对Hela细胞生长增殖曲线的影响
1-对照 2-0.911 mg/mL 3-1.276 mg/mL
4-1.786 mg/mL 5-2.500 mg/mL 6-3.500 mg/mL
图3 PWE对MKN-45细胞生长增殖曲线的影响
2.1.2 PWE对细胞倍增时间(tD)的影响：在指数生长期细胞生长tD=0.301 t/logNt-logNo, t为细胞培养时间(h)，No及Nt分别代表接种时及培养t h的细胞数。PWE 2.5 mg/mL tD及延长率见表1，表明PWE能明显延长3种细胞倍增时间，影响存活细胞的生长特性。
, 百拇医药
表1 PWE对3种细胞tD的影响 细胞种类
对照组
tD(h)
用药组
tD(h)
延长率
(%)
7721
18
31
72
Hela
, 百拇医药
17
39
124
MKN-45
21
41
95
2.1.3 对细胞生长抑制率的影响：随着时间和剂量的增加，PWE、PAE对3种细胞生长抑制率也增加，呈量效时效关系。PWE对3种细胞生长24、48、72 h的半数抑制浓度IC50见表2，PAE(5 mg/mL)对3种细胞生长抑制率见表3，说明PWE作用比PAE强。 表2 PWE对3种细胞生长不同时间的半数抑制浓度IC50(mg/mL) 细胞种类
, 百拇医药 24 h
48 h
72 h
7721
3.61
1.60
0.88
Hela
3.04
0.79
0.28
MKN-45
3.78
, 百拇医药
1.97
0.86
表3 PAE(5 mg/mL)对3种细胞生长抑制率(%) 细胞种类
24 h
48 h
7721
33.6
78.7
Hela
46.2
89.5
MKN-45
, 百拇医药
21.2
58.9
2.2 MTT法测细胞增殖抑制率：分别收集对数生长期的3种细胞(1×104 /mL)，种入96孔培养板，每孔100 μL，置5%CO2、37℃的培养箱中，培养24 h后，吸出培养液，分别按设计加入药液，阴性对照用相应培养液代之，72 h后，每孔加入10 μL MTT (5 g/L)，37℃作用4 h，除去上清液，加入DMSO溶解，平板振荡仪振荡10 min，酶联免疫仪570 nm波长检测各孔吸光度(A)值，按公式计算抑制率[%=(1-实验组A值均数/对照组A值的均数)×100%]。PWE作用结果见表4。PAE 5 mg/mL对7721、Hela、MKN-45细胞降解MTT抑制率分别为90.3%、95.6%、62.1%。表4 PWE对3种细胞降解MTT的影响(n=3) 分组
浓度
, http://www.100md.com
(mg/mL)
吸光度
(A)
7721
抑制率
(%)
IC50
(mg/mL)
吸光度
(A)
Hela
抑制率
(%)
, 百拇医药
IC50
(mg/mL)
吸光度
(A)
MKN-45
抑制率
(%)
IC50
(mg/mL)
对照组
-
0.46±0.15
, http://www.100md.com
0.49±0.03
0.38±0.09
PWE
1.786
0.09±0.04
80.43
0.03±0.14
93.88
0.02±0.03
94.73
1.276
0.15±0.12
, 百拇医药
67.39
0.82
0.09±0.02
81.63
0.60
0.08±0.04
78.94
0.81
0.911
0.19±0.05
58.70
0.17±0.08
, 百拇医药
65.31
0.12±0.12
68.42
0.651
0.25±0.11
45.65
0.21±0.15
57.14
0.17±0.05
55.26
0.465
0.31±0.13
, http://www.100md.com
32.61
0.31±0.13
36.73
0.23±0.11
39.47
2.3 集落形成试验：将300 cell/mL对数生长期的单个分散细胞接种到6孔细胞培养板中(培养液含20%FBS)，待细胞开始分裂时，吸出培养液，分别加入药液，阴性对照用相应培养液代之，5 d后，更换培养液和相同量药物，10 d后用氨基黑染色，计数集落数，计算集落抑制率[%=(1-给药组集落数/对照组集落数)×100%]。结果见表5。表5 PWE、PAE对3种细胞集落形成的抑制率(n=3)
浓度 (mg/mL)
细胞种类
, 百拇医药
抑制率 (%)
PWE
2
7721
47.8
2
Hela
63.4
2
MKN-45
43.6
PAE
5
, http://www.100md.com
7721
61.7
5
Hela
54.6
5
MKN-45
45.3
3 讨论
3种方法结果一致，均表明PWE、PAE对3种肿瘤细胞有较强的抑制作用，PWE 2 mg/mL左右就可产生非常显著的抑制肿瘤细胞生长作用，提示白头翁抗肿瘤作用主要通过其直接作用于肿瘤细胞所致，有无诱导细胞分化作用，有待进一步研究。
, 百拇医药
白头翁成分复杂，主要有白头翁素、白头翁英、白关翁灵、23-羟基白桦酸、白头翁皂苷A3、B4等，白头翁英、白头翁灵，有类似洋地黄强心作用，新鲜的白头翁含原白头翁素，对皮肤粘膜有强烈刺激性，干燥久存的白头翁因原白头翁素聚合为白头翁素，局部刺激作用大为降低[2]，白头翁煎剂及其皂苷毒性很低，对大鼠几无毒[3]，所以在临床剂量下组织药物浓度可达到有效抗肿瘤浓度。再根据5 g白头翁生药可制得PWE约0.4 g计算，对3种肿瘤细胞72 h的IC50值(实际PWE浓度)分别为70.4、22.4、68.8 μg/mL，亦符合IC50<100 μg/mL认为有用的要求[4]，说明白头翁在临床抗肿瘤方面有潜在价值，值得进一步研究。
实验结果还表明PWE作用比PAE强，提示白头翁抗肿瘤活性成分系水溶性物质，亦可部分溶于乙醇。究竟哪些成分是抗肿瘤活性成分，现在尚难定论，小鼠体内试验正在进行，将另文发表。
参 考 文 献
1 王浴生主编.中药药理与应用.北京：人民卫生出版社，1993：330
2 李仪奎主编.中药药理学.北京：中国医药出版社，1992：215
3 江苏新医学院编.中药大辞典.上册.上海：上海人民出版社，1997：705
4 徐叔云主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982：1138
(1998-11-20收稿), 百拇医药