镁离子对培养乳鼠心肌细胞羟自由基损伤的保护作用
作者：李洁 徐标 何家声
单位：南京铁道医学院心内科 (南京 210009)
关键词：镁离子；心肌细胞；羟自由基；乳酸脱氢酶；丙二醛
铁道医学990607 【摘要】 目的 观察镁离子对培养乳鼠心肌细胞羟自由基损伤的保护作用。方法 本实验利用FeSO4/H2O2自由基产生体系，观察羟自由基作用于培养乳鼠心肌细胞，其上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量的变化，以及镁离子对这种作用的影响。结果 (1)羟自由基作用于培养乳鼠心肌细胞，其上清液中LDH和MDA的含量增加。(2)镁离子能减少羟自由基引起的LDH和MDA含量的增加，且呈一定浓度、时间依赖关系。结论 羟自由基使培养乳鼠心肌细胞LDH漏出增加及脂质过氧化终产物MDA含量增加，镁离子对这一损伤有保护作用。
, 百拇医药
Effects of Mg2+ on damages of cultured cardiomyocytes induced
by hydroxyl free radicals
Li Jie,Xu Biao,He Jiasheng.
Division of Cadiology, Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009
【Abstract】 Objective To study the protective effects of Mg2+ on damages induced by hydroxyl free radicals.Method In cultured cadiac myocytes isolated from neonatal rat ventricle, malondiaclehyde (MDA) formation and LDH leakage are measured.The hydro～xyl free radicals were produced by FeSO4/H2O2 system.Results (1)The volume of LDH and MDA increased as hydroxyl free medicals gave effect to cardiac myocytes of culture neonate rat.(2)Magnesium could decrease the volume of LDH and MDA induced by hydroxyl free radicals and were concentration and time-dependent.Conclusion Hyolroxyl free radicals could increase the volume of LDH and MDA and magnesium could have protective effect on such a damage.
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【Key words】 magnesium cardiac myocytes hydroxyl free radicals lactate dehydrogenase malonyldialdehyde
(Railway Medical Journal,1999,27:373～375)
镁离子在人体内是仅次于钙、钠、钾的阳离子，为体内的必需元素，具有许多极为重要的生理生化作用。镁离子作为多种酶的激动剂，参与酶促反应，是线粒体能量代谢过程中的必须离子。利用在体急性心肌缺血-再灌注模型，在心肌缺血前运用镁盐能产生抗心肌缺血-再灌注损伤作用[1]。自由基学说是心肌缺血-再灌注损伤的重要发病机制[2]，本研究通过FeSO4/H2O2自由基产生体系，观察羟自由基作用于培养乳鼠心肌细胞，其上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量的变化，以及镁离子对这种作用的影响。
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1 材 料
1.1 动物 2～3 d SD大鼠乳鼠，由本院动物中心提供。
1.2 试剂
培养液：DME/F12(1∶1 MIXTURE)培养剂(Sigma，U.S.A，无CaCl2，MgCl2, MgSO4，NaHCO3，酚红)加10%胎牛血清、青霉素1×105 U.L-1和链霉素100 mg.L-1、Hepes(中国科学院产品)、NaHCO3(上海红光化工厂)，pH调至7.2～7.4，用赛氏滤器抽滤除菌，于-20 ℃保存备用。
胎牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所产品，经56 ℃水浴30 min灭活后，在-20 ℃保存备用。
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胶原酶Ⅳ：CollagenaseⅣ(Sigma，U.S.A)，用D-Hank’s液配成0.06% 浓度，针头滤器过滤除菌，-20 ℃贮存备用。
丙二醛(MDA)测定药盒由南京建成生物研究所制备;乳酸脱氢酶(LDH)测定药盒由南京建成生物研究所制备;721型分光光度计、恒温水浴箱、离心机均为上海第三仪器厂产品。
2 方 法
2.1 心肌细胞培养 按改良的Simpson法[3]，2～3 d昆明幼鼠乙醚麻醉后，取出心脏置于D-Hank’s液中，冲洗心脏2～3次，分离心室，将心室切成1 mm3大小，加入0.06%胶原酶Ⅳ，37 ℃恒温震荡5 min，弃掉第1次含有红细胞和细胞碎片的上清液，反复消化5～6次，将以后每次分离的上清液加入离心管中，并加入等量的DME/F12无镁培养液轻轻吹打，制成细胞悬液，置于100 mm培养皿中，37 ℃孵育90 min轻轻倒出上清，以200目尼龙网过滤，即可获得纯净的心肌细胞。用Typan蓝染色细胞证实存活率在95%以上，加入含10%胎牛血清、青霉素1×105 U.L-1和链霉素100 mg.L-1的DME/F12，调整细胞浓度为2×109.L，种植于6孔培养板中，置于5% CO2培养箱，24～48 h后80%的细胞贴壁，每2～3 d换液1次。
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2.2 分组 心肌细胞培养4 d后进行实验，分为下列各组：
A组：正常对照组n=6;B组：羟自由基损伤n=6，加入FeSO4 0.03 mmol.L-1和H2O2 0.03 mmol.L-1；C组：镁离子加羟自由基组，使镁离子浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol.L-1，上述各组在加入处理因素6、12、24 h后收获上清，贮于-30 ℃待测。
2.3 LDH的测定 按试剂盒说明书测定。
2.4 MDA的测定 按试剂盒说明书测定。
3 统计学处理
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所有数据以
±s表示，并用one-way ANOVA(Prism公司)进行统计分析，以P<0.05为显著性差异。
4 结 果
4.1 上清液中LDH含量的变化 羟自由基可使培养乳鼠心肌细胞上清液LDH含量迅速上升，镁离子可抑制羟自由基损伤引起的LDH升高，并呈一定浓度依赖关系(见图1)，两组之间在6、12、24 h均有显著性差异(见图2)。
4.2 上清液中MDA含量的变化 羟自由基可使培养乳鼠心肌细胞MDA产生增加，镁离子可抑制羟自由基所致的脂质过氧化产物MDA含量的增加，并呈一定浓度依赖关系(见图3),两组之间在6、12、24 h均有显著性差异(见图4)。
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图1 不同浓度上清液中LDH含量的变化
图2 不同时间上清液中LDH含量的变化
图3 不同浓度上清液中MDA含量的变化
图4 不同时间上清液中MDA含量的变化
5 讨 论
自由基学说是心肌缺血-再灌注损伤的重要发病机制[2]，我们通过FeSO4/H2O2体系来观察羟自由基对培养乳鼠心肌细胞的损伤，以及镁离子对羟自由基损伤的保护作用。线粒体不仅是能量代谢的中心场所，也是自由基产生体系，H2O2是活性氧，如果遇到Fe2+则可生成对生物体及其有害的羟自由基，能够直接损伤线粒体呼吸链，影响H+转位，使跨膜电化学质子梯度降低，ATP合成受阻，或者直接损伤H+-ATPase亚基结构，使ATP的产生和利用均下降，另外，自由基及其脂质过氧化物可与蛋白质、氨基酸交联导致严重的膜损伤[4]。心肌线粒体膜脂质过氧化水平升高，引起膜流动性下降，从而影响电子传递活动，影响呼吸链的活性，导致线粒体GSH/GSSG和NADPH下降，ATP合成活力下降[5]。
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体外培养的乳鼠心肌细胞可因许多因素造成损伤，其中LDH的外漏是判断损伤的重要依据。羟自由基损伤细胞时，由于线粒体ATP的产生和贮存减少，钠泵和钙泵功能降低，排钙能力降低，胞内Ca2+增加，同时激活脂解酶分解膜结构，胞内酶外漏[6]，镁离子作为多种酶的激动剂，参与多种酶促反应，包括核酸、蛋白质、糖、脂质以及能量代谢等各方面，作为己糖激酶的变构激活剂，参与三羧酸循环，对丙酮酸的氧化具有重要作用，是线粒体中能量代谢的必须离子。丙二醛作为脂质过氧化终产物，也是羟自由基损伤细胞的指标。本实验观察到羟自由基可使培养乳鼠心肌细胞上清液LDH和MDA含量迅速升高，镁离子可抑制其升高P<0.001并呈一定浓度依赖关系，两组之间在6、12、24 h均有显著性差异。LDH漏出水平及脂质过氧化反应指标，均提示Mg2+对培养乳鼠心肌细胞羟自由基损伤有保护作用，可能机制是镁离子使心肌细胞线粒体产生ATP的能力增加。另外，作为二价离子，Mg2+是一种直接自由基清除剂[7]。
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参考文献
1 郑信华，赵华日.镁盐抗心肌缺血-再灌注损伤的研究.中国危重病急救医学，1996，8(5)：259
2 Dicken BF, Weglicki WB, Li YS,et al.Magnesium deficiency in vitro enhances free radical-induced intracellular oxidation and cytotoxicity in endothelial cells. FEBS-Lett，1992，311(3):187
3 Simpson P, McGrath A, Savions H. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and catecholamines. Circ Res，1982，51:787
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4 Bastounis E. Free radical related myocardial mitochondrial damage following limb ischaemia-reperfusion. Cardiovasc Res，1994，28(12):1868
5 Akaike T, Suga M, Maeda H. Free radicals in viral pathogenesis:molecular mechanisms involving superoxide and NO.Proc Soc Exp Biol Med，1998，217(1):64
6 Jung DW，Baysal K,Brierley GP.Properties of the Na+-Ca2+ antiport of heart mitochondria. Ann N Y Acad Sci,1996,799:553
7 Afanasev IB, Suslova TB Study of antioxidant properties of metal aspartates. Analyst,1995,120(3):859
收稿：1999-06-30 修回：1999-09-12, http://www.100md.com
单位：南京铁道医学院心内科 (南京 210009)
关键词：镁离子；心肌细胞；羟自由基；乳酸脱氢酶；丙二醛
铁道医学990607 【摘要】 目的 观察镁离子对培养乳鼠心肌细胞羟自由基损伤的保护作用。方法 本实验利用FeSO4/H2O2自由基产生体系，观察羟自由基作用于培养乳鼠心肌细胞，其上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量的变化，以及镁离子对这种作用的影响。结果 (1)羟自由基作用于培养乳鼠心肌细胞，其上清液中LDH和MDA的含量增加。(2)镁离子能减少羟自由基引起的LDH和MDA含量的增加，且呈一定浓度、时间依赖关系。结论 羟自由基使培养乳鼠心肌细胞LDH漏出增加及脂质过氧化终产物MDA含量增加，镁离子对这一损伤有保护作用。
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Effects of Mg2+ on damages of cultured cardiomyocytes induced
by hydroxyl free radicals
Li Jie,Xu Biao,He Jiasheng.
Division of Cadiology, Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009
【Abstract】 Objective To study the protective effects of Mg2+ on damages induced by hydroxyl free radicals.Method In cultured cadiac myocytes isolated from neonatal rat ventricle, malondiaclehyde (MDA) formation and LDH leakage are measured.The hydro～xyl free radicals were produced by FeSO4/H2O2 system.Results (1)The volume of LDH and MDA increased as hydroxyl free medicals gave effect to cardiac myocytes of culture neonate rat.(2)Magnesium could decrease the volume of LDH and MDA induced by hydroxyl free radicals and were concentration and time-dependent.Conclusion Hyolroxyl free radicals could increase the volume of LDH and MDA and magnesium could have protective effect on such a damage.
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【Key words】 magnesium cardiac myocytes hydroxyl free radicals lactate dehydrogenase malonyldialdehyde
(Railway Medical Journal,1999,27:373～375)
镁离子在人体内是仅次于钙、钠、钾的阳离子，为体内的必需元素，具有许多极为重要的生理生化作用。镁离子作为多种酶的激动剂，参与酶促反应，是线粒体能量代谢过程中的必须离子。利用在体急性心肌缺血-再灌注模型，在心肌缺血前运用镁盐能产生抗心肌缺血-再灌注损伤作用[1]。自由基学说是心肌缺血-再灌注损伤的重要发病机制[2]，本研究通过FeSO4/H2O2自由基产生体系，观察羟自由基作用于培养乳鼠心肌细胞，其上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量的变化，以及镁离子对这种作用的影响。
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1 材 料
1.1 动物 2～3 d SD大鼠乳鼠，由本院动物中心提供。
1.2 试剂
培养液：DME/F12(1∶1 MIXTURE)培养剂(Sigma，U.S.A，无CaCl2，MgCl2, MgSO4，NaHCO3，酚红)加10%胎牛血清、青霉素1×105 U.L-1和链霉素100 mg.L-1、Hepes(中国科学院产品)、NaHCO3(上海红光化工厂)，pH调至7.2～7.4，用赛氏滤器抽滤除菌，于-20 ℃保存备用。
胎牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所产品，经56 ℃水浴30 min灭活后，在-20 ℃保存备用。
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胶原酶Ⅳ：CollagenaseⅣ(Sigma，U.S.A)，用D-Hank’s液配成0.06% 浓度，针头滤器过滤除菌，-20 ℃贮存备用。
丙二醛(MDA)测定药盒由南京建成生物研究所制备;乳酸脱氢酶(LDH)测定药盒由南京建成生物研究所制备;721型分光光度计、恒温水浴箱、离心机均为上海第三仪器厂产品。
2 方 法
2.1 心肌细胞培养 按改良的Simpson法[3]，2～3 d昆明幼鼠乙醚麻醉后，取出心脏置于D-Hank’s液中，冲洗心脏2～3次，分离心室，将心室切成1 mm3大小，加入0.06%胶原酶Ⅳ，37 ℃恒温震荡5 min，弃掉第1次含有红细胞和细胞碎片的上清液，反复消化5～6次，将以后每次分离的上清液加入离心管中，并加入等量的DME/F12无镁培养液轻轻吹打，制成细胞悬液，置于100 mm培养皿中，37 ℃孵育90 min轻轻倒出上清，以200目尼龙网过滤，即可获得纯净的心肌细胞。用Typan蓝染色细胞证实存活率在95%以上，加入含10%胎牛血清、青霉素1×105 U.L-1和链霉素100 mg.L-1的DME/F12，调整细胞浓度为2×109.L，种植于6孔培养板中，置于5% CO2培养箱，24～48 h后80%的细胞贴壁，每2～3 d换液1次。
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2.2 分组 心肌细胞培养4 d后进行实验，分为下列各组：
A组：正常对照组n=6;B组：羟自由基损伤n=6，加入FeSO4 0.03 mmol.L-1和H2O2 0.03 mmol.L-1；C组：镁离子加羟自由基组，使镁离子浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol.L-1，上述各组在加入处理因素6、12、24 h后收获上清，贮于-30 ℃待测。
2.3 LDH的测定 按试剂盒说明书测定。
2.4 MDA的测定 按试剂盒说明书测定。
3 统计学处理
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所有数据以
±s表示，并用one-way ANOVA(Prism公司)进行统计分析，以P<0.05为显著性差异。4 结 果
4.1 上清液中LDH含量的变化 羟自由基可使培养乳鼠心肌细胞上清液LDH含量迅速上升，镁离子可抑制羟自由基损伤引起的LDH升高，并呈一定浓度依赖关系(见图1)，两组之间在6、12、24 h均有显著性差异(见图2)。
4.2 上清液中MDA含量的变化 羟自由基可使培养乳鼠心肌细胞MDA产生增加，镁离子可抑制羟自由基所致的脂质过氧化产物MDA含量的增加，并呈一定浓度依赖关系(见图3),两组之间在6、12、24 h均有显著性差异(见图4)。
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图1 不同浓度上清液中LDH含量的变化
图2 不同时间上清液中LDH含量的变化
图3 不同浓度上清液中MDA含量的变化
图4 不同时间上清液中MDA含量的变化
5 讨 论
自由基学说是心肌缺血-再灌注损伤的重要发病机制[2]，我们通过FeSO4/H2O2体系来观察羟自由基对培养乳鼠心肌细胞的损伤，以及镁离子对羟自由基损伤的保护作用。线粒体不仅是能量代谢的中心场所，也是自由基产生体系，H2O2是活性氧，如果遇到Fe2+则可生成对生物体及其有害的羟自由基，能够直接损伤线粒体呼吸链，影响H+转位，使跨膜电化学质子梯度降低，ATP合成受阻，或者直接损伤H+-ATPase亚基结构，使ATP的产生和利用均下降，另外，自由基及其脂质过氧化物可与蛋白质、氨基酸交联导致严重的膜损伤[4]。心肌线粒体膜脂质过氧化水平升高，引起膜流动性下降，从而影响电子传递活动，影响呼吸链的活性，导致线粒体GSH/GSSG和NADPH下降，ATP合成活力下降[5]。
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体外培养的乳鼠心肌细胞可因许多因素造成损伤，其中LDH的外漏是判断损伤的重要依据。羟自由基损伤细胞时，由于线粒体ATP的产生和贮存减少，钠泵和钙泵功能降低，排钙能力降低，胞内Ca2+增加，同时激活脂解酶分解膜结构，胞内酶外漏[6]，镁离子作为多种酶的激动剂，参与多种酶促反应，包括核酸、蛋白质、糖、脂质以及能量代谢等各方面，作为己糖激酶的变构激活剂，参与三羧酸循环，对丙酮酸的氧化具有重要作用，是线粒体中能量代谢的必须离子。丙二醛作为脂质过氧化终产物，也是羟自由基损伤细胞的指标。本实验观察到羟自由基可使培养乳鼠心肌细胞上清液LDH和MDA含量迅速升高，镁离子可抑制其升高P<0.001并呈一定浓度依赖关系，两组之间在6、12、24 h均有显著性差异。LDH漏出水平及脂质过氧化反应指标，均提示Mg2+对培养乳鼠心肌细胞羟自由基损伤有保护作用，可能机制是镁离子使心肌细胞线粒体产生ATP的能力增加。另外，作为二价离子，Mg2+是一种直接自由基清除剂[7]。
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参考文献
1 郑信华，赵华日.镁盐抗心肌缺血-再灌注损伤的研究.中国危重病急救医学，1996，8(5)：259
2 Dicken BF, Weglicki WB, Li YS,et al.Magnesium deficiency in vitro enhances free radical-induced intracellular oxidation and cytotoxicity in endothelial cells. FEBS-Lett，1992，311(3):187
3 Simpson P, McGrath A, Savions H. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and catecholamines. Circ Res，1982，51:787
, 百拇医药
4 Bastounis E. Free radical related myocardial mitochondrial damage following limb ischaemia-reperfusion. Cardiovasc Res，1994，28(12):1868
5 Akaike T, Suga M, Maeda H. Free radicals in viral pathogenesis:molecular mechanisms involving superoxide and NO.Proc Soc Exp Biol Med，1998，217(1):64
6 Jung DW，Baysal K,Brierley GP.Properties of the Na+-Ca2+ antiport of heart mitochondria. Ann N Y Acad Sci,1996,799:553
7 Afanasev IB, Suslova TB Study of antioxidant properties of metal aspartates. Analyst,1995,120(3):859
收稿：1999-06-30 修回：1999-09-12, http://www.100md.com