原发性肾病综合征患者IL-13血浆水平和基因表达的研究
作者：张肇 陈孝文 江黎明 王建勋 吴平 黄萍萍
单位：广东医学院附属医院肾脏病研究所 (广东湛江，524001)
关键词：原发性肾病综合征；白细胞介素-13；基因表达
摘 要 目的摘 要 目的：探讨成人原发性肾病综合征(NS)患者外周血单个核细胞(PBMC)中IL-13mRNA表达及IL-13血浆水平变化。 方法：选择10名健康正常对照者和16名NS患者。采用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，对NS患者PBMC中IL-13 mRNA表达量进行分析。同时应用IL-13特异的酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-13血浆水平。 结果：NS患者PBMC中IL-13 mRNA表达量及血浆IL-13水平均较正常对照组增高(IL-13 mRNA表达量为1.28±0.13 vs 0.45±0.12，P<0.05；IL-13血浆水平为55.73±12.72 vs 28.51±8.36，P<0.05)。蛋白尿伴肉眼血尿组NS患者的IL-13血浆水平较单纯蛋白尿组降低(68.91±4.34 vs 54.65±2.11，P<0.05)。直线相关分析表明，IL-13血浆水平与NS患者蛋白尿和血尿程度呈负相关，r分别为-0.553和-0.708，P均小于0.05。 结论：IL-13参与NS分子发病机制，IL-13蛋白质分泌水平相对下降，在NS患者肾小球硬化发生发展中可能起一定作用。
, 百拇医药
IL-13 GENE EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS ANDPLASMA IL 13 LEVELS IN ADULT PRIMARY NEPHROTIC SYNDROME.
Zhang Zhao，Chen Xiaowen，Jiang Liming，Wang Jianxun，Wu Ping，Huang Pingping.
Kidney Institute，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Guangdong，Zhanjiang，524001
OBJECTIVE To investigated the clinical significance of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) IL13 gene expression and plasma IL-13 levels in patients with primary nephrotic syndrome(NS).
, 百拇医药
METHODOLOGY 10 healthy volunteers and 16 patients with primary NS were included in this study.All patients underwent percutaneous renal biopsy with light microscopic and immunoflurecence microscopic examination.The expression of IL13 mRNA in PBMC was evaluated by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR).The levels of plasma IL-13 were determined using an IL-13 specific enzyme-linked imunosorbent assay(ELISA).
RESULTS The expression of IL-13 mRNA in PBMC and plasma levels of IL-13 in patients with primary NS were significantly higher than those of the healthy controls (1.28±0.13 vs 0.45+0.12，P<0.05，55.73±12.72 vs 28.51±8.36，P<0.05).Decreased levels of plasma IL-13 were found in NS patients with gross hematuria as compared to those with proteinuria(54.65±2.11 vs 68.91±4.34，P<0.05).Linear correlation analysis showed that levels of plasma IL-13 were negatively correlated with the levels of proteinuria and hematuria in NS (r＝-0.533，-0.708，respectively，P<0.05).
, 百拇医药
CONCLUSION IL-13 might be involved in molecular pathogenesis of primary nephrotic syndrome.Low plasma IL-13 level may play a role in the development of glomerulosclerosis in primary nephrotic syndrome.
Key words gene expression Interleukin-13 primary
nephrotic syndrome
白细胞介素-13(IL-13)是近年来受关注的一种抗炎性细胞因子。主要由活化Th2细胞分泌。其生物学效应主要是抑制单核/巨噬细胞的炎性细胞因子的产生，调节体内免疫功能。目前已证明致炎细胞因子参与肾病综合征(NS)发病，如IL-1、IL-6、IL-8及TNF等致炎因子的相互作用，刺激肾小球系膜细胞增生，细胞外基质合成增加、积聚，最终导致肾小球硬化。但作为抗炎性细胞因子IL-13在NS分子病理中起何种作用，国内外目前尚缺乏系统的研究资料。为此，我们应用ELISA法分析NS患者IL-13血浆水平，采用RT-PCR法检测NS患者外周血单个核细胞(PMBC)IL-13 mRNA表达量的变化。分析IL-13基因及蛋白质水平的改变，及其与NS的临床表现及肾脏病理类型的关系，为进一步研究NS的发病机制提供新的依据。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 正常对照组 10例(男5例，女5例)年龄为18～40(平均年龄29)岁，均为健康志愿者。
1.1.2 原发性肾病综合征组 16例(男8例，女8例)年龄为16～44(平均年龄30)岁。全部病例均行经皮肾穿刺活检，常规光镜、免疫荧光病理检查。肾活检前病程为20天～1年。全部病例尿蛋白均>3.5 g/24h，血清白蛋白<30 g/L，或伴有高脂血症及水肿。各项临床及生化项目检查均除外系统性红斑狼疮、紫癜性肾炎、糖尿病、肝硬化等继发性肾病综合征。肾脏病理类型分布：非IgA系膜增生性肾炎5例(其中4例为轻度增生，1例为中度增生)。局灶、节段性肾小球硬化(FSGS)5例，IgA肾病2例，膜性肾病3例(其中Ⅰ期2例，Ⅱ期1例)，膜增生性肾小球肾炎(MPGM)Ⅰ型1例。全部NS患者肾功能正常，平均血清肌酐为80.02±17.69 μmol/L。近期内无明显肺部感染或全身性感染，近2个月内未接受激素或免疫抑制剂治疗。
, 百拇医药
1.1.3 病例分组 NS组分为单纯蛋白尿组及血尿组。肾小球性血尿分肉眼血尿和镜下血尿。镜下血尿指尿红细胞大于5万/ml。
1.2 实验方法
1.2.1 标本采集 收集晨空腹肝素抗凝血5ml(10 U/ml)，分离血浆于-70℃保存待测。
1.2.2 外周血单个核细胞的收集 采用Ficoll密度梯度离心(3000 r/min离心30min)，获取外周血单个核细胞，细胞总量达1～5×106个。
1.2.3 细胞总RNA抽提 采用GIBCO BRL公司的TRIZOLRNA提取试剂盒抽提RNA。严格按试剂盒说明书操作，制备的细胞总RNA用紫外分光光度计测定读数A260/A280>1.8，同时经RNA甲醛变性电泳检测到28s和18sRNA两条带，其EB显色强度约为2∶1。调整RNA浓度为1 μg/μl后即作RT-PCR反应。
, 百拇医药
1.2.4 反转录多聚酶链反应(RT-PCR)及PCR产物半定量分析。
(1)参考人IL-13cDNA序列，进行特异性IL-13引物设计。引物1序列为5′GCT CTC ACTTGCCTTGGCGG 3′，引物2序列为3′TTCTTTGAAAAAGCGCTCCC 5′。由北京赛百盛生物工程公司合成，OPC方法纯化，PCR扩增产物长度为359 bp。为准确地检测IL-13 mRNA表达水平，我们选用β-actin mRNA作为内参照[1]。将每份标本cDNA与IL-13、β-actin两对引物置同一管内同时扩增，测量IL-13与β-actin特异扩增产物的产量，并计算IL-13 mRNA与β-actin mRNA的比值，即为IL-13 mRNA的相对表达水平。β-actin引物1序列为5′ ATT CGL TGA CCA TCA ATA AG 3′，引物2序列为5′ GGC GTG ATG TAG TTG CTT GG 3′，合成公司及纯化方法与IL-13引物相同，β-actin PCR扩增产物长度为260bp。
, 百拇医药
(2)cDNA第一链合成，反应体积为20μl。应用GIBCO BRL公司提供的superscriptTM preamplification system进行IL-13cDNA第一链合成。样品RNA 1.0μg，六聚体随机引物在superscript ⅡRT逆转录酶作用下，42℃反应50min产生IL-13cDNA及β-actin cDNA第一链。
(3)cDNA第二链合成体系，反应体积为50μl。分别加入人IL-13引物1和引物2各2μl及β-actin引物1及引物2各1μl，cDNA第一链反应物4 μl，Taq DNA酶2U及合适的PCR反应缓冲液、dNTP等进行反应。PCR扩增条件：94℃1min，55℃1min，72℃1min，反应30个循环。扩增产物用约1.5%琼脂糖凝胶电泳，稳压电泳5V/cm约1.5h，0.5 mg/L溴乙锭染色20min后，紫外灯观察、拍照。在UVP凝胶成像系统分析系统中扫描，并分析电泳带灰度。以特异性IL-13扩增带灰度与同管扩增的β-actin扩增带灰度之比，表示IL-13 mRNA表达水平。
, 百拇医药
(4)PCR产物特异性的监控 应用反转录试剂盒内对照RNA加入样品管内进行第一链合成，再进行PCR仪扩增30循环，PCR扩增产物同时出现523 bp扩增条带，证明无RNA酶污染。在反应中不加逆转录酶或人IL-13引物1或引物2，均不出现特异性的359 bp条带，以证明我们设计的引物是人IL-13 cDNA特异性引物，359 bp条带来源于人IL-13 mRNA而非GenomicDNA。
1.2.5 ELISA法检测血浆IL-13分泌水平 人IL-13 ELISA检测试剂盒购于Amershan life science公司，严格按照试剂盒说明书操作。将50 μl样本血浆加入IL-13单抗包被孔中→加入已标记生物素的IL-13多抗→形成双夹心抗原抗体复合物→加入酶标的生物素抗体→加入酶的底物发生显色反应→酶标仪450 nm读吸光度。描绘不同稀释浓度IL-13标准品曲线，从不同浓度的标准品曲线上计算样品IL-13含量。
1.3 统计方法 数据以均数±标准差(
±s)表示。组间差异采用t检验。两个变量间的相互关系应用直线相关分析。P<0.05为统计学差异明显。
, 百拇医药
2 结果
2.1 NS组与正常对照组IL-13血浆水平及PBMC IL-13 mRNA表达量变化 NS组较正常对照组IL-13血浆水平和IL-13 mRNA表达量均增高，P<0.05(见表1和附图)。
附图 NS组与正常对照组外周血单个核细胞中IL-13mRNA表达RT-PCR分析
M为分子量标准(GIBco公司 Cat.No.15615-016)，7、8为正常对照者样本，1、2、3、4、5、6、9、10为NS患者样本
表1 NS组与正常组IL-13血浆水平与IL-13mRNA表达量变化(±s)
, http://www.100md.com
组别
IL-13血浆水平(ng/L)
IL-13mRNA表达量(ratio)
n
IL-13
n
IL-13mRNA
正常组
10
28.51±8.36
10
0.45±0.12
, 百拇医药
NS组
16
55.73±12.72
16
1.28±0.13
与正常组比较P<0.05
2.2 单纯蛋白尿组与蛋白尿伴镜下血尿组、蛋白尿伴肉眼血尿组IL-13血浆水平 伴肉眼血尿组IL-13血浆水平较单纯蛋白尿组低(54.65±2.11 vs 68.91±4.34，P<0.05)(见表2)。
表2 单纯蛋白尿组与伴血尿组IL-13血浆水平比较(±s)
, 百拇医药
组 别
n
IL-13血浆水平(ng/L)
单纯蛋白尿组
4
68.91±4.34
镜下血尿组
4
62.03±3.21
肉眼血尿组
6
54.65±2.11
, 百拇医药
与单纯蛋白尿组相比P<0.05
2.3 IL-13血浆水平与NS患者蛋白尿和血尿程度的直线相关关系 血浆IL-13水平与蛋白尿和血尿呈负相关，r分别为-0.553和-0.708，P均小于0.05(见表3)。表3 IL-13血浆水平与蛋白尿和血尿程度直线相关分析
n
IL-13(ng/L)
r
P
蛋白尿
14
-0.553
<0.05
, http://www.100md.com
血 尿
14
-0.708
<0.01
r为直线相关系数
3 讨论
3.1 IL-13参与原发性肾病综合征的可能机制 国内外大量实验证明，致炎细胞因子参与NS发病。在致病因子的刺激下，细胞因子的网络平衡调节受到破坏，导致致炎因子不断增加，对肾组织的破坏作用加强，同时，系膜细胞能自分泌IL-1、IL-6、IL-8及TNF，促使细胞浸润、系膜细胞增生，细胞外基质积聚，导致肾小球由局灶增生发展到弥漫性增生，肾小球纤维化及硬化。近几年许多基础研究表明，IL-13的抗炎效应，主要是通过下调这些致炎因子的mRNA表达，同时增加IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)合成及上调IL-1ra mRNA表达，从而阻断IL-1多种致炎生物学活性[3]。Kimata等[3]发现，NS患者T细胞能自发地产生IL-13促使B细胞表达IL-13受体，诱导IgE及IgG4的产生。用抗IL-13抗体可特异性阻断此B细胞产生IgE及IgG4。Matsumoto等[4，5]发现，外源性IL-13(人重组IL-13)可抑制IgA肾病患者PBMC分泌IL-8及TNF，及抑制微小病变肾病患者T细胞产生肾小球通透因子(vascular permeability factor)，这些外源性IL-13的抑制作用均呈剂量依赖方式。本研究结果显示，NS患者IL-13血浆水平及PBMC IL-13 mRNA表达量同步增加。推测内源性IL-13分泌增加，可能是为了拮抗炎症介质产生的损害作用。目前许多研究证实，严重血尿的NS患者激素疗效欠佳，预后较差，大量蛋白尿是促进NS肾小球硬化及进行性肾脏损害的原因。本研究结果发现，IL-13血浆水平与NS患者蛋白尿和血尿程度呈负相关，且蛋白尿伴肉眼血尿组的NS患者IL-13血浆水平较单纯蛋白尿组明显降低。推测可能由于致炎因子的大量增加及IL-13抗炎因子分泌量的相对减少，肾组织炎症反应加重，导致蛋白尿、血尿，刺激系膜细胞及系膜基质增生，加速肾小球硬化的发展。
, 百拇医药
3.2 IL-13与NS肾脏病理改变的关系 文献报道[6]原发性FSGS病程隐匿，但进展相对较快，激素治疗的有效率不足10%，47.4%患者首次就诊即已进入慢性肾衰。实验研究亦发现[7]，系膜增生性肾小球肾炎伴肾小球局灶硬化性肾炎较非硬化肾组织IL-6mRNA表达量增高约47%，说明IL-6在局灶硬化性肾组织中的致炎作用明显增强。本组资料显示，6例伴肉眼血尿NS患者中3例肾组织病理为FSGS，且IL-13血浆水平降低明显。提示IL-13的抗炎作用降低，肾脏固有细胞及浸润炎症细胞分泌大量致炎因子作用于肾组织，促进肾小球硬化及间质纤维化的形成。因本研究病例少，故仍需扩大病例进一步观察。同时，我们正在利用原位杂交技术检测NS患者肾组织内IL-13 mRNA表达情况，以便对IL-13在NS的发病机制中的作用有进一步的了解。
综上所述，IL-13参与NS分子发病机制。抗炎因子IL-13的相对减少，在NS肾小球硬化中可能
, 百拇医药 起一定作用。
本研究由广东省重点科技攻关项目基金资助(编号：199556)
作者简介：中山医科大学博士研究生 张肇
参考文献
1 Ferrari N，Pfeffer IL，Fosetti F et al.An improved RT-PCR protocol for the quantitation of human retinoic acid receptor RNA.Experimental cell Research，1994，211：121
2 Minty A，Chalon P，Edrolg JM et al.Interleukin-13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and response.Nature，1993，362：248
, http://www.100md.com
3 Kimata H，Fujintoto M，Furnsho K.Involvement of interleukin(IL)-13，but not IL-4，in spontaneous IgE and IgG4 productio in nephrotic syndrome.Eur J immunol，1995，25：1497
4 Matsumoto K.Interleukin-13 in hibits cytokine secretion by blood monocytes from patients with IgA nephropathy.Nephron，1997，75：295
5 Matsumoto K，Ohi H，Kanmatsuse K.Interleukin-10 and Interleukin-13 synergize to inhibit vascular permeability factor release by peripheral blood mononuclear cells from patients with lipoid nephrosis.Nephron，1997，77：212
6 刘红，尹广，陈惠萍等.原发性局灶节段性肾小球硬化的临床病理及预后.肾脏病与透析肾移植杂志，1999，8(4)：333.
7 吴小川，易著文，赵维玲等.系膜增殖性肾炎患儿肾组织中白细胞介素-6信使核糖核酸表达的研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1997；6(3)：232
(1999-07-28收稿，1999-11-22修回), 百拇医药
单位：广东医学院附属医院肾脏病研究所 (广东湛江，524001)
关键词：原发性肾病综合征；白细胞介素-13；基因表达
摘 要 目的摘 要 目的：探讨成人原发性肾病综合征(NS)患者外周血单个核细胞(PBMC)中IL-13mRNA表达及IL-13血浆水平变化。 方法：选择10名健康正常对照者和16名NS患者。采用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，对NS患者PBMC中IL-13 mRNA表达量进行分析。同时应用IL-13特异的酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-13血浆水平。 结果：NS患者PBMC中IL-13 mRNA表达量及血浆IL-13水平均较正常对照组增高(IL-13 mRNA表达量为1.28±0.13 vs 0.45±0.12，P<0.05；IL-13血浆水平为55.73±12.72 vs 28.51±8.36，P<0.05)。蛋白尿伴肉眼血尿组NS患者的IL-13血浆水平较单纯蛋白尿组降低(68.91±4.34 vs 54.65±2.11，P<0.05)。直线相关分析表明，IL-13血浆水平与NS患者蛋白尿和血尿程度呈负相关，r分别为-0.553和-0.708，P均小于0.05。 结论：IL-13参与NS分子发病机制，IL-13蛋白质分泌水平相对下降，在NS患者肾小球硬化发生发展中可能起一定作用。
, 百拇医药
IL-13 GENE EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS ANDPLASMA IL 13 LEVELS IN ADULT PRIMARY NEPHROTIC SYNDROME.
Zhang Zhao，Chen Xiaowen，Jiang Liming，Wang Jianxun，Wu Ping，Huang Pingping.
Kidney Institute，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Guangdong，Zhanjiang，524001
OBJECTIVE To investigated the clinical significance of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) IL13 gene expression and plasma IL-13 levels in patients with primary nephrotic syndrome(NS).
, 百拇医药
METHODOLOGY 10 healthy volunteers and 16 patients with primary NS were included in this study.All patients underwent percutaneous renal biopsy with light microscopic and immunoflurecence microscopic examination.The expression of IL13 mRNA in PBMC was evaluated by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR).The levels of plasma IL-13 were determined using an IL-13 specific enzyme-linked imunosorbent assay(ELISA).
RESULTS The expression of IL-13 mRNA in PBMC and plasma levels of IL-13 in patients with primary NS were significantly higher than those of the healthy controls (1.28±0.13 vs 0.45+0.12，P<0.05，55.73±12.72 vs 28.51±8.36，P<0.05).Decreased levels of plasma IL-13 were found in NS patients with gross hematuria as compared to those with proteinuria(54.65±2.11 vs 68.91±4.34，P<0.05).Linear correlation analysis showed that levels of plasma IL-13 were negatively correlated with the levels of proteinuria and hematuria in NS (r＝-0.533，-0.708，respectively，P<0.05).
, 百拇医药
CONCLUSION IL-13 might be involved in molecular pathogenesis of primary nephrotic syndrome.Low plasma IL-13 level may play a role in the development of glomerulosclerosis in primary nephrotic syndrome.
Key words gene expression Interleukin-13 primary
nephrotic syndrome
白细胞介素-13(IL-13)是近年来受关注的一种抗炎性细胞因子。主要由活化Th2细胞分泌。其生物学效应主要是抑制单核/巨噬细胞的炎性细胞因子的产生，调节体内免疫功能。目前已证明致炎细胞因子参与肾病综合征(NS)发病，如IL-1、IL-6、IL-8及TNF等致炎因子的相互作用，刺激肾小球系膜细胞增生，细胞外基质合成增加、积聚，最终导致肾小球硬化。但作为抗炎性细胞因子IL-13在NS分子病理中起何种作用，国内外目前尚缺乏系统的研究资料。为此，我们应用ELISA法分析NS患者IL-13血浆水平，采用RT-PCR法检测NS患者外周血单个核细胞(PMBC)IL-13 mRNA表达量的变化。分析IL-13基因及蛋白质水平的改变，及其与NS的临床表现及肾脏病理类型的关系，为进一步研究NS的发病机制提供新的依据。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 正常对照组 10例(男5例，女5例)年龄为18～40(平均年龄29)岁，均为健康志愿者。
1.1.2 原发性肾病综合征组 16例(男8例，女8例)年龄为16～44(平均年龄30)岁。全部病例均行经皮肾穿刺活检，常规光镜、免疫荧光病理检查。肾活检前病程为20天～1年。全部病例尿蛋白均>3.5 g/24h，血清白蛋白<30 g/L，或伴有高脂血症及水肿。各项临床及生化项目检查均除外系统性红斑狼疮、紫癜性肾炎、糖尿病、肝硬化等继发性肾病综合征。肾脏病理类型分布：非IgA系膜增生性肾炎5例(其中4例为轻度增生，1例为中度增生)。局灶、节段性肾小球硬化(FSGS)5例，IgA肾病2例，膜性肾病3例(其中Ⅰ期2例，Ⅱ期1例)，膜增生性肾小球肾炎(MPGM)Ⅰ型1例。全部NS患者肾功能正常，平均血清肌酐为80.02±17.69 μmol/L。近期内无明显肺部感染或全身性感染，近2个月内未接受激素或免疫抑制剂治疗。
, 百拇医药
1.1.3 病例分组 NS组分为单纯蛋白尿组及血尿组。肾小球性血尿分肉眼血尿和镜下血尿。镜下血尿指尿红细胞大于5万/ml。
1.2 实验方法
1.2.1 标本采集 收集晨空腹肝素抗凝血5ml(10 U/ml)，分离血浆于-70℃保存待测。
1.2.2 外周血单个核细胞的收集 采用Ficoll密度梯度离心(3000 r/min离心30min)，获取外周血单个核细胞，细胞总量达1～5×106个。
1.2.3 细胞总RNA抽提 采用GIBCO BRL公司的TRIZOLRNA提取试剂盒抽提RNA。严格按试剂盒说明书操作，制备的细胞总RNA用紫外分光光度计测定读数A260/A280>1.8，同时经RNA甲醛变性电泳检测到28s和18sRNA两条带，其EB显色强度约为2∶1。调整RNA浓度为1 μg/μl后即作RT-PCR反应。
, 百拇医药
1.2.4 反转录多聚酶链反应(RT-PCR)及PCR产物半定量分析。
(1)参考人IL-13cDNA序列，进行特异性IL-13引物设计。引物1序列为5′GCT CTC ACTTGCCTTGGCGG 3′，引物2序列为3′TTCTTTGAAAAAGCGCTCCC 5′。由北京赛百盛生物工程公司合成，OPC方法纯化，PCR扩增产物长度为359 bp。为准确地检测IL-13 mRNA表达水平，我们选用β-actin mRNA作为内参照[1]。将每份标本cDNA与IL-13、β-actin两对引物置同一管内同时扩增，测量IL-13与β-actin特异扩增产物的产量，并计算IL-13 mRNA与β-actin mRNA的比值，即为IL-13 mRNA的相对表达水平。β-actin引物1序列为5′ ATT CGL TGA CCA TCA ATA AG 3′，引物2序列为5′ GGC GTG ATG TAG TTG CTT GG 3′，合成公司及纯化方法与IL-13引物相同，β-actin PCR扩增产物长度为260bp。
, 百拇医药
(2)cDNA第一链合成，反应体积为20μl。应用GIBCO BRL公司提供的superscriptTM preamplification system进行IL-13cDNA第一链合成。样品RNA 1.0μg，六聚体随机引物在superscript ⅡRT逆转录酶作用下，42℃反应50min产生IL-13cDNA及β-actin cDNA第一链。
(3)cDNA第二链合成体系，反应体积为50μl。分别加入人IL-13引物1和引物2各2μl及β-actin引物1及引物2各1μl，cDNA第一链反应物4 μl，Taq DNA酶2U及合适的PCR反应缓冲液、dNTP等进行反应。PCR扩增条件：94℃1min，55℃1min，72℃1min，反应30个循环。扩增产物用约1.5%琼脂糖凝胶电泳，稳压电泳5V/cm约1.5h，0.5 mg/L溴乙锭染色20min后，紫外灯观察、拍照。在UVP凝胶成像系统分析系统中扫描，并分析电泳带灰度。以特异性IL-13扩增带灰度与同管扩增的β-actin扩增带灰度之比，表示IL-13 mRNA表达水平。
, 百拇医药
(4)PCR产物特异性的监控 应用反转录试剂盒内对照RNA加入样品管内进行第一链合成，再进行PCR仪扩增30循环，PCR扩增产物同时出现523 bp扩增条带，证明无RNA酶污染。在反应中不加逆转录酶或人IL-13引物1或引物2，均不出现特异性的359 bp条带，以证明我们设计的引物是人IL-13 cDNA特异性引物，359 bp条带来源于人IL-13 mRNA而非GenomicDNA。
1.2.5 ELISA法检测血浆IL-13分泌水平 人IL-13 ELISA检测试剂盒购于Amershan life science公司，严格按照试剂盒说明书操作。将50 μl样本血浆加入IL-13单抗包被孔中→加入已标记生物素的IL-13多抗→形成双夹心抗原抗体复合物→加入酶标的生物素抗体→加入酶的底物发生显色反应→酶标仪450 nm读吸光度。描绘不同稀释浓度IL-13标准品曲线，从不同浓度的标准品曲线上计算样品IL-13含量。
1.3 统计方法 数据以均数±标准差(
±s)表示。组间差异采用t检验。两个变量间的相互关系应用直线相关分析。P<0.05为统计学差异明显。, 百拇医药
2 结果
2.1 NS组与正常对照组IL-13血浆水平及PBMC IL-13 mRNA表达量变化 NS组较正常对照组IL-13血浆水平和IL-13 mRNA表达量均增高，P<0.05(见表1和附图)。
附图 NS组与正常对照组外周血单个核细胞中IL-13mRNA表达RT-PCR分析
M为分子量标准(GIBco公司 Cat.No.15615-016)，7、8为正常对照者样本，1、2、3、4、5、6、9、10为NS患者样本
表1 NS组与正常组IL-13血浆水平与IL-13mRNA表达量变化(
±s), http://www.100md.com
组别
IL-13血浆水平(ng/L)
IL-13mRNA表达量(ratio)
n
IL-13
n
IL-13mRNA
正常组
10
28.51±8.36
10
0.45±0.12
, 百拇医药
NS组
16
55.73±12.72
16
1.28±0.13
与正常组比较P<0.05
2.2 单纯蛋白尿组与蛋白尿伴镜下血尿组、蛋白尿伴肉眼血尿组IL-13血浆水平 伴肉眼血尿组IL-13血浆水平较单纯蛋白尿组低(54.65±2.11 vs 68.91±4.34，P<0.05)(见表2)。
表2 单纯蛋白尿组与伴血尿组IL-13血浆水平比较(
±s), 百拇医药
组 别
n
IL-13血浆水平(ng/L)
单纯蛋白尿组
4
68.91±4.34
镜下血尿组
4
62.03±3.21
肉眼血尿组
6
54.65±2.11
, 百拇医药
与单纯蛋白尿组相比P<0.05
2.3 IL-13血浆水平与NS患者蛋白尿和血尿程度的直线相关关系 血浆IL-13水平与蛋白尿和血尿呈负相关，r分别为-0.553和-0.708，P均小于0.05(见表3)。表3 IL-13血浆水平与蛋白尿和血尿程度直线相关分析
n
IL-13(ng/L)
r
P
蛋白尿
14
-0.553
<0.05
, http://www.100md.com
血 尿
14
-0.708
<0.01
r为直线相关系数
3 讨论
3.1 IL-13参与原发性肾病综合征的可能机制 国内外大量实验证明，致炎细胞因子参与NS发病。在致病因子的刺激下，细胞因子的网络平衡调节受到破坏，导致致炎因子不断增加，对肾组织的破坏作用加强，同时，系膜细胞能自分泌IL-1、IL-6、IL-8及TNF，促使细胞浸润、系膜细胞增生，细胞外基质积聚，导致肾小球由局灶增生发展到弥漫性增生，肾小球纤维化及硬化。近几年许多基础研究表明，IL-13的抗炎效应，主要是通过下调这些致炎因子的mRNA表达，同时增加IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)合成及上调IL-1ra mRNA表达，从而阻断IL-1多种致炎生物学活性[3]。Kimata等[3]发现，NS患者T细胞能自发地产生IL-13促使B细胞表达IL-13受体，诱导IgE及IgG4的产生。用抗IL-13抗体可特异性阻断此B细胞产生IgE及IgG4。Matsumoto等[4，5]发现，外源性IL-13(人重组IL-13)可抑制IgA肾病患者PBMC分泌IL-8及TNF，及抑制微小病变肾病患者T细胞产生肾小球通透因子(vascular permeability factor)，这些外源性IL-13的抑制作用均呈剂量依赖方式。本研究结果显示，NS患者IL-13血浆水平及PBMC IL-13 mRNA表达量同步增加。推测内源性IL-13分泌增加，可能是为了拮抗炎症介质产生的损害作用。目前许多研究证实，严重血尿的NS患者激素疗效欠佳，预后较差，大量蛋白尿是促进NS肾小球硬化及进行性肾脏损害的原因。本研究结果发现，IL-13血浆水平与NS患者蛋白尿和血尿程度呈负相关，且蛋白尿伴肉眼血尿组的NS患者IL-13血浆水平较单纯蛋白尿组明显降低。推测可能由于致炎因子的大量增加及IL-13抗炎因子分泌量的相对减少，肾组织炎症反应加重，导致蛋白尿、血尿，刺激系膜细胞及系膜基质增生，加速肾小球硬化的发展。
, 百拇医药
3.2 IL-13与NS肾脏病理改变的关系 文献报道[6]原发性FSGS病程隐匿，但进展相对较快，激素治疗的有效率不足10%，47.4%患者首次就诊即已进入慢性肾衰。实验研究亦发现[7]，系膜增生性肾小球肾炎伴肾小球局灶硬化性肾炎较非硬化肾组织IL-6mRNA表达量增高约47%，说明IL-6在局灶硬化性肾组织中的致炎作用明显增强。本组资料显示，6例伴肉眼血尿NS患者中3例肾组织病理为FSGS，且IL-13血浆水平降低明显。提示IL-13的抗炎作用降低，肾脏固有细胞及浸润炎症细胞分泌大量致炎因子作用于肾组织，促进肾小球硬化及间质纤维化的形成。因本研究病例少，故仍需扩大病例进一步观察。同时，我们正在利用原位杂交技术检测NS患者肾组织内IL-13 mRNA表达情况，以便对IL-13在NS的发病机制中的作用有进一步的了解。
综上所述，IL-13参与NS分子发病机制。抗炎因子IL-13的相对减少，在NS肾小球硬化中可能
, 百拇医药 起一定作用。
本研究由广东省重点科技攻关项目基金资助(编号：199556)
作者简介：中山医科大学博士研究生 张肇
参考文献
1 Ferrari N，Pfeffer IL，Fosetti F et al.An improved RT-PCR protocol for the quantitation of human retinoic acid receptor RNA.Experimental cell Research，1994，211：121
2 Minty A，Chalon P，Edrolg JM et al.Interleukin-13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and response.Nature，1993，362：248
, http://www.100md.com
3 Kimata H，Fujintoto M，Furnsho K.Involvement of interleukin(IL)-13，but not IL-4，in spontaneous IgE and IgG4 productio in nephrotic syndrome.Eur J immunol，1995，25：1497
4 Matsumoto K.Interleukin-13 in hibits cytokine secretion by blood monocytes from patients with IgA nephropathy.Nephron，1997，75：295
5 Matsumoto K，Ohi H，Kanmatsuse K.Interleukin-10 and Interleukin-13 synergize to inhibit vascular permeability factor release by peripheral blood mononuclear cells from patients with lipoid nephrosis.Nephron，1997，77：212
6 刘红，尹广，陈惠萍等.原发性局灶节段性肾小球硬化的临床病理及预后.肾脏病与透析肾移植杂志，1999，8(4)：333.
7 吴小川，易著文，赵维玲等.系膜增殖性肾炎患儿肾组织中白细胞介素-6信使核糖核酸表达的研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1997；6(3)：232
(1999-07-28收稿，1999-11-22修回), 百拇医药