胚胎脊髓移植联合应用神经生长因子、尼莫地平对成鼠损伤脊髓功能的影响*
作者：邓少丽袁 涛 廖维宏
单位：邓少丽袁 涛廖维宏 第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第三研究室 重庆，400042
关键词：胚胎组织移植；神经生长因子；尼莫地平；脊髓损伤
第三军医大学学报990705 提 要 目的：研究胚胎脊髓移植联合应用神经生长因子(NGF)及尼莫地平(ND)对脊髓损伤的修复作用。方法：72只大鼠半切洞脊髓损伤后，随机分为单纯胚胎脊髓移植组，移植+NGF组，移植+NGF+ND组，并观察了脊髓血流量(SCBF)，运动诱发电位(MEP)及行为学变化。结果：NGF与ND可明显增加损伤移植部位的血流量，缩短MEP潜伏期，且显著提高后肢运动功能的Tarlov评分。结论：胚胎脊髓移植与NGF、ND联用，可促进大鼠损损伤脊髓功能恢复。
中图法分类号 R651.2；R826.64
, http://www.100md.com
The effects of fetal spinal cord transplantation, nerve growth factor and nimodipine on functional recovery of injured spinal cord in rats*
Den Shaoli, Yuan Tao, Liao Weihong
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400042)
Abstract Objective: To observe the therapeutic effects of fetal spinal cord transplantation (FSCT), nerve growth factor (NGF) and nimodipine (ND) on the functional recovery of injured spinal cord. Methods: 72 rats were inflicted with hemisectional cavitational injury of the spinal cord and the rats were divided into 2 groups; transplantation+NGF (TN) and transplantation+NFG+ND treated (TNN) groups. Spinal cord blood flow (SCBF), motor evoked potential (MEP) and the functions of the hind limbs were observed. Results: NGF and ND could increase SCBF, shorten the latency of MEP and improve the Tarlov score of the functions of the hind limbs. Conclusion: FSCT in association with NGF and ND can promote the recovery of the motor functions of the rats with hemisectional cavitational injury of the spinal cord.
, 百拇医药
Key words fetal tissue transplantation; nerve growth factor; nimodipine; spinal cord injury
一些低等动物在脊髓横切伤后植入胚胎脊髓，可使结构和功能得到较满意的修复，但哺乳动物脊髓结构的重建和功能的恢复还远不尽人意[1，2]。本实验在进行胚胎脊髓移植的同时，联合应用神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)及尼莫地平(Nimodipine,ND)，以进一步增强成鼠脊髓功能的恢复，并对功能恢复的血循环基础-血流量及脊髓诱发电位、行为学进行了观察，以说明损伤脊髓的功能恢复状况。
1 材料与方法
1.1 脊髓损伤模型的建立及移植程序
成年健康Wistar大鼠72只，雌雄不拘，体重200～260g，暴露脊髓腰膨大部位，于腰膨大中段左侧，用虹膜刀半切硬脊膜，并伸入脊髓内，毁损部分脊髓组织，用玻璃针头吸出已毁损的脊髓组织，制成直径2～3 mm的洞腔。然后在手术显微镜下仔细剥离出妊娠14 d孕鼠的胚胎脊髓，用玻璃针头小心将胚胎脊髓注入受体脊髓洞腔，用8个零的缝合线缝合硬脊膜，并缝合皮下组织、皮肤，术毕肌注青霉素。
, 百拇医药
1.2 实验分组
72只大鼠随机分为3组，每组24只：①单纯胚胎脊髓移植组(Tr)：建立损伤模型后直接移入胚胎脊髓；②移植+NGF组(TN)：脊髓损伤后植入浸泡有NGF液(2000 Bu/ml)的胚胎脊髓，并于蛛网膜下腔内插入导管，固定后于术后每天经导管给予NGF 500 Bu；③移植+NGF+ND组(TNN)：胚胎脊髓及NGF后植入方法同前，立即于腹腔随同葡萄糖液注射ND 0.5 mg/kg。
1.3 观察指标
手术后7、15、30、60 d观察。
1.3.1 脊髓血流量(Spinal cord blood flow,SCBF)测定
腹腔麻醉大鼠后，先行气管插管，然后将记录电极通过立体定位仪置入损伤移植部位，参考电极置于T8椎旁皮下。将气管导管连于呼吸机对动物行辅助呼吸，打开血流量测定仪，待描笔稳定后，经呼吸机吸入20%氢气1～3 min，记录完整氢清除曲线，经半对数转换，求出半衰期T1/2，按SCBF=0.693/T1/2×100算出血流量。
, 百拇医药
1.3.2 脊髓运动诱发电位(Motor evoked potential,MEP)的检查
应用三医大研制的SYD-4228型诱发电位仪，刺激频率4 Hz，波宽0.2 ms，强度40～60 V，计算机叠加200次。刺激电极正极置于颅骨皮层，负极置于头皮下，记录电极置于坐骨神经，参考电极插于椎旁肌。
1.3.3 行为学观察 采用改良Tarlov评分法对术后各组大鼠后肢运动功能进行评分，分为0～5分，分数越高，功能愈好。
1.4 统计学处理
数据以x±s表示，采用t检验。
2 结果
2.1 脊髓血流量的变化
, http://www.100md.com 脊髓半切洞损伤后，损伤部位血流量急剧下降，经过胚胎脊髓移植，血流量缓慢上升，在30 d时可基本达到正常脊髓血流量水平。移植+NGF组的脊髓血流量在术后两周明显高于同时期单纯移植组(P<0.05)。移植+NGF+ND组在术后两周内不仅明显高于单纯移植组(P<0.01)，在术后一周内还明显高于移植+NGF组(P<0.05)，见表1。
2.2 脊髓诱发电位的变化
本实验记录到的MEP为不规则的多相波，多由平滑的向下正波(P1波)和呈平台状的向上负波(N1波)组成。单纯移植组在术后MEP潜伏期无明显变化，至60 d时稍有缩短。移植+NGF组的P1波潜伏期在早期比单纯移植组明显缩短(P<0.05)，移植+NGF+ND组的潜伏期在早期比其它两组皆有明显缩短，见表2。
2.3 后肢运动功能Tarlov评分结果
, http://www.100md.com
脊髓损伤经胚胎脊髓移植后，受体动物的后肢运动功能逐渐恢复，到60 d时，90%动物已与正常动物无明显区别。移植+NGF组在移植后7、15 d，Tarlov评分明显高于单纯移植组(P<0.05)。移植+NGF+ND组不仅在术后7、15 d时明显高于单纯移植组(P<0.05)，且在7 d时明显高于移植+NGF组(P<0.05)。30 d后3组差异不显著，见表3。
表1 大鼠脊髓损伤移植部位SCBF变化
(x±s，qV/ml.min-1.100 g-1)
Tab 1 Changes of SCBF in injured spinal cord
of rats(x±s,qV/ml.min-1.100 g-1) Group
, 百拇医药
Time after injury (d)
7
15
30
60
Tr
50.82±13.69
59.29±16.07
70.24±6.18
70.28±5.72
TN
58.84±15.17△
, 百拇医药
65.48±12.60△
70.89±5.94
70.76±8.04
TNN
62.74±11.72△*
68.29±6.73△
72.48±9.60
71.61±7.09
△：P<0.05 vs Tr；*：P<0.05 vs TN
表2 各组MEP潜伏期比较(t/ms，x±s,n=6)
, 百拇医药
Tab 2 Comparison of MEP latency in different groups(t/ms，x±s,n=6) Group
15 d after injury
30 d after injury
60 d after injury
P1
N1
P1
N1
P1
, 百拇医药
N1
Tr
2.86±0.72
4.83±0.67
2.90±0.71
4.76±0.49
2.38±0.39
4.32±0.65
TN
2.27±0.92△
4.52±0.41
2.50±0.44△
, http://www.100md.com
4.59±0.34
2.32±0.40
4.18±0.38
TNN
2.01±0.19△
3.98±0.31△*
1.96±0.20△*
4.02±0.52△*
2.19±0.70
4.04±1.03
△：P<0.05 vs Tr；*：P<0.05 vs TN
, 百拇医药
表3 后肢运动功能评分表(x±s)
Tab 3 Score of motor function in hind limbs(x±s) Group
Time after injury (d)
7
15
30
60
Tr
1.50±0.41
2.92±0.61
4.02±0.32
, 百拇医药
4.50±0.42
TN
2.11±0.47△
3.98±0.21△
4.13±0.38
4.61±0.41
TNN
2.71±0.39△*
4.11±0.47△
4.31±0.42
4.73±0.39
, 百拇医药
△：P<0.05 vs Tr；*：P<0.05 vs TN
3 讨论
胚胎脊髓移植修复成鼠脊髓损伤，可使损伤脊髓的功能得到一定程度的恢复，但恢复的程度远不尽如人意。本实验在移植胚胎脊髓的同时，加入NGF和ND，结果发现，NGF、ND能加快损伤脊髓血流量的恢复，明显缩短大鼠损伤脊髓MEP潜伏期，并促进其运动功能的恢复，二者联用比单用NGF效果更佳。
在促进胚胎脊髓对损伤脊髓功能修复的作用上，NGF、ND主要作用于损伤早期，此时移植物与宿主结合并不紧密，建立的纤维联系也不多，此时的功能恢复很可能与胚胎脊髓，NGF提供的神经营养因子有关，神经营养因子抑制受损神经元逆行性溃变，ND有效拮抗钙内流，改善继发性损伤，有利神经元再生修复。胚胎脊髓、NGF和ND共同有效改善了损伤神经元的微环境[3]，有利轴突延伸，也可能促进了残存脊髓的代偿作用，使脊髓功能得到一定程度恢复。
, http://www.100md.com
在移植30 d后，移植物与宿主脊髓有机融合并促进宿主神经联系的部分重建，此时移植物作为连接损伤脊髓两端的“桥状结构”或“中继结构”可能是损伤脊髓功能恢复的重要原因[4]。
*全军医药卫生“九五”科技基金资助项目，No.96Z013
*This project was supported by the "Ninth five" obligatory budget of PLA,No.96Z013
**邓少丽，女，26岁，检验医师，硕士，现在检验科
***普通外科
参考文献
1 Nogradi A, Vrbora G. The use of embryonic spinal cord grafts to replace identified motoneuron pools depleted by a neurotoxic lectin,volkensin. Exp Neuro,1994,129(1):130
, http://www.100md.com
2 Pallini R, Fermandez G, Gangitano C, et al. Studies on embryonic transplants to the transected spinal cord of adult rats. J Neurosurg,1989,70(2):454
3 Nicholls J, Saunders J. Regeneration of immature mammalian spinal cord after injury. TINS,1996,19(6):229
4 李兵仓，廖维宏，李应玉.大鼠胚胎脊髓对成鼠急性脊髓损伤的组织修复作用.中华创伤杂志，1993，9(4)：199
收稿：1998-12-05；修回：1999-03-31, 百拇医药
单位：邓少丽袁 涛廖维宏 第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第三研究室 重庆，400042
关键词：胚胎组织移植；神经生长因子；尼莫地平；脊髓损伤
第三军医大学学报990705 提 要 目的：研究胚胎脊髓移植联合应用神经生长因子(NGF)及尼莫地平(ND)对脊髓损伤的修复作用。方法：72只大鼠半切洞脊髓损伤后，随机分为单纯胚胎脊髓移植组，移植+NGF组，移植+NGF+ND组，并观察了脊髓血流量(SCBF)，运动诱发电位(MEP)及行为学变化。结果：NGF与ND可明显增加损伤移植部位的血流量，缩短MEP潜伏期，且显著提高后肢运动功能的Tarlov评分。结论：胚胎脊髓移植与NGF、ND联用，可促进大鼠损损伤脊髓功能恢复。
中图法分类号 R651.2；R826.64
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The effects of fetal spinal cord transplantation, nerve growth factor and nimodipine on functional recovery of injured spinal cord in rats*
Den Shaoli, Yuan Tao, Liao Weihong
(Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400042)
Abstract Objective: To observe the therapeutic effects of fetal spinal cord transplantation (FSCT), nerve growth factor (NGF) and nimodipine (ND) on the functional recovery of injured spinal cord. Methods: 72 rats were inflicted with hemisectional cavitational injury of the spinal cord and the rats were divided into 2 groups; transplantation+NGF (TN) and transplantation+NFG+ND treated (TNN) groups. Spinal cord blood flow (SCBF), motor evoked potential (MEP) and the functions of the hind limbs were observed. Results: NGF and ND could increase SCBF, shorten the latency of MEP and improve the Tarlov score of the functions of the hind limbs. Conclusion: FSCT in association with NGF and ND can promote the recovery of the motor functions of the rats with hemisectional cavitational injury of the spinal cord.
, 百拇医药
Key words fetal tissue transplantation; nerve growth factor; nimodipine; spinal cord injury
一些低等动物在脊髓横切伤后植入胚胎脊髓，可使结构和功能得到较满意的修复，但哺乳动物脊髓结构的重建和功能的恢复还远不尽人意[1，2]。本实验在进行胚胎脊髓移植的同时，联合应用神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)及尼莫地平(Nimodipine,ND)，以进一步增强成鼠脊髓功能的恢复，并对功能恢复的血循环基础-血流量及脊髓诱发电位、行为学进行了观察，以说明损伤脊髓的功能恢复状况。
1 材料与方法
1.1 脊髓损伤模型的建立及移植程序
成年健康Wistar大鼠72只，雌雄不拘，体重200～260g，暴露脊髓腰膨大部位，于腰膨大中段左侧，用虹膜刀半切硬脊膜，并伸入脊髓内，毁损部分脊髓组织，用玻璃针头吸出已毁损的脊髓组织，制成直径2～3 mm的洞腔。然后在手术显微镜下仔细剥离出妊娠14 d孕鼠的胚胎脊髓，用玻璃针头小心将胚胎脊髓注入受体脊髓洞腔，用8个零的缝合线缝合硬脊膜，并缝合皮下组织、皮肤，术毕肌注青霉素。
, 百拇医药
1.2 实验分组
72只大鼠随机分为3组，每组24只：①单纯胚胎脊髓移植组(Tr)：建立损伤模型后直接移入胚胎脊髓；②移植+NGF组(TN)：脊髓损伤后植入浸泡有NGF液(2000 Bu/ml)的胚胎脊髓，并于蛛网膜下腔内插入导管，固定后于术后每天经导管给予NGF 500 Bu；③移植+NGF+ND组(TNN)：胚胎脊髓及NGF后植入方法同前，立即于腹腔随同葡萄糖液注射ND 0.5 mg/kg。
1.3 观察指标
手术后7、15、30、60 d观察。
1.3.1 脊髓血流量(Spinal cord blood flow,SCBF)测定
腹腔麻醉大鼠后，先行气管插管，然后将记录电极通过立体定位仪置入损伤移植部位，参考电极置于T8椎旁皮下。将气管导管连于呼吸机对动物行辅助呼吸，打开血流量测定仪，待描笔稳定后，经呼吸机吸入20%氢气1～3 min，记录完整氢清除曲线，经半对数转换，求出半衰期T1/2，按SCBF=0.693/T1/2×100算出血流量。
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1.3.2 脊髓运动诱发电位(Motor evoked potential,MEP)的检查
应用三医大研制的SYD-4228型诱发电位仪，刺激频率4 Hz，波宽0.2 ms，强度40～60 V，计算机叠加200次。刺激电极正极置于颅骨皮层，负极置于头皮下，记录电极置于坐骨神经，参考电极插于椎旁肌。
1.3.3 行为学观察 采用改良Tarlov评分法对术后各组大鼠后肢运动功能进行评分，分为0～5分，分数越高，功能愈好。
1.4 统计学处理
数据以x±s表示，采用t检验。
2 结果
2.1 脊髓血流量的变化
, http://www.100md.com 脊髓半切洞损伤后，损伤部位血流量急剧下降，经过胚胎脊髓移植，血流量缓慢上升，在30 d时可基本达到正常脊髓血流量水平。移植+NGF组的脊髓血流量在术后两周明显高于同时期单纯移植组(P<0.05)。移植+NGF+ND组在术后两周内不仅明显高于单纯移植组(P<0.01)，在术后一周内还明显高于移植+NGF组(P<0.05)，见表1。
2.2 脊髓诱发电位的变化
本实验记录到的MEP为不规则的多相波，多由平滑的向下正波(P1波)和呈平台状的向上负波(N1波)组成。单纯移植组在术后MEP潜伏期无明显变化，至60 d时稍有缩短。移植+NGF组的P1波潜伏期在早期比单纯移植组明显缩短(P<0.05)，移植+NGF+ND组的潜伏期在早期比其它两组皆有明显缩短，见表2。
2.3 后肢运动功能Tarlov评分结果
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脊髓损伤经胚胎脊髓移植后，受体动物的后肢运动功能逐渐恢复，到60 d时，90%动物已与正常动物无明显区别。移植+NGF组在移植后7、15 d，Tarlov评分明显高于单纯移植组(P<0.05)。移植+NGF+ND组不仅在术后7、15 d时明显高于单纯移植组(P<0.05)，且在7 d时明显高于移植+NGF组(P<0.05)。30 d后3组差异不显著，见表3。
表1 大鼠脊髓损伤移植部位SCBF变化
(x±s，qV/ml.min-1.100 g-1)
Tab 1 Changes of SCBF in injured spinal cord
of rats(x±s,qV/ml.min-1.100 g-1) Group
, 百拇医药
Time after injury (d)
7
15
30
60
Tr
50.82±13.69
59.29±16.07
70.24±6.18
70.28±5.72
TN
58.84±15.17△
, 百拇医药
65.48±12.60△
70.89±5.94
70.76±8.04
TNN
62.74±11.72△*
68.29±6.73△
72.48±9.60
71.61±7.09
△：P<0.05 vs Tr；*：P<0.05 vs TN
表2 各组MEP潜伏期比较(t/ms，x±s,n=6)
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Tab 2 Comparison of MEP latency in different groups(t/ms，x±s,n=6) Group
15 d after injury
30 d after injury
60 d after injury
P1
N1
P1
N1
P1
, 百拇医药
N1
Tr
2.86±0.72
4.83±0.67
2.90±0.71
4.76±0.49
2.38±0.39
4.32±0.65
TN
2.27±0.92△
4.52±0.41
2.50±0.44△
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4.59±0.34
2.32±0.40
4.18±0.38
TNN
2.01±0.19△
3.98±0.31△*
1.96±0.20△*
4.02±0.52△*
2.19±0.70
4.04±1.03
△：P<0.05 vs Tr；*：P<0.05 vs TN
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表3 后肢运动功能评分表(x±s)
Tab 3 Score of motor function in hind limbs(x±s) Group
Time after injury (d)
7
15
30
60
Tr
1.50±0.41
2.92±0.61
4.02±0.32
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4.50±0.42
TN
2.11±0.47△
3.98±0.21△
4.13±0.38
4.61±0.41
TNN
2.71±0.39△*
4.11±0.47△
4.31±0.42
4.73±0.39
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△：P<0.05 vs Tr；*：P<0.05 vs TN
3 讨论
胚胎脊髓移植修复成鼠脊髓损伤，可使损伤脊髓的功能得到一定程度的恢复，但恢复的程度远不尽如人意。本实验在移植胚胎脊髓的同时，加入NGF和ND，结果发现，NGF、ND能加快损伤脊髓血流量的恢复，明显缩短大鼠损伤脊髓MEP潜伏期，并促进其运动功能的恢复，二者联用比单用NGF效果更佳。
在促进胚胎脊髓对损伤脊髓功能修复的作用上，NGF、ND主要作用于损伤早期，此时移植物与宿主结合并不紧密，建立的纤维联系也不多，此时的功能恢复很可能与胚胎脊髓，NGF提供的神经营养因子有关，神经营养因子抑制受损神经元逆行性溃变，ND有效拮抗钙内流，改善继发性损伤，有利神经元再生修复。胚胎脊髓、NGF和ND共同有效改善了损伤神经元的微环境[3]，有利轴突延伸，也可能促进了残存脊髓的代偿作用，使脊髓功能得到一定程度恢复。
, http://www.100md.com
在移植30 d后，移植物与宿主脊髓有机融合并促进宿主神经联系的部分重建，此时移植物作为连接损伤脊髓两端的“桥状结构”或“中继结构”可能是损伤脊髓功能恢复的重要原因[4]。
*全军医药卫生“九五”科技基金资助项目，No.96Z013
*This project was supported by the "Ninth five" obligatory budget of PLA,No.96Z013
**邓少丽，女，26岁，检验医师，硕士，现在检验科
***普通外科
参考文献
1 Nogradi A, Vrbora G. The use of embryonic spinal cord grafts to replace identified motoneuron pools depleted by a neurotoxic lectin,volkensin. Exp Neuro,1994,129(1):130
, http://www.100md.com
2 Pallini R, Fermandez G, Gangitano C, et al. Studies on embryonic transplants to the transected spinal cord of adult rats. J Neurosurg,1989,70(2):454
3 Nicholls J, Saunders J. Regeneration of immature mammalian spinal cord after injury. TINS,1996,19(6):229
4 李兵仓，廖维宏，李应玉.大鼠胚胎脊髓对成鼠急性脊髓损伤的组织修复作用.中华创伤杂志，1993，9(4)：199
收稿：1998-12-05；修回：1999-03-31, 百拇医药