大鼠肝脏保存再灌注时氧自由基与细胞凋亡、Bcl-2蛋白表达的关系
作者：孙备 姜洪池 乔海泉
单位：150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普外科
关键词：
中华外科杂志990728 近年研究表明,细胞凋亡参与组织缺血再灌注损伤。本实验动态观察大鼠肝脏保存再灌注时氧自由基(·OH)与细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的变化,并探讨它们相互关系。
1.材料与方法:Wistar大鼠40只。以大鼠肝脏离体非循环灌注(IPRL)为肝脏保存再灌注模型[1]。根据肝脏保存时间将大鼠随机分为保存0小时(对照组)、6小时(6 h组)、12小时(12 h组)、18小时(18 h组)和24小时(24 h组)5个组，每组8只动物。·OH生成物二羟苯甲酸(DHBA)测定: 用HPLC紫外检测法测定肝脏再灌注第30分钟流出液和肝组织DHBA含量。Bcl-2蛋白表达检测: 采用免疫组化法。细胞凋亡检测:应用原位末端标记法(TUNEL)及电镜观察。
2.结果:(1)肝组织及流出液DHBA含量:随着保存时间延长,DHBA含量呈进行性升高,24 h组最高。(2)Bcl-2蛋白表达及TUNEL检测细胞凋亡: 高倍镜下，胞浆呈棕色着染者为Bcl-2蛋白表达阳性细胞。随机选择7～10个视野,计数1000个肝细胞中染色阳性细胞作为Bcl-2蛋白表达指数(BI)。凋亡指数(AI)计数方法同BI。随着保存时间延长,BI呈进行性降低,AI呈进行性升高,但保存18 h时,BI降至最低点,AI升至峰值。(3)相关分析: 保存18 h内,DHBA与AI呈显著正相关,与BI呈显著负相关(肝组织2,3-DHBA、2,5-DHBA与AI比较,r=0.81、0.88；与BI比较,r=-0.84、-0.89;流出液2,3-、2,5-DHBA与AI
比较,r=0.84、0.90；与BI比较,r=
-0.91、-0.85,P<0.05)。保存24小时内,AI与BI呈显著负相关(r=-0.95,P<0.01)。(4)电镜观察:对照组未见凋亡小体,6 h组偶见凋亡小体,12 h组、18 h组及24 h组中,均见凋亡小体,以18 h组最多。
3.讨论:本实验结果表明,大鼠肝脏不同保存时相·OH水平及AI随着保存时间延长而升高,且两者呈显著正相关(18 h内),BI与·OH水平及AI呈显著负相关。故提示·OH可能通过诱导肝细胞发生细胞凋亡机制而引起肝脏保存再灌注损伤，而Bcl-2蛋白可能通过减少·OH的产生来阻止细胞凋亡的发生。·OH诱导细胞凋亡的机制可能为[2]：(1)·OH直接损伤DNA；(2)·OH攻击蛋白质，导致具有酶活性的蛋白质功能丧失；(3)·OH通过影响核基因转录，改变细胞的表型特征；(4)·OH作用于细胞膜，诱发脂质过氧化，从而影响细胞的信号传递系统，激发有关的调控基因。
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 孙备,姜洪池.大鼠脂肪肝灌注保存的研究.中华实验外科杂志,1998,15:535-536.
2 孙备,姜洪池.细胞凋亡与缺血再灌注损伤的研究进展.国外医学外科学分册,1998,25:325-327.
(收稿：1998-08-03 修回：1999-03-20), 百拇医药
单位：150001 哈尔滨医科大学第一临床医学院普外科
关键词：
中华外科杂志990728 近年研究表明,细胞凋亡参与组织缺血再灌注损伤。本实验动态观察大鼠肝脏保存再灌注时氧自由基(·OH)与细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的变化,并探讨它们相互关系。
1.材料与方法:Wistar大鼠40只。以大鼠肝脏离体非循环灌注(IPRL)为肝脏保存再灌注模型[1]。根据肝脏保存时间将大鼠随机分为保存0小时(对照组)、6小时(6 h组)、12小时(12 h组)、18小时(18 h组)和24小时(24 h组)5个组，每组8只动物。·OH生成物二羟苯甲酸(DHBA)测定: 用HPLC紫外检测法测定肝脏再灌注第30分钟流出液和肝组织DHBA含量。Bcl-2蛋白表达检测: 采用免疫组化法。细胞凋亡检测:应用原位末端标记法(TUNEL)及电镜观察。
2.结果:(1)肝组织及流出液DHBA含量:随着保存时间延长,DHBA含量呈进行性升高,24 h组最高。(2)Bcl-2蛋白表达及TUNEL检测细胞凋亡: 高倍镜下，胞浆呈棕色着染者为Bcl-2蛋白表达阳性细胞。随机选择7～10个视野,计数1000个肝细胞中染色阳性细胞作为Bcl-2蛋白表达指数(BI)。凋亡指数(AI)计数方法同BI。随着保存时间延长,BI呈进行性降低,AI呈进行性升高,但保存18 h时,BI降至最低点,AI升至峰值。(3)相关分析: 保存18 h内,DHBA与AI呈显著正相关,与BI呈显著负相关(肝组织2,3-DHBA、2,5-DHBA与AI比较,r=0.81、0.88；与BI比较,r=-0.84、-0.89;流出液2,3-、2,5-DHBA与AI
比较,r=0.84、0.90；与BI比较,r=
-0.91、-0.85,P<0.05)。保存24小时内,AI与BI呈显著负相关(r=-0.95,P<0.01)。(4)电镜观察:对照组未见凋亡小体,6 h组偶见凋亡小体,12 h组、18 h组及24 h组中,均见凋亡小体,以18 h组最多。
3.讨论:本实验结果表明,大鼠肝脏不同保存时相·OH水平及AI随着保存时间延长而升高,且两者呈显著正相关(18 h内),BI与·OH水平及AI呈显著负相关。故提示·OH可能通过诱导肝细胞发生细胞凋亡机制而引起肝脏保存再灌注损伤，而Bcl-2蛋白可能通过减少·OH的产生来阻止细胞凋亡的发生。·OH诱导细胞凋亡的机制可能为[2]：(1)·OH直接损伤DNA；(2)·OH攻击蛋白质，导致具有酶活性的蛋白质功能丧失；(3)·OH通过影响核基因转录，改变细胞的表型特征；(4)·OH作用于细胞膜，诱发脂质过氧化，从而影响细胞的信号传递系统，激发有关的调控基因。
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
1 孙备,姜洪池.大鼠脂肪肝灌注保存的研究.中华实验外科杂志,1998,15:535-536.
2 孙备,姜洪池.细胞凋亡与缺血再灌注损伤的研究进展.国外医学外科学分册,1998,25:325-327.
(收稿：1998-08-03 修回：1999-03-20), 百拇医药