母乳中肿瘤坏死因子-α对新生儿保护性作用的探讨
作者：夏正坤 陈荣华 刘光陵 高远赋
单位：夏正坤 刘光陵 高远赋 南京军区南京总医院儿科，邮政编码：210029；陈荣华 南京医科大学儿科系
关键词：母乳 婴儿，新生 单个核细胞 肿瘤坏死因子
江苏医药990705 摘要 动态观察母乳中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及新生儿脐血单个核细胞形成TNF-α的水平变化，探讨母乳中TNF-α对受体儿的临床意义。结果：(1)母乳中具有生物活性的TNF-α存在，而且有一定含量，以初乳为高。(2)早产儿、足月儿脐血单个核细胞形成TNF-α比对照组低。由于母乳中有一定量TNF-α，若及早母乳喂养，受体婴儿获得足够量的TNF-α，有利于预防感染、调节免疫功能的作用。
母乳中存在大量的生物活性物质，发挥对新生儿抗感染、免疫调节的作用。近年来发现母乳中存在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，本文着重研究母乳中TNF-α的生物活性及对受体婴儿的临床意义。
, 百拇医药
对象与方法
一、对象
1.母乳的采集 于产后2～5天收集母初乳80份(其中早产儿30份，足月儿50份)，产后7～30天及1个月以上分别收集相应的产妇过渡乳与成熟乳各30份。在4℃4000g离心10分钟去除脂质，吸取乳清冻存于-20℃冰箱中待检。
2.牛乳的采集 收集南京卫岗乳品厂生产的市售牛乳，每天每瓶留取10ml，计30份。其标本处理的方法同母乳。
3.80名新生儿脐血在胎盘娩出后5分钟内取脐带混合血10ml，加入无菌处理的抗凝管中(肝素20U/ml)，置4℃冰箱。80例新生儿分为两组：(1)50例足月儿，男24例，女26例，孕期37～42周。(2)30例早产儿，男10例，女20例，孕期34～37周。
30名对照组为健康志愿献血员的外周血。
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二、方法
1.脐血或外周血单个核细胞悬液的制备
将脐血或外周血用Hank?s液等体积稀释，取淋巴细胞分离液3ml置离心管中，然后将稀释的血液铺于分离液面上，2000转/分离心30分钟，用滴管吸出界面层的细胞，于所得的细胞中用足量Hank?s液充分混匀，1000转/分离心5分钟去上清，以同样的操作用Hank?s液和RPMI1640液各洗一次，然后进行细胞计数，并用锥蓝排除试验观察细胞活力，要求活细胞数大于95%，最后调整细胞浓度为5×106/ml。
2.TNF-α的诱生
取上述脐血或外周血单个核细胞悬液及5μg/ml脂多糖加到96孔细胞培养板中，在37℃5%CO2培养箱内培养18～20小时后，收集上清置-20℃待检。
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3.测定方法
(1)生物活性方法 取终浓度为2×105/ml L929细胞加到细胞培养板上，待贴壁后去上清，加入不同稀释度的乳清。乳清标本中加入等量的重组TNF-α单克隆抗体及标准品，同时加入终浓度为2μg/ml放线菌素D，在37℃5%CO2培养箱中培养18～20小时后去上清，加入结晶紫染色，干燥后在酶联读数仪上测定OD值(参考波长570nm)，将标本与标准品OD值进行比较。
(2)双抗体夹心法测定TNF-α的含量 用TNF-α单克隆抗体包板，10%小牛血清封闭、洗涤后加入不同浓度的标准品与待检标本，室温放置1小时，再与兔抗TNF-α及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG分别反应1小时，再加入底物邻苯二胺，用2NH2SO4终止反应，在酶联读数仪上读取OD值(参考波长490nm)，结果可从标准曲线上得知。本实验试剂盒购自北京军事医学科学院。
, 百拇医药
结 果
一、母乳中TNF-α生物活性作用
母乳与L929细胞共同孵育后，发现母乳中TNF-α对L929细胞有细胞毒性作用，但在乳清标本中加入等量的重组TNF-α单克隆抗体后，可阻断对靶细胞的作用。说明母乳中TNF-α具有生物活性作用。
二、母初乳、过渡乳、成熟乳间TNF-α的比较
母初乳中TNF-α略高于过渡乳与成熟乳，而过渡乳与成熟乳之间无差异，见表1。
表1 初乳、过渡乳及成熟乳TNF-α比较 组别
例数
TNF-α(ng/ml)
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初 乳
50
0.33±0.14
过渡乳
30
0.17±0.09*
成熟乳
30
0.16±0.09△＃
F＝31.9 P<0.01
注：*初乳与过渡乳比较，P<0.01；△初乳与成熟乳比较，P<0.01；＃过渡乳与成熟乳比较，P>0.05
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三、早产儿与足月儿母初乳间TNF-α比较
早产儿与足月儿母初乳间TNF-α无差异，见表2。表2 早产儿与足月儿母初乳TNF-α比较 组别
例数
TNF-α(ng/ml)
t
P
早产儿
30
0.32±0.10
0.226
>0.05
, 百拇医药 足月儿
50
0.33±0.16
四、早产儿、足月儿脐血单个核细胞及对照组TNF-α之间的比较
早产儿、足月儿脐血单个核细胞形成TNF-α的能力明显低于对照组，而早产儿脐血形成TNF-α的能力低于足月儿，见表3。表3 早产儿、足月儿脐血单个核细胞内与对照组TNF-α间比较 组别
例数
TNF-α(ng/ml)
早产儿
30
0.45±0.24*
, 百拇医药
足月儿
50
0.86±0.39△＃
对照组
30
1.80±0.58
注：F＝81.41 P<0.01
*早产儿与对照组间比较，P<0.01；△足月儿与对照组间比较，P<0.01；＃早产儿与足月儿间比较，P<0.01讨 论
母乳中的多种生物活性物质具有重要的抗感染作用，并参与免疫调节。通过母乳喂养可起到预防新生儿感染的作用。
, http://www.100md.com 本文通过生物活性方法发现母乳对L929细胞有细胞毒性作用。而在母乳中加入TNF-α单克隆抗体后有阻断其作用，证明母乳中具有生物活性的TNF-α存在。但至今对母乳中?TNF-α的分泌机理尚不清楚。Kavle[1]发现TNF-α对上皮细胞受体起正调节作用，从而有利于产妇在分娩后分泌乳汁，适应婴儿哺乳，在此特定条件下乳腺细胞自分泌TNF-α，或是母乳中某因子直接刺激母乳中单个核细胞分泌TNF-α[2]。本文对不同时期的母乳中TNF-α含量测定，发现初乳含量高于过渡乳与成熟乳，这可能与TNF-α形成受多种因素调节有关(如干扰素、前列腺素、皮质激素等)。在产后几天内激活TNF-α产生的因子占主导作用导致初乳?TNF-α增高，而后激活与抑制作用达到平衡，从而使得过渡乳与成熟乳TNF-α形成趋向相对稳定[3，4]。
通过双抗体夹心法对母乳标本动态检测，发现不同时期母乳均有一定量的TNF-α。以母初乳中含量高，而早产儿与足月儿母乳TNF-α含量无差异，市售的牛乳未检测到TNF-α。同时对早产儿、足月儿脐血单个核细胞诱生的TNF-α分别与对照组比较，前两者均明显低于对照组，而早产儿脐血单个核细胞诱生的TNF-α比足月儿低，从而认为新生儿(特别是早产儿)不成熟的单个核细胞形成较低的TNF-α，可能是新生儿对感染特别易感及免疫功能低下的原因之一。动物实验证明，使用含有一定量的TNF-α乳制品哺乳后，TNF-α可直接刺激于肠道粘膜细胞，可致T淋巴细胞亚群功能增加[5]。故母乳中的TNF-α则足够对受体婴儿免疫系统发挥生物活性作用。从而及早母乳喂养，受体婴儿可获得一定量的TNF-α，对预防感染、免疫调节、免疫监视起到重要作用，尤其对早产儿更为有利。
, 百拇医药
参考文献
[1] Kavle D, et al. J Immunol 1988；140：3086.
[2] Laurie B, et al. J Immunol 1989；143：2236.
[3] Aggarwal BB, et al. Nature 1985；318：665.
[4] Sterner-Kock A, et al. Immunol 1996；87：454.
[5] Jain L, et al. Arch Dis Child 1989；64：930.
(1998年5月29日收稿 同年11月21日修回), http://www.100md.com
单位：夏正坤 刘光陵 高远赋 南京军区南京总医院儿科，邮政编码：210029；陈荣华 南京医科大学儿科系
关键词：母乳 婴儿，新生 单个核细胞 肿瘤坏死因子
江苏医药990705 摘要 动态观察母乳中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及新生儿脐血单个核细胞形成TNF-α的水平变化，探讨母乳中TNF-α对受体儿的临床意义。结果：(1)母乳中具有生物活性的TNF-α存在，而且有一定含量，以初乳为高。(2)早产儿、足月儿脐血单个核细胞形成TNF-α比对照组低。由于母乳中有一定量TNF-α，若及早母乳喂养，受体婴儿获得足够量的TNF-α，有利于预防感染、调节免疫功能的作用。
母乳中存在大量的生物活性物质，发挥对新生儿抗感染、免疫调节的作用。近年来发现母乳中存在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，本文着重研究母乳中TNF-α的生物活性及对受体婴儿的临床意义。
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对象与方法
一、对象
1.母乳的采集 于产后2～5天收集母初乳80份(其中早产儿30份，足月儿50份)，产后7～30天及1个月以上分别收集相应的产妇过渡乳与成熟乳各30份。在4℃4000g离心10分钟去除脂质，吸取乳清冻存于-20℃冰箱中待检。
2.牛乳的采集 收集南京卫岗乳品厂生产的市售牛乳，每天每瓶留取10ml，计30份。其标本处理的方法同母乳。
3.80名新生儿脐血在胎盘娩出后5分钟内取脐带混合血10ml，加入无菌处理的抗凝管中(肝素20U/ml)，置4℃冰箱。80例新生儿分为两组：(1)50例足月儿，男24例，女26例，孕期37～42周。(2)30例早产儿，男10例，女20例，孕期34～37周。
30名对照组为健康志愿献血员的外周血。
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二、方法
1.脐血或外周血单个核细胞悬液的制备
将脐血或外周血用Hank?s液等体积稀释，取淋巴细胞分离液3ml置离心管中，然后将稀释的血液铺于分离液面上，2000转/分离心30分钟，用滴管吸出界面层的细胞，于所得的细胞中用足量Hank?s液充分混匀，1000转/分离心5分钟去上清，以同样的操作用Hank?s液和RPMI1640液各洗一次，然后进行细胞计数，并用锥蓝排除试验观察细胞活力，要求活细胞数大于95%，最后调整细胞浓度为5×106/ml。
2.TNF-α的诱生
取上述脐血或外周血单个核细胞悬液及5μg/ml脂多糖加到96孔细胞培养板中，在37℃5%CO2培养箱内培养18～20小时后，收集上清置-20℃待检。
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3.测定方法
(1)生物活性方法 取终浓度为2×105/ml L929细胞加到细胞培养板上，待贴壁后去上清，加入不同稀释度的乳清。乳清标本中加入等量的重组TNF-α单克隆抗体及标准品，同时加入终浓度为2μg/ml放线菌素D，在37℃5%CO2培养箱中培养18～20小时后去上清，加入结晶紫染色，干燥后在酶联读数仪上测定OD值(参考波长570nm)，将标本与标准品OD值进行比较。
(2)双抗体夹心法测定TNF-α的含量 用TNF-α单克隆抗体包板，10%小牛血清封闭、洗涤后加入不同浓度的标准品与待检标本，室温放置1小时，再与兔抗TNF-α及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG分别反应1小时，再加入底物邻苯二胺，用2NH2SO4终止反应，在酶联读数仪上读取OD值(参考波长490nm)，结果可从标准曲线上得知。本实验试剂盒购自北京军事医学科学院。
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结 果
一、母乳中TNF-α生物活性作用
母乳与L929细胞共同孵育后，发现母乳中TNF-α对L929细胞有细胞毒性作用，但在乳清标本中加入等量的重组TNF-α单克隆抗体后，可阻断对靶细胞的作用。说明母乳中TNF-α具有生物活性作用。
二、母初乳、过渡乳、成熟乳间TNF-α的比较
母初乳中TNF-α略高于过渡乳与成熟乳，而过渡乳与成熟乳之间无差异，见表1。
表1 初乳、过渡乳及成熟乳TNF-α比较 组别
例数
TNF-α(ng/ml)
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初 乳
50
0.33±0.14
过渡乳
30
0.17±0.09*
成熟乳
30
0.16±0.09△＃
F＝31.9 P<0.01
注：*初乳与过渡乳比较，P<0.01；△初乳与成熟乳比较，P<0.01；＃过渡乳与成熟乳比较，P>0.05
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三、早产儿与足月儿母初乳间TNF-α比较
早产儿与足月儿母初乳间TNF-α无差异，见表2。表2 早产儿与足月儿母初乳TNF-α比较 组别
例数
TNF-α(ng/ml)
t
P
早产儿
30
0.32±0.10
0.226
>0.05
, 百拇医药 足月儿
50
0.33±0.16
四、早产儿、足月儿脐血单个核细胞及对照组TNF-α之间的比较
早产儿、足月儿脐血单个核细胞形成TNF-α的能力明显低于对照组，而早产儿脐血形成TNF-α的能力低于足月儿，见表3。表3 早产儿、足月儿脐血单个核细胞内与对照组TNF-α间比较 组别
例数
TNF-α(ng/ml)
早产儿
30
0.45±0.24*
, 百拇医药
足月儿
50
0.86±0.39△＃
对照组
30
1.80±0.58
注：F＝81.41 P<0.01
*早产儿与对照组间比较，P<0.01；△足月儿与对照组间比较，P<0.01；＃早产儿与足月儿间比较，P<0.01讨 论
母乳中的多种生物活性物质具有重要的抗感染作用，并参与免疫调节。通过母乳喂养可起到预防新生儿感染的作用。
, http://www.100md.com 本文通过生物活性方法发现母乳对L929细胞有细胞毒性作用。而在母乳中加入TNF-α单克隆抗体后有阻断其作用，证明母乳中具有生物活性的TNF-α存在。但至今对母乳中?TNF-α的分泌机理尚不清楚。Kavle[1]发现TNF-α对上皮细胞受体起正调节作用，从而有利于产妇在分娩后分泌乳汁，适应婴儿哺乳，在此特定条件下乳腺细胞自分泌TNF-α，或是母乳中某因子直接刺激母乳中单个核细胞分泌TNF-α[2]。本文对不同时期的母乳中TNF-α含量测定，发现初乳含量高于过渡乳与成熟乳，这可能与TNF-α形成受多种因素调节有关(如干扰素、前列腺素、皮质激素等)。在产后几天内激活TNF-α产生的因子占主导作用导致初乳?TNF-α增高，而后激活与抑制作用达到平衡，从而使得过渡乳与成熟乳TNF-α形成趋向相对稳定[3，4]。
通过双抗体夹心法对母乳标本动态检测，发现不同时期母乳均有一定量的TNF-α。以母初乳中含量高，而早产儿与足月儿母乳TNF-α含量无差异，市售的牛乳未检测到TNF-α。同时对早产儿、足月儿脐血单个核细胞诱生的TNF-α分别与对照组比较，前两者均明显低于对照组，而早产儿脐血单个核细胞诱生的TNF-α比足月儿低，从而认为新生儿(特别是早产儿)不成熟的单个核细胞形成较低的TNF-α，可能是新生儿对感染特别易感及免疫功能低下的原因之一。动物实验证明，使用含有一定量的TNF-α乳制品哺乳后，TNF-α可直接刺激于肠道粘膜细胞，可致T淋巴细胞亚群功能增加[5]。故母乳中的TNF-α则足够对受体婴儿免疫系统发挥生物活性作用。从而及早母乳喂养，受体婴儿可获得一定量的TNF-α，对预防感染、免疫调节、免疫监视起到重要作用，尤其对早产儿更为有利。
, 百拇医药
参考文献
[1] Kavle D, et al. J Immunol 1988；140：3086.
[2] Laurie B, et al. J Immunol 1989；143：2236.
[3] Aggarwal BB, et al. Nature 1985；318：665.
[4] Sterner-Kock A, et al. Immunol 1996；87：454.
[5] Jain L, et al. Arch Dis Child 1989；64：930.
(1998年5月29日收稿 同年11月21日修回), http://www.100md.com