黄芩素诱导体抑制酪氨酸酶作用的动力学研究
作者:方 冶*
单位:汕头大学医学院化学教研室 515031
关键词:黄芩素诱导体(SD);酪氨酸酶抑制作用;动力学
中草药990726 摘 要 黄芩素诱导体对酪氨酸酶的抑制作用是竞争性抑制,其ki为0.058 mmol/L。对
多羟基黄酮化合物是植物界分布最广泛的黄酮类化合物,近年来对其抗自由基、抗氧化、抗癌、防癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗糖尿病并发病等多种生物活性及药理作用已有较多研究[1],对酪氨酸酶的抑制作用也有了一些报道[2],但未见有其抑制作用机制的报道。黄芩素诱导体(SD)也是多羟基黄酮化合物,已研究证实具显著的紫外吸收、抑制酪氨酸酶和清除
1 材料
UV-120紫外可见分光光度计(日本岛津),酪氨酸酶(EC 1.1、4.1、8.1,Sigma),左旋多巴(Sigma),黄芩素诱导体(从市售黄芩提取,重结晶法纯化后为淡黄褐色粉末);其它试剂均为AR级。
SD、酪氨酸酶和左旋多巴分别以pH6.8的0.025 mol/L磷酸盐缓冲液配成所需浓度溶液。
2 方法
2.1 反应速度测定:在试管中先加入一定量的SD溶液和左旋多巴溶液,再用缓冲溶液补充至混合液总体积为4.50 mL,25℃温育5 min后,加入0.50 mL酪氨酸酶溶液(0.10 g/L),立即用分光光度计在475 nm处测吸光度(A)。连续记录10 min,取0~3.0 min间的吸光度平均变化率作为初始反应速度。
2.2 抑制类型及动力学参数的确定:分别作Lineweaver-Burk曲线及Dixon曲线,判别抑制类型、确定米氏常数(km)及抑制常数(ki)的值。
3 结果和讨论
3.1 SD抑制酪氨酸酶的动力学考察:在不同浓度的左旋多巴底液中,分别测定不同浓度的SD抑制酪氨酸酶的反应初速度,作Lineweaver-Burk曲线及Dixon曲线。结果见表1及图1、2。
表1 SD和多巴的浓度对反应初速度的影响(n=3) C(mmol/L)
S(mmol/L)
△A/t
(△A/t)-1
0
0.20
0.0334
29.9
0.25
0.0404
24.7
0.33
0.0499
20.0
0.50
0.0628
15.9
1.00
0.0952
10.5
2.00
0.125
8.0
0.10
0.20
0.0183
54.6
0.25
0.0212
47.2
0.33
0.0278
36.0
0.50
0.0383
25.8
1.00
0.0621
16.1
2.00
0.0986
10.1
0.20
0.20
0.0116
86.2
0.25
0.0134
74.6
0.33
0.0186
53.7
0.50
0.0273
37.0
1.00
0.0436
22.9
2.00
0.0690
14.5
其中△A/t表示反应初速度,S和C分别为底物左旋多巴和抑制剂SD在反应介质中的浓度。
1-无抑制剂 2-0.10 mmol/L SD 3-0.20 mmol/L SD
图1 SD抑制酪氨酸酶的Lineweaver-Burk曲线(n=3)
1-0.25 mmol/L多巴 2-0.33 mmol/L多巴 3-0.50 mmol/L多巴 4-1.00 mmol/L多巴
图2 SD抑制酪氨酸酶的Dixon曲线(n=3)
从图1可看出,SD对酪氨酸酶的抑制是竞争性的;从图1、2上的横轴截距可分别得出km值和ki值[4],结果见表2。
表2 不同浓度SD抑制酪氨酸酶的动力学参数
C(mmol/L)
0
0.10
0.20
km(mmol/L)
0.787
1.45
2.63
ki(mmol/L)
0.058
3.2 SD抑制酪氨酸酶的机制探讨:酪氨酸酶催化酪氨酸氧化为多巴并继而氧化为多巴醌,最终形成黑色素(皮肤色素)。其反应过程可简示如下:
在此过程中,酪氨酸酶可提供
清除
酪氨酸酶普遍存在于人和动植物体内,是黑色素合成的关键酶,色素障碍性疾病及恶性黑色素瘤的发生和治疗也与酪氨酸酶有直接关系[7]。SD抑制酪氨酸酶机制的探讨,对色素障碍性疾病及恶性黑色素瘤的防治将有一定的指导意义。 参考文献
1 刘诗平,等.中草药,1991,22(4):182
2 丁维功,等.中国医学化学进展.上海:百家出版社,1996:72
3 方 冶.中草药,1998,29(9):596
4 陈惠黎,等.分子酶学.北京:人民卫生出版社,1983:233
5 王 夔,等.生命科学中的微量元素.北京:中国计量出版社,1989:535
6 Sanchez-Ferrer A,et al. Biochem Biophy Acta,1995,1247:1
7 季文才.生命的化学,1991,11(1):3
收稿日期:1999-02-12(方 冶*)
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