新维甲类化合物5-4A抗癌细胞侵袭作用及其机理研究
作者：曹西华 韩锐
单位：100050 北京，中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所
关键词：维甲类；药物筛选试验，抗肿瘤
中华医学杂志990822 【摘要】 目的 为探讨新维甲类化合物5-4A对癌细胞侵袭能力的影响及其作用机理。方法 利用体外重组基底膜侵袭试验，观察癌细胞的侵袭能力；应用生物化学及形态学方法，检查细胞的恶性表型。结果 5-4A在4×10-5 mol/L浓度时，对黑色素瘤高转移株B16BL6细胞膜侵袭具有显著的抑制作用,抑制率为33.9%。结论 5-4A具有抗B16BL6膜侵袭作用。其作用与其抑制肿瘤细胞的运动能力、Ⅳ型胶原酶活力以及改变肿瘤细胞的恶性表型有关。
Inhibition of tumor invasion by new retinoid，5-4A，and its mechanism of the action
, http://www.100md.com
CAO Xihua HAN Rui
(Institute of Material Medical,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical University，Beijing 100050)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of 5-4A on the invasion of B16BL6 and to explore its mechanisms of action.Methods The invasion of B16BL6 was studied using the reconstituted basement membrane invasion assay.Results The phenotype of B16BL6 cells was obviously suppressed by 5-4A at the concentration of 4×10-5 mol/L，and the inhibitory rate was 33.9%.Conclusion 5-4A can inhibit invasion of B16BL6 cells and its mechanisms of action might be associated with the suppression of movement of tumor cells，decrease in the expression of type Ⅳ collagenase，and reversion of the phenotype of B16BL6 cells.
, 百拇医药
【Key words】 Retinoid Drug screening assays，antitumor
近年研究发现,维甲类化合物维甲酸对癌细胞的人工基底膜侵袭,实验性肺转移有一定的抑制作用[1]。在对新合成的维甲类化合物筛选中我们发现,5-4A具有抗侵袭作用,但毒性远低于维甲酸。为此，我们进一步对其作用机理进行了研究。
材料与方法
一、材料
药物： 5-4A，相对分子质量为530，本所合成室提供。RPMI 1640培养基(DMEM)为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供。噻唑蓝(MTT) 为美国Sigma产品；小鼠黑色素瘤B16BL6细胞,由美国Fidler教授赠送。Matrigel购自美国；纤维粘连蛋白购自美国Promega公司；侵袭小室(transwell chamber)为美国Costar公司产品；Membrane filter为美国Portic公司产品。
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二、方法
1.细胞学检查[2]：将药物作用一定时间的B16BL6细胞，相差显微镜下观察或用Wright-Giemsa染色12分钟，油镜下观察细胞形态学变化。
2.电镜样品的制备[3]：将药物作用一定时间的细胞和对照细胞在4℃条件下，1000 r/min,离心15分钟，弃上清，用2.5%戊二醛将细胞沉淀固定12小时以上。经0.1 mol/L PBS冲洗后，用四氧化锇及15%亚铁氢化钾的混合液固定1小时以上。用环氧树脂812浸泡，包埋，聚合后，组织块经超薄切片，在Hitachi 800型电镜下观察。
3.MTT反应测定肿瘤细胞成活率[4]：按本室常规方法进行。
4.B16BL6细胞对重组基底膜的侵袭及运动试验[5]：在PVPF滤膜上室腔面铺0.05% Matrigel 30 μl，下室腔面铺fibronectin 10 μg，风干。用指甲油将膜固定于Chamber底面上。以0.25%EDTA的PBS消化B16BL6，将2×105个细胞加于上室腔，同时加药；下室腔加0.1% BSA的RPMI 1640，置CO2培养箱，37 ℃温孵6小时。取膜，HE染色，在显微镜(400倍)下观察5个视野细胞数，结果以抑制率来表示;运动试验与侵袭试验方法相似,只是PVPF膜上不需铺Matrigel。抑制率＝(对照组细胞数-加药组细胞数)/对照组细胞数×100%
, 百拇医药
5.Ⅳ型胶原酶活力的测定[6]：取对数生长期HT1080细胞，以0.2×105/ml接种于培养瓶中，同时加药，处理3天后换无血清培养基，培养24小时。制10%的分离胶及5%的浓缩胶，在分离胶中加终浓度为0.1%的明胶。收集细胞无血清培养上清，3000 r/min,离心去除细胞碎片；同时，台盼蓝排斥法计数细胞换算为细胞无血清培养上清，取大约80～120 μl/孔，加适量Loading buffer上样，以8 v/cm电泳。当溴酚蓝至分离胶前端2 cm时，取凝胶，用蒸馏水漂洗后，移入100 ml 2.5% Triton X-100溶液中，在低速摇床上摇动以洗脱SDS。30分钟后重复1次，蒸馏水漂洗后置于100 ml明胶酶缓冲液(50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1μmol/L ZnCl2 (pH 7.5)，37 ℃ 温育12～16 小时，置考马氏亮蓝R250染色4小时，并于脱色液(甲醇∶冰∶冰醋酸＝45∶45∶10)脱色1～2小时，至负染带清晰为止，在干胶机上烤干。
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结果
1.5-4A对体外培养的癌细胞的影响：应用MTT法进行肿瘤细胞成活率测定，结果显示，5-4A对实体瘤的细胞毒作用较小。对Bel7402，KB，A2780等细胞毒作用的EC50分别为1.0×10-4mol/L，7.1×10-5 mol/L，1.2×10-4 mol/L。
2.5-4A对B16BL6膜侵袭和运动能力的影响： B16BL6是具有高侵袭能力的黑色素瘤B16亚型。5-4A在4×10-5 mol/L浓度下作用6小时即能抑制B16BL6细胞对人工基底膜的穿透作用,其抑制率为33%。而在8×10-5 mol/L浓度下作用6小时，其抑制率可达66%。5-4A对B16BL6细胞运动能力影响小，作用同样时间，4×10-5mol/L及8×10-5 mol/L对B16BL6膜运动能力抑制率分别为10%及20%。
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3.5-4A对HT1080细胞Ⅳ型胶原酶活力的影响：基底膜是肿瘤细胞发生侵袭和转移的天然屏障，Ⅳ型胶原是其主要的结构蛋白。肿瘤细胞是通过分泌Ⅳ型胶原酶，水解胶原蛋白，从而突破基底膜，发生侵袭和转移。在5-4A 10-5～10-7mol/L浓度下处理人纤维肉瘤HT1080细胞3天，HT1080分泌的Ⅳ型胶原酶活力显著下降，且具有量效关系。
4.5-4A对B16BL6细胞形态的影响：经5-4A处理1～3天，细胞形态发生明显的变化，细胞变大呈梭状。电镜下：核变小，核质比缩小，内质网及微绒毛增多。说明细胞向正常方向逆转。
讨论
基底膜是癌细胞侵袭，转移的天然屏障，Ⅳ型胶原酶是构成基底膜主要结构蛋白[7]，其超螺旋结构区段只有Ⅳ型胶原酶才能水解，诸多研究表明，Ⅳ型胶原酶的表达与肿瘤的恶性表型相关，抑制Ⅳ型胶原酶的活性就能抑制癌细胞的侵袭和转移。Ⅳ型胶原酶主要有相对分子质量72000和92000两种亚型。利用B16BL6对人工重组基底膜侵袭能力试验发现，5-4A在8×10-5mol/L浓度下能抑制B16BL6的侵袭能力，抑制率达66%，而药物在此浓度下无细胞毒作用，可见其抗侵袭作用有一定的特异性而与药物细胞毒作用无关。观察5-4A对B16BL6运动能力影响发现，5-4A对B16BL6运动有一定的抑制作用。将B16BL6用5-4A处理1～3天，可见形态发生明显变化，细胞变大呈梭形。电镜下可见，核变小，核质比变小，内质网增多，细胞向成熟方向分化。可见5-4A对B16BL6的这种侵袭能力的抑制作用，可能与其逆转细胞恶性表型有关。此外，5-4A能减少分子量为92000的Ⅳ型胶原酶活性，从而达到抗侵袭、抗转移之目的。
, 百拇医药
本课题为国家新药基金资助项目(949511)
参考文献
1 韩锐，主编.肿瘤的化学预防及药物治疗，北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社， 1991，62-80.
2 杨景山，主编.医学细胞化学与细胞生物技术，北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1989.
3 张鸿卿，连慕兰，主编.细胞生物学实验方法与技术，北京：北京师范大学出版社， 1989.
4 Scudiero DA,Shoemaker RH，Paul KD,et al.Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines.Cancer Res,1988，48:4 827-4 831.
, 百拇医药
5 Albini A,Iwamoto Y,Kleinman HK,et al.A rapid in vivo assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.Cancer Res,1987，47:3 239-3 245.
6 Zucker S,Mancuso P,DiMassimo B，et al.Comparision of techniques for measurement of gelatinases/type Ⅳ collagenases: enzyme-linked immunoassays versus substrate degradation assays.Clin ExpMetastasis，1994，12:13-23.
7 Howard EW，Bullen EC,Banda MJ.Preferential inhibition of 72KDa and 92Kda gelatinases by Tissue Iinhibitor of metallo-proteinase-2.J Biol Chem，1991，266:13070-13075.
(收稿：1998-10-27 修回：1999-03-08), 百拇医药
单位：100050 北京，中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所
关键词：维甲类；药物筛选试验，抗肿瘤
中华医学杂志990822 【摘要】 目的 为探讨新维甲类化合物5-4A对癌细胞侵袭能力的影响及其作用机理。方法 利用体外重组基底膜侵袭试验，观察癌细胞的侵袭能力；应用生物化学及形态学方法，检查细胞的恶性表型。结果 5-4A在4×10-5 mol/L浓度时，对黑色素瘤高转移株B16BL6细胞膜侵袭具有显著的抑制作用,抑制率为33.9%。结论 5-4A具有抗B16BL6膜侵袭作用。其作用与其抑制肿瘤细胞的运动能力、Ⅳ型胶原酶活力以及改变肿瘤细胞的恶性表型有关。
Inhibition of tumor invasion by new retinoid，5-4A，and its mechanism of the action
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CAO Xihua HAN Rui
(Institute of Material Medical,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical University，Beijing 100050)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of 5-4A on the invasion of B16BL6 and to explore its mechanisms of action.Methods The invasion of B16BL6 was studied using the reconstituted basement membrane invasion assay.Results The phenotype of B16BL6 cells was obviously suppressed by 5-4A at the concentration of 4×10-5 mol/L，and the inhibitory rate was 33.9%.Conclusion 5-4A can inhibit invasion of B16BL6 cells and its mechanisms of action might be associated with the suppression of movement of tumor cells，decrease in the expression of type Ⅳ collagenase，and reversion of the phenotype of B16BL6 cells.
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【Key words】 Retinoid Drug screening assays，antitumor
近年研究发现,维甲类化合物维甲酸对癌细胞的人工基底膜侵袭,实验性肺转移有一定的抑制作用[1]。在对新合成的维甲类化合物筛选中我们发现,5-4A具有抗侵袭作用,但毒性远低于维甲酸。为此，我们进一步对其作用机理进行了研究。
材料与方法
一、材料
药物： 5-4A，相对分子质量为530，本所合成室提供。RPMI 1640培养基(DMEM)为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供。噻唑蓝(MTT) 为美国Sigma产品；小鼠黑色素瘤B16BL6细胞,由美国Fidler教授赠送。Matrigel购自美国；纤维粘连蛋白购自美国Promega公司；侵袭小室(transwell chamber)为美国Costar公司产品；Membrane filter为美国Portic公司产品。
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二、方法
1.细胞学检查[2]：将药物作用一定时间的B16BL6细胞，相差显微镜下观察或用Wright-Giemsa染色12分钟，油镜下观察细胞形态学变化。
2.电镜样品的制备[3]：将药物作用一定时间的细胞和对照细胞在4℃条件下，1000 r/min,离心15分钟，弃上清，用2.5%戊二醛将细胞沉淀固定12小时以上。经0.1 mol/L PBS冲洗后，用四氧化锇及15%亚铁氢化钾的混合液固定1小时以上。用环氧树脂812浸泡，包埋，聚合后，组织块经超薄切片，在Hitachi 800型电镜下观察。
3.MTT反应测定肿瘤细胞成活率[4]：按本室常规方法进行。
4.B16BL6细胞对重组基底膜的侵袭及运动试验[5]：在PVPF滤膜上室腔面铺0.05% Matrigel 30 μl，下室腔面铺fibronectin 10 μg，风干。用指甲油将膜固定于Chamber底面上。以0.25%EDTA的PBS消化B16BL6，将2×105个细胞加于上室腔，同时加药；下室腔加0.1% BSA的RPMI 1640，置CO2培养箱，37 ℃温孵6小时。取膜，HE染色，在显微镜(400倍)下观察5个视野细胞数，结果以抑制率来表示;运动试验与侵袭试验方法相似,只是PVPF膜上不需铺Matrigel。抑制率＝(对照组细胞数-加药组细胞数)/对照组细胞数×100%
, 百拇医药
5.Ⅳ型胶原酶活力的测定[6]：取对数生长期HT1080细胞，以0.2×105/ml接种于培养瓶中，同时加药，处理3天后换无血清培养基，培养24小时。制10%的分离胶及5%的浓缩胶，在分离胶中加终浓度为0.1%的明胶。收集细胞无血清培养上清，3000 r/min,离心去除细胞碎片；同时，台盼蓝排斥法计数细胞换算为细胞无血清培养上清，取大约80～120 μl/孔，加适量Loading buffer上样，以8 v/cm电泳。当溴酚蓝至分离胶前端2 cm时，取凝胶，用蒸馏水漂洗后，移入100 ml 2.5% Triton X-100溶液中，在低速摇床上摇动以洗脱SDS。30分钟后重复1次，蒸馏水漂洗后置于100 ml明胶酶缓冲液(50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1μmol/L ZnCl2 (pH 7.5)，37 ℃ 温育12～16 小时，置考马氏亮蓝R250染色4小时，并于脱色液(甲醇∶冰∶冰醋酸＝45∶45∶10)脱色1～2小时，至负染带清晰为止，在干胶机上烤干。
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结果
1.5-4A对体外培养的癌细胞的影响：应用MTT法进行肿瘤细胞成活率测定，结果显示，5-4A对实体瘤的细胞毒作用较小。对Bel7402，KB，A2780等细胞毒作用的EC50分别为1.0×10-4mol/L，7.1×10-5 mol/L，1.2×10-4 mol/L。
2.5-4A对B16BL6膜侵袭和运动能力的影响： B16BL6是具有高侵袭能力的黑色素瘤B16亚型。5-4A在4×10-5 mol/L浓度下作用6小时即能抑制B16BL6细胞对人工基底膜的穿透作用,其抑制率为33%。而在8×10-5 mol/L浓度下作用6小时，其抑制率可达66%。5-4A对B16BL6细胞运动能力影响小，作用同样时间，4×10-5mol/L及8×10-5 mol/L对B16BL6膜运动能力抑制率分别为10%及20%。
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3.5-4A对HT1080细胞Ⅳ型胶原酶活力的影响：基底膜是肿瘤细胞发生侵袭和转移的天然屏障，Ⅳ型胶原是其主要的结构蛋白。肿瘤细胞是通过分泌Ⅳ型胶原酶，水解胶原蛋白，从而突破基底膜，发生侵袭和转移。在5-4A 10-5～10-7mol/L浓度下处理人纤维肉瘤HT1080细胞3天，HT1080分泌的Ⅳ型胶原酶活力显著下降，且具有量效关系。
4.5-4A对B16BL6细胞形态的影响：经5-4A处理1～3天，细胞形态发生明显的变化，细胞变大呈梭状。电镜下：核变小，核质比缩小，内质网及微绒毛增多。说明细胞向正常方向逆转。
讨论
基底膜是癌细胞侵袭，转移的天然屏障，Ⅳ型胶原酶是构成基底膜主要结构蛋白[7]，其超螺旋结构区段只有Ⅳ型胶原酶才能水解，诸多研究表明，Ⅳ型胶原酶的表达与肿瘤的恶性表型相关，抑制Ⅳ型胶原酶的活性就能抑制癌细胞的侵袭和转移。Ⅳ型胶原酶主要有相对分子质量72000和92000两种亚型。利用B16BL6对人工重组基底膜侵袭能力试验发现，5-4A在8×10-5mol/L浓度下能抑制B16BL6的侵袭能力，抑制率达66%，而药物在此浓度下无细胞毒作用，可见其抗侵袭作用有一定的特异性而与药物细胞毒作用无关。观察5-4A对B16BL6运动能力影响发现，5-4A对B16BL6运动有一定的抑制作用。将B16BL6用5-4A处理1～3天，可见形态发生明显变化，细胞变大呈梭形。电镜下可见，核变小，核质比变小，内质网增多，细胞向成熟方向分化。可见5-4A对B16BL6的这种侵袭能力的抑制作用，可能与其逆转细胞恶性表型有关。此外，5-4A能减少分子量为92000的Ⅳ型胶原酶活性，从而达到抗侵袭、抗转移之目的。
, 百拇医药
本课题为国家新药基金资助项目(949511)
参考文献
1 韩锐，主编.肿瘤的化学预防及药物治疗，北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社， 1991，62-80.
2 杨景山，主编.医学细胞化学与细胞生物技术，北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1989.
3 张鸿卿，连慕兰，主编.细胞生物学实验方法与技术，北京：北京师范大学出版社， 1989.
4 Scudiero DA,Shoemaker RH，Paul KD,et al.Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines.Cancer Res,1988，48:4 827-4 831.
, 百拇医药
5 Albini A,Iwamoto Y,Kleinman HK,et al.A rapid in vivo assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.Cancer Res,1987，47:3 239-3 245.
6 Zucker S,Mancuso P,DiMassimo B，et al.Comparision of techniques for measurement of gelatinases/type Ⅳ collagenases: enzyme-linked immunoassays versus substrate degradation assays.Clin ExpMetastasis，1994，12:13-23.
7 Howard EW，Bullen EC,Banda MJ.Preferential inhibition of 72KDa and 92Kda gelatinases by Tissue Iinhibitor of metallo-proteinase-2.J Biol Chem，1991，266:13070-13075.
(收稿：1998-10-27 修回：1999-03-08), 百拇医药