反义寡核苷酸抗HBV作用的双峰现象
作者：马春红 孙汶生 张利宁 曹英林 宋 静 刘素侠 丁培芳
单位：山东医科大学微生物教研室 山东省济南市 250012
关键词：乙型肝炎病毒；寡核苷酸类，反义；乙型肝炎表面抗原；乙型肝炎核心抗原
世界华人消化杂志990831 中国图书馆分类号 R512.62
Subject headings hepatitis B virus; oligodeoxynucleotides, antisense; HBsAg; HBeAg
HBV基因组含3.2kb DNA，有至少4个ORF，其中S区包含S基因，pre-S1基因和pre-S2基因，编码形成大、中、小3种蛋白，构成HBV的包膜蛋白(HBsAg，preS1Ag, preS2Ag). 其中HBsAg在体内引起的免疫病理反应是HBV感染中的重要致病机制，preS2Ag较HBsAg有更强的抗原性，并具有反式激活作用，在HBV感染及肝癌发生中关系密切. 因而如何从基因水平抑制HBsAg和preS2Ag的表达，对抗HBV治疗有重要意义. 我们设计了针对S基因翻译起始区和preS2基因翻译起始区的反义寡核苷酸(asON)作为基因封条，作用于HepG2.2215细胞，对其抑制作用进行研究，并首次报道了asON抑制作用的双峰现象，为开发新型抗HBV基因药物奠定基础.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 肝癌细胞系HepG22.2.15整合有HBV基因组，能转录、翻译HBV基因，并产生HBsAg，HBeAg和Dane颗粒. 该细胞株引自北京医药生物研究所，本室传代. MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；G418为Sigma产品；HBsAg，HBeAg检测试剂盒为深圳月亮湾公司产品.
1.2 方法
1.2.1 反义寡核苷酸的合成 设计针对pre-S2基因(pre-S2)翻译起始区和S基因翻译起始区的反义寡核苷酸；同时设置HBV非互补随机序列(sense)作为对照. 上述寡核苷酸片段由中国军事医学科学院合成，并进行硫代修饰，其纯度>99%(表1).
1.2.2 AsON对病毒抗原的抑制实验 HepG2 2.2.15培养于含G418和100mL/L胎牛血清的MEM培养基中，37℃ 50mL/L CO2条件下，3d～4d换液一次，细胞长满后传代. 当培养上清中HBsAg，HBeAg稳定分泌，且P/N值>5时，用于实验. 将细胞以1×104/孔接种于96孔板. 2d细胞贴壁后弃培养基，加入含不同浓度反义/正义寡核苷酸MEM的培养基，每个浓度设3孔重复，同时设空白对照(不加寡核苷酸). 作用一定时间后收集上清，以ELISA法测定上清中HBsAg，HBeAg含量. 反义核酸对病毒抗原的抑制率=(对照孔P/N-实验孔P/N)÷(对照孔P/N-2.1)，P/N=标本A/阴性对照A.
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1.2.3 反义核酸细胞毒性试验 通过细胞计数、细胞活率及细胞形态学观察，了解asON的细胞毒性作用；MTT比色法测定asON对细胞代谢的影响情况.
2 结果
2.1 As-preS2对病毒抗原表达的抑制作用 以10μmol/L的as-preS2和as-S作用HepG2.2215，并以无关正义序列作对照，作用后每隔24hr取上清测抗原含量，持续观察7d，(表2). 针对preS2，S基因翻译起始区的反义序列均可有效抑制抗原表达，而HBV无关正义序列在观察的7d中对HBV抗原表达的抑制作用均小于15%. 其中as-preS2对HBsAg, HBeAg的抑制作用在1d即达高峰，分别为66%和91%，而且直至d6仍有明显抑制作用；as-S的抑制作用出现较晚，作用较小，尤其是对HBeAg的抑制作用仅为31%.
2.2 asON抑制作用的双峰现象 以10μmol/L的反义寡核苷酸一次性作用于HepG22.2.15，观察其抑制作用随时间的变化，发现反义寡核苷酸在持续作用HepG22.2.15的过程中，对病毒基因表达的抑制作用有双峰现象：在作用的7d中，反义序列对病毒抗原表达出现两次强的抑制作用，即有两个峰值，但两个asON的峰值出现时间不同(图1，2). 由图中看出as-preS2对HBsAg的抑制峰出现于1d，6d；4d,5d处于低谷，as-S对HBsAg的抑制峰出现于5d,7d. 恰好互补于as-preS2.
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2.3 AsON抑制作用的持续时间 HepG2.2215以1×104/孔接种于96孔板，贴壁后加入含10μmol/L反义序列(as-S)的新鲜培养基，作用72h后，取出孔中所有上清，原孔中再补加100μL不含反义序列的新鲜MEM，继续培养，分别于不同时间取上清测抗原含量，结果表明：去掉反义寡核苷酸后d4仍有抑制作用(图3).
图1 反义核酸对HBsAg抑制作用的双峰现象.
图2 反义核酸对HBeAg抑制作用的双峰现象.
图3 as_S对病毒抗原的抑制作用
, 百拇医药
表1 硫代寡核苷酸序列 序列名称
靶基因位点
寡核苷酸序列
As-preS2
3203～3219
5＇CCA CTG CAT GGC CTA AG3＇
As-S
147～163
5＇GTT CTC CAT GTT CGG TG3＇
Sense
none
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5＇TTG CCG AGC GGG GTA3＇
表2 反义核酸对HBV基因表达的抑制作用 (%) 名称
HBsAg(t/d)
HBeAg(t/d)
1
2
3
4
5
6
7
1
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2
3
4
5
6
7
as-preS2
66
21
11
20
38
4
91
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67
50
10
53
24
29
as-S
29
41
45
56
8
50
31
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19
14
4
11
sense
9
11
8
10
9
10
9
12
10
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7
10
11
10
8
2.4 反义核酸对细胞无毒性作用 以20μmol/L，40μmol/L的反义寡核苷酸作用于HepG22.2.15，镜下观察显示两种反义序列作用的细胞在形态、数目(总数、活细胞数)较正常无明显变化，MTT结果证明反义序列对细胞代谢无影响(对细胞的细胞毒指数<5%).
3 讨论
乙肝病毒为嗜肝病毒，其基因组的复制有其自身的特点：即HBV DNA大小不同的转录物RNA即是其翻译成病毒蛋白的模板，又是作为前基因组的逆转录模板，因此，破坏HBV特异的RNA对防治HBV感染有重要意义. 反义核酸技术利用碱基互补配对原则，特异性阻断目的基因的表达，有望成为抗HBV治疗的一个重要手段[1，2]. 我们在S基因区内设计合成了两段反义寡核苷酸，体外实验表明：合成的两个反义序列对HBsAg，HBeAg表达均有抑制作用，其中针对pre-S2起始区的as-pres2作用最强(P<0.02)，尤其是其对HBeAg表达的抑制率高达91%，证明as-preS2有效抑制了HBV DNA的复制.
, 百拇医药
多数学者认为asON对HBV的抑制作用随作用时间的延长达高峰后处于相对稳定状态[3，4]，或逐渐衰减[2] 而我们发现asON对HBV的作用有双峰现象：互补于HBpre-S2的反义序列(as-preS2)作用1d～2d，对HBsAg，HBeAg的抑制即达到高峰，而后逐渐衰减，至d4，抑制率降为15%以下，然后又回升. 这种双峰现象国内外尚无报道，这种时相性在反义技术抗HBV作用中值得考虑，其深入研究将为asON用于临床抗HBV治疗提供用药指导.
为弥补asON作用双峰现象带来的问题，我们进一步研究反义序列的抑制规律，发现as-preS2与as-S的抑制作用在时相上互补(图3)，所以我们建议将两种以上的反义寡核苷酸联合应用以提高疗效. 另外，我们的实验证明较高浓度的asON对细胞无毒害作用. 因而，我们认为反义寡核苷酸有望开发为新的抗HBV基因药物.
通讯作者 马春红
, 百拇医药
4 参考文献
1 Yao ZQ, Zhou YX, Feng XM, Chen ZX. Specific inhibition of hepatiris B virus gene expression by an antise oligonucleotide in vitro. Acta Virologica, 1995;39:227-230
2 钟森，王升启，张定凤. 乙肝病毒S基因区反义寡核苷酸对表面抗原表达的抑制作用. 临床肝胆病杂志，1998；14：24-26
3 冯志华，周永兴，姚志强，陈勇，李光玉. 特异性乙型肝炎病毒X基因反义核酸体外抗病毒作用. 中华内科杂志，1997；36：246-249
4 姚志强，周永兴，郭军，冯雪梅，陈朝霞. 反义核酸抗乙型肝炎病毒基因治疗基础研究. 中华传染病杂志，1996；14：6-10ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(8):710
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, 百拇医药
单位：山东医科大学微生物教研室 山东省济南市 250012
关键词：乙型肝炎病毒；寡核苷酸类，反义；乙型肝炎表面抗原；乙型肝炎核心抗原
世界华人消化杂志990831 中国图书馆分类号 R512.62
Subject headings hepatitis B virus; oligodeoxynucleotides, antisense; HBsAg; HBeAg
HBV基因组含3.2kb DNA，有至少4个ORF，其中S区包含S基因，pre-S1基因和pre-S2基因，编码形成大、中、小3种蛋白，构成HBV的包膜蛋白(HBsAg，preS1Ag, preS2Ag). 其中HBsAg在体内引起的免疫病理反应是HBV感染中的重要致病机制，preS2Ag较HBsAg有更强的抗原性，并具有反式激活作用，在HBV感染及肝癌发生中关系密切. 因而如何从基因水平抑制HBsAg和preS2Ag的表达，对抗HBV治疗有重要意义. 我们设计了针对S基因翻译起始区和preS2基因翻译起始区的反义寡核苷酸(asON)作为基因封条，作用于HepG2.2215细胞，对其抑制作用进行研究，并首次报道了asON抑制作用的双峰现象，为开发新型抗HBV基因药物奠定基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 肝癌细胞系HepG22.2.15整合有HBV基因组，能转录、翻译HBV基因，并产生HBsAg，HBeAg和Dane颗粒. 该细胞株引自北京医药生物研究所，本室传代. MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；G418为Sigma产品；HBsAg，HBeAg检测试剂盒为深圳月亮湾公司产品.
1.2 方法
1.2.1 反义寡核苷酸的合成 设计针对pre-S2基因(pre-S2)翻译起始区和S基因翻译起始区的反义寡核苷酸；同时设置HBV非互补随机序列(sense)作为对照. 上述寡核苷酸片段由中国军事医学科学院合成，并进行硫代修饰，其纯度>99%(表1).
1.2.2 AsON对病毒抗原的抑制实验 HepG2 2.2.15培养于含G418和100mL/L胎牛血清的MEM培养基中，37℃ 50mL/L CO2条件下，3d～4d换液一次，细胞长满后传代. 当培养上清中HBsAg，HBeAg稳定分泌，且P/N值>5时，用于实验. 将细胞以1×104/孔接种于96孔板. 2d细胞贴壁后弃培养基，加入含不同浓度反义/正义寡核苷酸MEM的培养基，每个浓度设3孔重复，同时设空白对照(不加寡核苷酸). 作用一定时间后收集上清，以ELISA法测定上清中HBsAg，HBeAg含量. 反义核酸对病毒抗原的抑制率=(对照孔P/N-实验孔P/N)÷(对照孔P/N-2.1)，P/N=标本A/阴性对照A.
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1.2.3 反义核酸细胞毒性试验 通过细胞计数、细胞活率及细胞形态学观察，了解asON的细胞毒性作用；MTT比色法测定asON对细胞代谢的影响情况.
2 结果
2.1 As-preS2对病毒抗原表达的抑制作用 以10μmol/L的as-preS2和as-S作用HepG2.2215，并以无关正义序列作对照，作用后每隔24hr取上清测抗原含量，持续观察7d，(表2). 针对preS2，S基因翻译起始区的反义序列均可有效抑制抗原表达，而HBV无关正义序列在观察的7d中对HBV抗原表达的抑制作用均小于15%. 其中as-preS2对HBsAg, HBeAg的抑制作用在1d即达高峰，分别为66%和91%，而且直至d6仍有明显抑制作用；as-S的抑制作用出现较晚，作用较小，尤其是对HBeAg的抑制作用仅为31%.
2.2 asON抑制作用的双峰现象 以10μmol/L的反义寡核苷酸一次性作用于HepG22.2.15，观察其抑制作用随时间的变化，发现反义寡核苷酸在持续作用HepG22.2.15的过程中，对病毒基因表达的抑制作用有双峰现象：在作用的7d中，反义序列对病毒抗原表达出现两次强的抑制作用，即有两个峰值，但两个asON的峰值出现时间不同(图1，2). 由图中看出as-preS2对HBsAg的抑制峰出现于1d，6d；4d,5d处于低谷，as-S对HBsAg的抑制峰出现于5d,7d. 恰好互补于as-preS2.
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2.3 AsON抑制作用的持续时间 HepG2.2215以1×104/孔接种于96孔板，贴壁后加入含10μmol/L反义序列(as-S)的新鲜培养基，作用72h后，取出孔中所有上清，原孔中再补加100μL不含反义序列的新鲜MEM，继续培养，分别于不同时间取上清测抗原含量，结果表明：去掉反义寡核苷酸后d4仍有抑制作用(图3).
图1 反义核酸对HBsAg抑制作用的双峰现象.
图2 反义核酸对HBeAg抑制作用的双峰现象.
图3 as_S对病毒抗原的抑制作用
, 百拇医药
表1 硫代寡核苷酸序列 序列名称
靶基因位点
寡核苷酸序列
As-preS2
3203～3219
5＇CCA CTG CAT GGC CTA AG3＇
As-S
147～163
5＇GTT CTC CAT GTT CGG TG3＇
Sense
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5＇TTG CCG AGC GGG GTA3＇
表2 反义核酸对HBV基因表达的抑制作用 (%) 名称
HBsAg(t/d)
HBeAg(t/d)
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2.4 反义核酸对细胞无毒性作用 以20μmol/L，40μmol/L的反义寡核苷酸作用于HepG22.2.15，镜下观察显示两种反义序列作用的细胞在形态、数目(总数、活细胞数)较正常无明显变化，MTT结果证明反义序列对细胞代谢无影响(对细胞的细胞毒指数<5%).
3 讨论
乙肝病毒为嗜肝病毒，其基因组的复制有其自身的特点：即HBV DNA大小不同的转录物RNA即是其翻译成病毒蛋白的模板，又是作为前基因组的逆转录模板，因此，破坏HBV特异的RNA对防治HBV感染有重要意义. 反义核酸技术利用碱基互补配对原则，特异性阻断目的基因的表达，有望成为抗HBV治疗的一个重要手段[1，2]. 我们在S基因区内设计合成了两段反义寡核苷酸，体外实验表明：合成的两个反义序列对HBsAg，HBeAg表达均有抑制作用，其中针对pre-S2起始区的as-pres2作用最强(P<0.02)，尤其是其对HBeAg表达的抑制率高达91%，证明as-preS2有效抑制了HBV DNA的复制.
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多数学者认为asON对HBV的抑制作用随作用时间的延长达高峰后处于相对稳定状态[3，4]，或逐渐衰减[2] 而我们发现asON对HBV的作用有双峰现象：互补于HBpre-S2的反义序列(as-preS2)作用1d～2d，对HBsAg，HBeAg的抑制即达到高峰，而后逐渐衰减，至d4，抑制率降为15%以下，然后又回升. 这种双峰现象国内外尚无报道，这种时相性在反义技术抗HBV作用中值得考虑，其深入研究将为asON用于临床抗HBV治疗提供用药指导.
为弥补asON作用双峰现象带来的问题，我们进一步研究反义序列的抑制规律，发现as-preS2与as-S的抑制作用在时相上互补(图3)，所以我们建议将两种以上的反义寡核苷酸联合应用以提高疗效. 另外，我们的实验证明较高浓度的asON对细胞无毒害作用. 因而，我们认为反义寡核苷酸有望开发为新的抗HBV基因药物.
通讯作者 马春红
, 百拇医药
4 参考文献
1 Yao ZQ, Zhou YX, Feng XM, Chen ZX. Specific inhibition of hepatiris B virus gene expression by an antise oligonucleotide in vitro. Acta Virologica, 1995;39:227-230
2 钟森，王升启，张定凤. 乙肝病毒S基因区反义寡核苷酸对表面抗原表达的抑制作用. 临床肝胆病杂志，1998；14：24-26
3 冯志华，周永兴，姚志强，陈勇，李光玉. 特异性乙型肝炎病毒X基因反义核酸体外抗病毒作用. 中华内科杂志，1997；36：246-249
4 姚志强，周永兴，郭军，冯雪梅，陈朝霞. 反义核酸抗乙型肝炎病毒基因治疗基础研究. 中华传染病杂志，1996；14：6-10ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(8):710
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, 百拇医药