胃癌组织中PTEN基因和蛋白表达的研究
作者：张晋夏 吕怀盛 张 雪
单位：宁夏医学院病理教研室 750001
关键词：胃癌；基因表达；PTEN基因；免疫组织化学；原位杂交；预后
宁夏医学杂志/990801 【摘要】 目的 探讨在胃癌组织中PTEN基因和蛋白的表达情况及临床病理意义。方法 应用免疫组织化学和原位杂交技术检测50例胃癌及其癌旁组织中PTEN蛋白及PTEN mRNA表达情况，同时结合病人的临床病理资料进行分析。结果 50胃癌组织中，PTEN蛋白阳性表达率48%，阳性率52%，阳性反应分布在胞浆中。50例胃癌组织中PTEN mRNA阳性表达率60%，阳性率40%，阳性信号显示于胞浆中。PTEN蛋白及PTEN mRNA在胃癌组织中的阳性表达与患者性别，年龄无明显相关性，但均与组织分化程度明显相关，高分化腺癌组的阳性率分别为77.8%及88.9%，低分化腺癌组的阳性率分别为31.3%及43.8%。结论 胃癌组织中存在较高比例的PTENmRNA及PTEN蛋白阳性表达，说明在胃癌的发生发展中，PTEN基因失活起着重要作用，两者的阳性表达均有一定的预后意义。
, 百拇医药
Expression of PTEN gene in carcinoma of stomach detected by immunohistochemical and in situ hybridization techigues
Zhang Jinxia,et al. (Dept.of Pathology,Ningxia Med.Coll.Yinchuan )
【Abstract】 Objectives To investigate the expression of PTEN gene in cacinoma of stomach and its clinicopathological.Methods Paraffin embedded tissues from 50 patients with cacinoma of stomach were analysed for PTEN gene expression by immunohistochemical methods and in situ hybridization technique. Results Of the 50 carcinoma of stomach cases, 24 (48%) were positive for PTEN protein, 26(52%) lacked PTEN protein, the positive signals were seen in the cytoplasm; 30(60%) were PTEN mRNA positive, 20(40%) lost PTEN mRNA and PTEN mRNA was clearly observed in the cytoplasm of carcinoma ttissues.PTEN expression did not show correlation with such factors as sex, age in caxcinoma of stomach, but there was a significant difference between the pattern of expression of PTEN in well differentiated adenocarcinoma and poorly differentiated adenocarcinoma (P<0.05). Conclusions There was a higher incidence of negative expression of PTEN mRNA and protein in carcinoma of stomach, which indicates that PTEN gene inactivation may play an important role in the genesis and development of some carcinoma of stomach .The positive may be features for favorable prognosis in patients with carcinoma of stomach
, http://www.100md.com
【Key words】 carcinoma of stomach；Gene expression；Prognosis；Immunohistochemistry；In situ hybridization；PTEN gene
自80年代中期以来，抑癌基因的作用得到了广泛的研究和深入探讨，较重要的为P53和Rb基因。PTEN是近两年新发现的肿瘤抑制基因，该基因的高表达使肿瘤细胞的生长受到抑制。研究表明：PTEN基因在不同类型的恶性肿瘤组织和肿瘤细胞系中有缺失[1]，但在胃癌组织中PTEN基因的缺失目前尚无文献报到。为此，我们应用免疫组织化学技术和原位杂交技术，对50例胃癌及其相应癌旁组织中PTEN蛋白及PTENmRNA表达情况进行了研究，旨在探讨胃癌发生发展中PTEN的作用及临床病理意义，为其防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料：50例胃癌及癌旁组织为1995～1998年宁夏医学院附属医院病理科存档处科手术标本。均为胃腺癌，据其分化程度分为高分腺癌18例和低分化腺癌32例。其中男34例，女16例，男：女为2.1：1，年龄28～79，所有患者术前均未接受化疗和放疗。
, 百拇医药
1.2 组织学检测：用常规苏木紫-伊红(HE)染色。
1.3 免疫组织化学检测PTEN蛋白：抗PTEN多克隆抗体为SANTA CRUZ公司产品。采用枸橼酸-ABC-微波免疫组化技术。凡细胞浆中出现明显的棕黄色颗粒为PTEN蛋白阳性细胞。在胃癌组织中，根据阳性瘤细胞与全部瘤细胞的比例分为：(1)阳性(-)无阳性瘤细胞或阳性瘤细胞数<10%；(2)阳性(+)：阳性瘤细胞占10%～40%；(3)阳性(++)：40%-70%；(4)阳性(+++)>70%。
1.4 原位杂交检测PTENmRNA：PTEN质粒为美国Medison大学医学院殷澄博士赠，用EcoRI，XhoI酶切，采用体外转录法生物素标记PTENRNA探针。杂交流程：石蜡切片厚与5um，鼓风机吹干后二甲苯，梯度酒精脱蜡水化，PBS洗二次，0.5%过氧化氢-甲醇封闭30分钟，蛋白酶K37℃15分钟，0.2mmol/L HCL室温10分钟70%、80%、90%、100%、乙醇各15秒 ，风干。混合生物素标记的PTEN探针的杂交液，85℃3分钟加热变性，滴加切片后用封口膜覆盖42℃20小时保温(温盒加100%甲酰胺)。切片置5×SSC中，揭去封口膜，再置2×SSC中，50%甲酰胺30分钟。SSC，PBS洗净后置ABC复合液中30分钟，苏木素复杂，封片。凡胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性强度判断同PTEN蛋白免疫组化标准。
, 百拇医药
1.5 统计学处理：采用两样本构成比(率)比较的χ2检验。
2 结果
2.1 免疫组织化学结果：PTEN蛋白阳性反应均定位于胞浆，呈棕色或棕黄色颗粒。50例癌旁组织其PTEN蛋白全部呈阳性表达，癌组织中的阳性细胞，或呈弥漫性分布或呈散在分布，50例癌组织中，阳性24例(48%)，其中(+)6例(25%)；(++)6例(25%)；(+++)12例(50%)。PTEN蛋白在癌旁组织的阳性表达显著高于胃癌组织(P<0.01) 。在胃癌组织中的阳性表达与患者性别、年龄、组织分化程度的关系见附表。其中高分化腺癌阳性率77.8%，低分化腺癌阳性率31.3%(P<0.05) 。
附表 PTEN蛋白与PTENmRNA在胃癌组织中的阳性表达
与临床病理特征的关系 项目
, 百拇医药
n
PTEN蛋白表达
PTENmRNA表达
例数
%
例数
%
性别
男
34
18
52.9
21
, 百拇医药
61.8
女
16
6
37.5
9
56.3
年龄(岁)
≥45
36
16
44.4
19
, 百拇医药 52.8
<45
14
8
57.1
11
78.6
分化程度
高分化
18
14
77.8
16
, 百拇医药 88.9
低分化
32
10
31.3
14
43.8
2.2 原位杂交结果：PTEN原位杂交信号出现在胞浆中，呈棕色或棕黄色细颗粒。50例癌旁组织PTEN mRNA全部阳性表达，阳性细胞的分布与PTEN蛋白分布基本一致，但阳性细胞明显增多，胃癌组织阳性细胞或呈弥漫性分布或呈散在分布。50例中，阳性30例(60%)，其中(+)5例(17%)；(++)10例(33%)；(+++)15例(50%)。PTEN mRNA在癌旁组织的阳性表达显著高于胃癌组织(P<0.05)。PTEN mRNA阳性表达情况与胃癌患者临床病理特征的关系见附表。其中高分化腺癌阳性率88.9%，显著高于低分化腺癌43.8%。
, 百拇医药
2.3 胃癌PTENmRNA和蛋白表达的关系：凡PTEN蛋白表达阳性的病例，PTENmRNA亦是阳性，但有6例PTEN蛋白表达阴性，PTENmRNA呈阳性表达。二者吻合率为80%。
3 讨论
PTEN蛋白表达情况及临床意义：我们应用免疫组化技术，对50例胃癌及其相应癌旁组织进行了PTEN蛋白表达的检测，结果显示PTEN蛋白主要位于胞浆中。50癌旁组织全部呈阳性表达，胃癌组织表达率低为48%。胃癌组织存在高比例的PTEN蛋白阴性表达，提示在胃癌的发生发展中，PTEN蛋白阴性表达可能起着重要作用。PTEN蛋白在某些实体瘤的阴性表达有过报道，如胶质母细胞[2]，前列腺癌[3]，恶性黑色素瘤[4]和乳腺癌[5]等。因为PTEN基因突变率低，应用免疫组化技术检测到的PTEN蛋白大部分病例可能为野生型而非突变型，这与P53基因正好相反，野生型P53蛋白在细胞中含量少且半衰期短至6～20分钟，一般用免疫组化检测到的P53蛋白，即为突变型蛋白。PTEN蛋白的这一特点可能有一定的临床病理意义，即检测PTEN蛋白有可能成为判断胃癌患者预后的指标。本实验结果显示PTEN蛋白在胃癌组织中的阳性表达虽与患者性别，年龄无明显相关性，但与组织分化程度明显相关，高分化腺癌阳性率77.8% ,明显高于低分化腺癌的阳性率31.3%。(P<0.05)。一般认为胃癌的分化程度是一个较好的预后指标。
, http://www.100md.com
PTEN mRNA表达情况及其与PTEN蛋白表达的关系；我们应用生物素标记的PTEN探针及原位杂交技术检测了50例胃癌及其相应癌旁组织。结果显示癌旁组织PTEN mRNA阳性表达率显著高于胃癌组织。胃癌组织中PTEN mRNA阳性率60%，PTEN mRNA 阳性表达情况也显示与组织分化程度有关，即高分化腺癌阳性率88.9%，显著高于低分化腺癌43.8%(P<0.05),与预后明显相关。原位杂交检测PTEN mRNA的阳性率较胃癌的纯合缺失率偏高。原因除了应用PCR技术可能低估胃癌的纯合缺失率外，可能还与PEN基因高度甲基化致使基因不转录有关[6]。PTEN mRNA和PTEN蛋白在胃癌的吻合率为80%，但有6例PTEN蛋白阴性， PTENmRNA却是阳性表达，此外二者同时阳性的病例，PTENmRNA 的阳性细胞数也明显高于PTEN蛋白阳性细胞数。其原因除了原位杂交技术免疫组化方法更敏感外，可能还与转录后的调节，mRNA或蛋白不稳定有关。应用体外转录法生物素标记RNA探针，原位杂交技术较同位素标记探针技术有以下优点：(1)快速，时间可缩短在一天；(2)避免了放射性；(3)敏感性接近放射性同位素方法，细胞定位更准确；(4)检测的mRNA能长期保存；(5)易定量；(6)能用于石蜡包埋组织。因此该项技术在将来必将得到更为广泛的应用。
, 百拇医药
注释:本课题为高校研究经费资助
4 参考文献
[1] 江明.PTEN/MMAC.TEP1基因—一种新的肿瘤抑制基因和蛋白酪氨酸磷酸酶的研究进展.国外
医学肿瘤学分册，1998，25(2)：70～72
[2] Bostrom J et al. Mutation of the PTEN(MMACI) tumor suppressor gene on a subset
of glioblastomas bat not on meningiomas with loss of chromosome arm 10g ,Cancer Res ,1998 Jan 1;58 (1):29～33
, 百拇医药 [3] Cairms-P et al.Freguemt inactivation of PTEN/MMACI in primary prostate
cancer, Cancer Res .1997 Nov 15;57(22):4997～5000
[4] Guldberg P et al. Disruption of the MMACI/PTEN gene by deletion or mutation
is a freguent event in malignant melanoma. Cancer Res,1997 sep 1;57(17);3660
～3663
[5] Rhei E et al ,Mutation analysis of the putative tumor suppressor gene
, 百拇医药
PTEN/MMACI in primany breast carcinomas. Cancer Res, 1997 sep 1; 57(15):3657
～3659
[6] Gonxalez-Aulaeta M, et al. Methylation of the 5’CPG island of the p16/CDKN2
tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates
with gene silencing , Cancer Res, 1995,55:4531～4535
责编：杨自革
收稿：1999—05—04, 百拇医药
单位：宁夏医学院病理教研室 750001
关键词：胃癌；基因表达；PTEN基因；免疫组织化学；原位杂交；预后
宁夏医学杂志/990801 【摘要】 目的 探讨在胃癌组织中PTEN基因和蛋白的表达情况及临床病理意义。方法 应用免疫组织化学和原位杂交技术检测50例胃癌及其癌旁组织中PTEN蛋白及PTEN mRNA表达情况，同时结合病人的临床病理资料进行分析。结果 50胃癌组织中，PTEN蛋白阳性表达率48%，阳性率52%，阳性反应分布在胞浆中。50例胃癌组织中PTEN mRNA阳性表达率60%，阳性率40%，阳性信号显示于胞浆中。PTEN蛋白及PTEN mRNA在胃癌组织中的阳性表达与患者性别，年龄无明显相关性，但均与组织分化程度明显相关，高分化腺癌组的阳性率分别为77.8%及88.9%，低分化腺癌组的阳性率分别为31.3%及43.8%。结论 胃癌组织中存在较高比例的PTENmRNA及PTEN蛋白阳性表达，说明在胃癌的发生发展中，PTEN基因失活起着重要作用，两者的阳性表达均有一定的预后意义。
, 百拇医药
Expression of PTEN gene in carcinoma of stomach detected by immunohistochemical and in situ hybridization techigues
Zhang Jinxia,et al. (Dept.of Pathology,Ningxia Med.Coll.Yinchuan )
【Abstract】 Objectives To investigate the expression of PTEN gene in cacinoma of stomach and its clinicopathological.Methods Paraffin embedded tissues from 50 patients with cacinoma of stomach were analysed for PTEN gene expression by immunohistochemical methods and in situ hybridization technique. Results Of the 50 carcinoma of stomach cases, 24 (48%) were positive for PTEN protein, 26(52%) lacked PTEN protein, the positive signals were seen in the cytoplasm; 30(60%) were PTEN mRNA positive, 20(40%) lost PTEN mRNA and PTEN mRNA was clearly observed in the cytoplasm of carcinoma ttissues.PTEN expression did not show correlation with such factors as sex, age in caxcinoma of stomach, but there was a significant difference between the pattern of expression of PTEN in well differentiated adenocarcinoma and poorly differentiated adenocarcinoma (P<0.05). Conclusions There was a higher incidence of negative expression of PTEN mRNA and protein in carcinoma of stomach, which indicates that PTEN gene inactivation may play an important role in the genesis and development of some carcinoma of stomach .The positive may be features for favorable prognosis in patients with carcinoma of stomach
, http://www.100md.com
【Key words】 carcinoma of stomach；Gene expression；Prognosis；Immunohistochemistry；In situ hybridization；PTEN gene
自80年代中期以来，抑癌基因的作用得到了广泛的研究和深入探讨，较重要的为P53和Rb基因。PTEN是近两年新发现的肿瘤抑制基因，该基因的高表达使肿瘤细胞的生长受到抑制。研究表明：PTEN基因在不同类型的恶性肿瘤组织和肿瘤细胞系中有缺失[1]，但在胃癌组织中PTEN基因的缺失目前尚无文献报到。为此，我们应用免疫组织化学技术和原位杂交技术，对50例胃癌及其相应癌旁组织中PTEN蛋白及PTENmRNA表达情况进行了研究，旨在探讨胃癌发生发展中PTEN的作用及临床病理意义，为其防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料：50例胃癌及癌旁组织为1995～1998年宁夏医学院附属医院病理科存档处科手术标本。均为胃腺癌，据其分化程度分为高分腺癌18例和低分化腺癌32例。其中男34例，女16例，男：女为2.1：1，年龄28～79，所有患者术前均未接受化疗和放疗。
, 百拇医药
1.2 组织学检测：用常规苏木紫-伊红(HE)染色。
1.3 免疫组织化学检测PTEN蛋白：抗PTEN多克隆抗体为SANTA CRUZ公司产品。采用枸橼酸-ABC-微波免疫组化技术。凡细胞浆中出现明显的棕黄色颗粒为PTEN蛋白阳性细胞。在胃癌组织中，根据阳性瘤细胞与全部瘤细胞的比例分为：(1)阳性(-)无阳性瘤细胞或阳性瘤细胞数<10%；(2)阳性(+)：阳性瘤细胞占10%～40%；(3)阳性(++)：40%-70%；(4)阳性(+++)>70%。
1.4 原位杂交检测PTENmRNA：PTEN质粒为美国Medison大学医学院殷澄博士赠，用EcoRI，XhoI酶切，采用体外转录法生物素标记PTENRNA探针。杂交流程：石蜡切片厚与5um，鼓风机吹干后二甲苯，梯度酒精脱蜡水化，PBS洗二次，0.5%过氧化氢-甲醇封闭30分钟，蛋白酶K37℃15分钟，0.2mmol/L HCL室温10分钟70%、80%、90%、100%、乙醇各15秒 ，风干。混合生物素标记的PTEN探针的杂交液，85℃3分钟加热变性，滴加切片后用封口膜覆盖42℃20小时保温(温盒加100%甲酰胺)。切片置5×SSC中，揭去封口膜，再置2×SSC中，50%甲酰胺30分钟。SSC，PBS洗净后置ABC复合液中30分钟，苏木素复杂，封片。凡胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性强度判断同PTEN蛋白免疫组化标准。
, 百拇医药
1.5 统计学处理：采用两样本构成比(率)比较的χ2检验。
2 结果
2.1 免疫组织化学结果：PTEN蛋白阳性反应均定位于胞浆，呈棕色或棕黄色颗粒。50例癌旁组织其PTEN蛋白全部呈阳性表达，癌组织中的阳性细胞，或呈弥漫性分布或呈散在分布，50例癌组织中，阳性24例(48%)，其中(+)6例(25%)；(++)6例(25%)；(+++)12例(50%)。PTEN蛋白在癌旁组织的阳性表达显著高于胃癌组织(P<0.01) 。在胃癌组织中的阳性表达与患者性别、年龄、组织分化程度的关系见附表。其中高分化腺癌阳性率77.8%，低分化腺癌阳性率31.3%(P<0.05) 。
附表 PTEN蛋白与PTENmRNA在胃癌组织中的阳性表达
与临床病理特征的关系 项目
, 百拇医药
n
PTEN蛋白表达
PTENmRNA表达
例数
%
例数
%
性别
男
34
18
52.9
21
, 百拇医药
61.8
女
16
6
37.5
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56.3
年龄(岁)
≥45
36
16
44.4
19
, 百拇医药 52.8
<45
14
8
57.1
11
78.6
分化程度
高分化
18
14
77.8
16
, 百拇医药 88.9
低分化
32
10
31.3
14
43.8
2.2 原位杂交结果：PTEN原位杂交信号出现在胞浆中，呈棕色或棕黄色细颗粒。50例癌旁组织PTEN mRNA全部阳性表达，阳性细胞的分布与PTEN蛋白分布基本一致，但阳性细胞明显增多，胃癌组织阳性细胞或呈弥漫性分布或呈散在分布。50例中，阳性30例(60%)，其中(+)5例(17%)；(++)10例(33%)；(+++)15例(50%)。PTEN mRNA在癌旁组织的阳性表达显著高于胃癌组织(P<0.05)。PTEN mRNA阳性表达情况与胃癌患者临床病理特征的关系见附表。其中高分化腺癌阳性率88.9%，显著高于低分化腺癌43.8%。
, 百拇医药
2.3 胃癌PTENmRNA和蛋白表达的关系：凡PTEN蛋白表达阳性的病例，PTENmRNA亦是阳性，但有6例PTEN蛋白表达阴性，PTENmRNA呈阳性表达。二者吻合率为80%。
3 讨论
PTEN蛋白表达情况及临床意义：我们应用免疫组化技术，对50例胃癌及其相应癌旁组织进行了PTEN蛋白表达的检测，结果显示PTEN蛋白主要位于胞浆中。50癌旁组织全部呈阳性表达，胃癌组织表达率低为48%。胃癌组织存在高比例的PTEN蛋白阴性表达，提示在胃癌的发生发展中，PTEN蛋白阴性表达可能起着重要作用。PTEN蛋白在某些实体瘤的阴性表达有过报道，如胶质母细胞[2]，前列腺癌[3]，恶性黑色素瘤[4]和乳腺癌[5]等。因为PTEN基因突变率低，应用免疫组化技术检测到的PTEN蛋白大部分病例可能为野生型而非突变型，这与P53基因正好相反，野生型P53蛋白在细胞中含量少且半衰期短至6～20分钟，一般用免疫组化检测到的P53蛋白，即为突变型蛋白。PTEN蛋白的这一特点可能有一定的临床病理意义，即检测PTEN蛋白有可能成为判断胃癌患者预后的指标。本实验结果显示PTEN蛋白在胃癌组织中的阳性表达虽与患者性别，年龄无明显相关性，但与组织分化程度明显相关，高分化腺癌阳性率77.8% ,明显高于低分化腺癌的阳性率31.3%。(P<0.05)。一般认为胃癌的分化程度是一个较好的预后指标。
, http://www.100md.com
PTEN mRNA表达情况及其与PTEN蛋白表达的关系；我们应用生物素标记的PTEN探针及原位杂交技术检测了50例胃癌及其相应癌旁组织。结果显示癌旁组织PTEN mRNA阳性表达率显著高于胃癌组织。胃癌组织中PTEN mRNA阳性率60%，PTEN mRNA 阳性表达情况也显示与组织分化程度有关，即高分化腺癌阳性率88.9%，显著高于低分化腺癌43.8%(P<0.05),与预后明显相关。原位杂交检测PTEN mRNA的阳性率较胃癌的纯合缺失率偏高。原因除了应用PCR技术可能低估胃癌的纯合缺失率外，可能还与PEN基因高度甲基化致使基因不转录有关[6]。PTEN mRNA和PTEN蛋白在胃癌的吻合率为80%，但有6例PTEN蛋白阴性， PTENmRNA却是阳性表达，此外二者同时阳性的病例，PTENmRNA 的阳性细胞数也明显高于PTEN蛋白阳性细胞数。其原因除了原位杂交技术免疫组化方法更敏感外，可能还与转录后的调节，mRNA或蛋白不稳定有关。应用体外转录法生物素标记RNA探针，原位杂交技术较同位素标记探针技术有以下优点：(1)快速，时间可缩短在一天；(2)避免了放射性；(3)敏感性接近放射性同位素方法，细胞定位更准确；(4)检测的mRNA能长期保存；(5)易定量；(6)能用于石蜡包埋组织。因此该项技术在将来必将得到更为广泛的应用。
, 百拇医药
注释:本课题为高校研究经费资助
4 参考文献
[1] 江明.PTEN/MMAC.TEP1基因—一种新的肿瘤抑制基因和蛋白酪氨酸磷酸酶的研究进展.国外
医学肿瘤学分册，1998，25(2)：70～72
[2] Bostrom J et al. Mutation of the PTEN(MMACI) tumor suppressor gene on a subset
of glioblastomas bat not on meningiomas with loss of chromosome arm 10g ,Cancer Res ,1998 Jan 1;58 (1):29～33
, 百拇医药 [3] Cairms-P et al.Freguemt inactivation of PTEN/MMACI in primary prostate
cancer, Cancer Res .1997 Nov 15;57(22):4997～5000
[4] Guldberg P et al. Disruption of the MMACI/PTEN gene by deletion or mutation
is a freguent event in malignant melanoma. Cancer Res,1997 sep 1;57(17);3660
～3663
[5] Rhei E et al ,Mutation analysis of the putative tumor suppressor gene
, 百拇医药
PTEN/MMACI in primany breast carcinomas. Cancer Res, 1997 sep 1; 57(15):3657
～3659
[6] Gonxalez-Aulaeta M, et al. Methylation of the 5’CPG island of the p16/CDKN2
tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates
with gene silencing , Cancer Res, 1995,55:4531～4535
责编：杨自革
收稿：1999—05—04, 百拇医药