电针对佐剂性关节炎大鼠炎症局部β-EP和LEK含量的影响
作者：赵仓焕，杨介宾，宋开源，罗永芬，梁繁荣
单位：赵仓焕(暨南大学医学院第一附属医院针灸科，广州 510630)；杨介宾，宋开源，罗永芬，梁繁荣(成都中医药大学针推学院，成都 610075)
关键词：电针；佐剂性关节炎；β-内啡肽(β-EP)；亮脑啡肽(LEK)
中国中医基础医学杂志990823 摘 要 目的 观察电针(EA)对佐剂性关节炎(AA)大鼠镇痛时炎症局部β-内啡肽(β-EP)和亮脑啡肽(LEK)含量的变化。方法 用福氏完全佐剂造模，以辐射热灯照射右后足垫部，引起动物热痛缩腿反应潜伏期来判定痛阈，用放射免疫分析方法测定β-EP和LEK含量。结果 EA和AA大鼠镇痛时，能引起炎症局部β-EP和LEK含量的增加。提示EA可通过促进炎症痛大鼠炎症局部β-EP和LEK的释放，实现外周的镇痛效应。
在对炎症痛外周镇痛机制研究方面，国外学者利用佐剂性关节炎(AA)研究时发现，炎症局部浸润的免疫细胞中含有大量的内源性阿片肽(EOP)[1]，国内学者也证明，AA形成时炎症痛本身可激活EOP系统，以制约痛反应及痛觉过敏，电针(EA)对炎症局部的痛敏有特异性的对抗作用，在EA治疗AA时炎症局部的EOP系统参与了外周镇痛机制[2、3]，但何种EOP参与了电针的外周镇痛机制?EA镇痛时炎症局部EOP合成和释放是否增加?还很少见报道。为此，我们以AA大鼠为炎症痛模型，以放免测定法观察了EA对AA大鼠镇痛时炎症局部β-内啡肽(β-EP)和亮脑啡肽(LEK)含量的变化，以期进一步探讨EA对炎症痛镇痛的外周机制。
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材料与方法
1 动物选择
选用健康SD成年大鼠34只，体重200±20g，雌雄各半，由四川省抗菌素工业研究所实验动物中心提供。
2 分组及处理
实验开始时，将动物随机分为4组，并分别予以相应处理。对照组：8只，不造模不治疗；模型组：8只，于实验第1d在大鼠右后足由足垫部向踝关节方向注入福氏(Freund's)完全佐剂(配制方法参照有关文献[4]，内含卡介苗为8mg/ml)0.1ml;EA组：10只，于实验第1d造模，其方法同模型组，实验第2d开始每天EA治疗1次，连续6d。EA方法：先将大鼠用鼠夹固定，选取右后肢的昆仑和悬钟穴(取穴依据有关文献[5]，并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位)，用0.5寸毫针，直刺0.3～0.5cm，连接WQ-10C型多用电子穴位测定治疗仪，选用疏密波型，频率20Hz～100Hz，电压3V，强度由小逐渐增加，EA时间20min；单针组：8只，不造模做EA治疗，方法同EA组。
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3 指标检测方法
3.1 痛阈检测方法
参照有关文献[6]，以辐射热灯照射(右后足垫部)引起动物热痛缩腿反应的潜伏期来判定。动物处理完后共测3次，间隔5min～10min，取3次平均值作为痛阈值。
3.2 β-EP和LEK含量的测定
实验第7d治疗及处理后，取大鼠右后足垫部皮肤及皮下组织一块，约30mg，准确称重后立即置100℃生理盐水中煮5min。取出后加1N HAC 1ml匀浆，2h～3h后加入1N NaOH 1ml，低温离心，取上清-20℃以下保存，参照药盒所附《神经肽放免药盒使用说明书》及有关文献报道所述方法[7]测定。
4 实验数据的统计方法
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实验数据采用方差分析和q检验(Newman-Keuls法)处理。
结果与分析
1 EA对AA大鼠痛阈的影响(见表1)
表1 EA对AA大鼠痛阈的影响(s) 组 别
动物数
痛阈(
±s)
对照组
7
5.66±0.42
模型组
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8
4.29±0.40●●
EA组
9
6.04±0.65★★
单针组
8
8.28±0.81●●★★▲▲
注： 与对照组比较：● P<0.05；●● P<0.01;与模型组比较：★ P<0.05，★★ P<0.01；与EA组比较：▲ P<0.05，▲▲ P<0.01(下同)。
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表1所示为实验第7d所测指标数据，其中实验中对照组和EA组各有1只动物死亡(下同)。从表1中可知，模型组痛阈明显低于对照组(P<0.01)，说明炎症痛模型痛敏的存在；EA组痛阈明显高于模型组(P<0.01)，与对照组无差异(P>0.05)，说明EA治疗能够使炎症痛模型的痛敏症状得以改善，以至于恢复到正常水平；单针组痛阈明显高于对照组、模型组和EA组(P<0.01)，说明EA对正常动物的痛阈有明显的提高作用。
2 EA对AA大鼠炎症局部β-EP含量的影响(见表2)
表2 EA对AA大鼠炎症局部β-EP含量的影响(pg/mg) 组 别
动物数
炎症局部β-EP(±s)
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对照组
7
0.57±0.48
模型组
8
4.65±2.92●●
EA组
9
8.14±2.78●●★★
单针组
8
1.67±1.16★★▲▲
, 百拇医药
从表2中得知，模型组炎症局部β-EP含量明显高于对照组(P<0.01)，说明炎症痛本身即可激活EOP系统。EA组炎症局部β-EP明显高于模型组(P<0.01)，说明EA治疗可促进炎症局部β-EP的释放；单针组足垫局部B-EP含量明显低于EA组(P<0.01)，且与对照组无差异(P>0.05)，说明炎症痛模型EA治疗后引起的炎症局部β-EP含量的增加主要是来源于炎症局部，而不是中枢或其它部位。
3 EA对AA大鼠炎症局部LEK含量的影响(见表3)
表3 EA对AA大鼠炎症局部LEK含量的影响(pg/mg) 组 别
动物数
炎症局部LEK(±s)
对照组
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7
0.75±0.31
模型组
8
8.84±6.32●
EA组
9
14.42±7.32●●★
单针组
8
2.54±2.01★▲▲
从表3中得知，模型组炎症局部LEK含量高于对照组(P<0.05)，EA组炎症局部LEK含量高于模型组(P<0.05)，单针组足垫局部LEK含量明显低于EA组(P<0.01)，且与对照组无差异(P>0.05)，以上各项说明的意义同β-EP。
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讨论
自从Hughes等于1975年发现脑啡肽以来，至今已发现许多种EOP，按其前体来源，分属于脑啡肽族、内啡肽族和强啡肽族。EOP的作用非常广泛，其中以镇痛方面的研究最为深入。目前已经证实EOP广泛分布于中枢神经系统内与痛及镇痛有关的脑区，大量研究也证实，中枢EOP参与了针刺的镇痛过程[8、9]。
EOP的外周镇痛作用只是近些年才引起了人们注意，有关机制的研究也开始得到重视。Stein等报道，冷水游泳(CWS，一种应激刺激)对单侧AA大鼠的患肢具有明显的镇痛作用，而对健侧影响不大，该作用并可为足底注射而不是全身注射纳洛酮所阻断，表明它属于阿片样外周镇痛作用[10]。Smith等发现N-甲基吗啡(不能透过血脑屏障)只对醋酸扭体反应(为炎症刺激)有抑制作用，而不能影响热板测痛的实验结果，表明阿片样的外周镇痛作用可能对炎症痛具有特异的选择性[11]。进一步的研究表明，炎症局部皮下浸润的各种免疫细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞)中存在大量的EOP[12]。这些EOP可自发地释放，作用于炎症局部感觉神经元外周末梢上的阿片受体，实现局部的镇痛作用。当在应激刺激时(如CWS)，这些免疫细胞中的EOP释放增加，便产生了增强的镇痛效应[13]。朱氏及胡氏等也发现，AA形成时炎症痛本身可激活EOP系统，以制约痛反应及痛觉过敏，同时发现EA对炎症局部的痛敏有特异性的对抗作用，在EA治疗炎症痛时炎症局部EOP系统参与了外周镇痛机制[2、3]。本实验在此基础上，进一步证明了EA镇痛时可引起AA大鼠炎症局部EOP中β-EP和LEK含量的增加，表明EA可促进AA大鼠炎症局部的EOP释放，其作用于炎症局部的感觉神经元末梢的阿片受体，产生EA的外周镇痛效应，这可能是EA对炎症痛镇痛的外周机制之一。
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作者简介：赵仓焕，男，37岁，暨南大学医学院附属医院针灸科科主任，博士，副主任医师，主要从事针刺镇痛机理的研究。
参考文献
[1]Stein C.Peripherral Mechanisms of Opioid Analgesia.Anesth Analg,1993，76:182.
[2]朱丽霞，黎春元，吉长福，等.阿片系统在针刺镇痛外周机制中的作用.针刺研究，1993，18(3)：214.
[3]胡三觉，沙建慧，顾建文，等.针刺对炎症性痛过敏的外周镇痛作用.针刺研究，1991，16(3，4)：236.
[4]胡月娟.见李仪奎主编.中药药理实验方法学.上海：上海科学技术出版社，1991.305.
, 百拇医药
[5]中国畜牧兽医学会.中国兽医针灸学.北京：农业出版社，1984.213.
[6]赵飞跃，朱丽霞，李艳华.电针对大鼠急性实验性关节炎的资料作用.针刺研究，1990，15(3)：197.
[7]祝元祥，管小滨.β-内啡肽的抗血清制备及其放免测定.第二军医大学学报，1986，7(5)：322.
[8]韩济生.中枢神经介质概论.第2版.北京：科学出版社，1980.438.
[9]韩济生.神经科学纲要.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.502.
[10]Stein C,Gramsch C,Herz A.Intrinsic mechanisms of antinociception in inflammation.Local opioid receptors and β-endorphin.J Neurosci,1990,10:1292.
, 百拇医药
[11]Smith TW,Buchan P,Parsons DN,et al.Peripheral antinociceptive effects of N-methlyl morphine.Life Sci,1982，31:1205.
[12]Stein C,Hassan AHS,Przewlocki R,et al.Opioids from immunocytes interact with receptors on sensory nerves to inhibit nociception in inflammation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:5935.
[13]罗 非，韩济生.阿片样物质的外周镇痛作用.生理科学进展，1993，24(1)：64.
(收稿日期 1999—05—06 修回日期 1999—06—03), http://www.100md.com
单位：赵仓焕(暨南大学医学院第一附属医院针灸科，广州 510630)；杨介宾，宋开源，罗永芬，梁繁荣(成都中医药大学针推学院，成都 610075)
关键词：电针；佐剂性关节炎；β-内啡肽(β-EP)；亮脑啡肽(LEK)
中国中医基础医学杂志990823 摘 要 目的 观察电针(EA)对佐剂性关节炎(AA)大鼠镇痛时炎症局部β-内啡肽(β-EP)和亮脑啡肽(LEK)含量的变化。方法 用福氏完全佐剂造模，以辐射热灯照射右后足垫部，引起动物热痛缩腿反应潜伏期来判定痛阈，用放射免疫分析方法测定β-EP和LEK含量。结果 EA和AA大鼠镇痛时，能引起炎症局部β-EP和LEK含量的增加。提示EA可通过促进炎症痛大鼠炎症局部β-EP和LEK的释放，实现外周的镇痛效应。
在对炎症痛外周镇痛机制研究方面，国外学者利用佐剂性关节炎(AA)研究时发现，炎症局部浸润的免疫细胞中含有大量的内源性阿片肽(EOP)[1]，国内学者也证明，AA形成时炎症痛本身可激活EOP系统，以制约痛反应及痛觉过敏，电针(EA)对炎症局部的痛敏有特异性的对抗作用，在EA治疗AA时炎症局部的EOP系统参与了外周镇痛机制[2、3]，但何种EOP参与了电针的外周镇痛机制?EA镇痛时炎症局部EOP合成和释放是否增加?还很少见报道。为此，我们以AA大鼠为炎症痛模型，以放免测定法观察了EA对AA大鼠镇痛时炎症局部β-内啡肽(β-EP)和亮脑啡肽(LEK)含量的变化，以期进一步探讨EA对炎症痛镇痛的外周机制。
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材料与方法
1 动物选择
选用健康SD成年大鼠34只，体重200±20g，雌雄各半，由四川省抗菌素工业研究所实验动物中心提供。
2 分组及处理
实验开始时，将动物随机分为4组，并分别予以相应处理。对照组：8只，不造模不治疗；模型组：8只，于实验第1d在大鼠右后足由足垫部向踝关节方向注入福氏(Freund's)完全佐剂(配制方法参照有关文献[4]，内含卡介苗为8mg/ml)0.1ml;EA组：10只，于实验第1d造模，其方法同模型组，实验第2d开始每天EA治疗1次，连续6d。EA方法：先将大鼠用鼠夹固定，选取右后肢的昆仑和悬钟穴(取穴依据有关文献[5]，并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位)，用0.5寸毫针，直刺0.3～0.5cm，连接WQ-10C型多用电子穴位测定治疗仪，选用疏密波型，频率20Hz～100Hz，电压3V，强度由小逐渐增加，EA时间20min；单针组：8只，不造模做EA治疗，方法同EA组。
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3 指标检测方法
3.1 痛阈检测方法
参照有关文献[6]，以辐射热灯照射(右后足垫部)引起动物热痛缩腿反应的潜伏期来判定。动物处理完后共测3次，间隔5min～10min，取3次平均值作为痛阈值。
3.2 β-EP和LEK含量的测定
实验第7d治疗及处理后，取大鼠右后足垫部皮肤及皮下组织一块，约30mg，准确称重后立即置100℃生理盐水中煮5min。取出后加1N HAC 1ml匀浆，2h～3h后加入1N NaOH 1ml，低温离心，取上清-20℃以下保存，参照药盒所附《神经肽放免药盒使用说明书》及有关文献报道所述方法[7]测定。
4 实验数据的统计方法
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实验数据采用方差分析和q检验(Newman-Keuls法)处理。
结果与分析
1 EA对AA大鼠痛阈的影响(见表1)
表1 EA对AA大鼠痛阈的影响(s) 组 别
动物数
痛阈(
±s)对照组
7
5.66±0.42
模型组
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8
4.29±0.40●●
EA组
9
6.04±0.65★★
单针组
8
8.28±0.81●●★★▲▲
注： 与对照组比较：● P<0.05；●● P<0.01;与模型组比较：★ P<0.05，★★ P<0.01；与EA组比较：▲ P<0.05，▲▲ P<0.01(下同)。
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表1所示为实验第7d所测指标数据，其中实验中对照组和EA组各有1只动物死亡(下同)。从表1中可知，模型组痛阈明显低于对照组(P<0.01)，说明炎症痛模型痛敏的存在；EA组痛阈明显高于模型组(P<0.01)，与对照组无差异(P>0.05)，说明EA治疗能够使炎症痛模型的痛敏症状得以改善，以至于恢复到正常水平；单针组痛阈明显高于对照组、模型组和EA组(P<0.01)，说明EA对正常动物的痛阈有明显的提高作用。
2 EA对AA大鼠炎症局部β-EP含量的影响(见表2)
表2 EA对AA大鼠炎症局部β-EP含量的影响(pg/mg) 组 别
动物数
炎症局部β-EP(
±s), http://www.100md.com
对照组
7
0.57±0.48
模型组
8
4.65±2.92●●
EA组
9
8.14±2.78●●★★
单针组
8
1.67±1.16★★▲▲
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从表2中得知，模型组炎症局部β-EP含量明显高于对照组(P<0.01)，说明炎症痛本身即可激活EOP系统。EA组炎症局部β-EP明显高于模型组(P<0.01)，说明EA治疗可促进炎症局部β-EP的释放；单针组足垫局部B-EP含量明显低于EA组(P<0.01)，且与对照组无差异(P>0.05)，说明炎症痛模型EA治疗后引起的炎症局部β-EP含量的增加主要是来源于炎症局部，而不是中枢或其它部位。
3 EA对AA大鼠炎症局部LEK含量的影响(见表3)
表3 EA对AA大鼠炎症局部LEK含量的影响(pg/mg) 组 别
动物数
炎症局部LEK(
±s)对照组
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7
0.75±0.31
模型组
8
8.84±6.32●
EA组
9
14.42±7.32●●★
单针组
8
2.54±2.01★▲▲
从表3中得知，模型组炎症局部LEK含量高于对照组(P<0.05)，EA组炎症局部LEK含量高于模型组(P<0.05)，单针组足垫局部LEK含量明显低于EA组(P<0.01)，且与对照组无差异(P>0.05)，以上各项说明的意义同β-EP。
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讨论
自从Hughes等于1975年发现脑啡肽以来，至今已发现许多种EOP，按其前体来源，分属于脑啡肽族、内啡肽族和强啡肽族。EOP的作用非常广泛，其中以镇痛方面的研究最为深入。目前已经证实EOP广泛分布于中枢神经系统内与痛及镇痛有关的脑区，大量研究也证实，中枢EOP参与了针刺的镇痛过程[8、9]。
EOP的外周镇痛作用只是近些年才引起了人们注意，有关机制的研究也开始得到重视。Stein等报道，冷水游泳(CWS，一种应激刺激)对单侧AA大鼠的患肢具有明显的镇痛作用，而对健侧影响不大，该作用并可为足底注射而不是全身注射纳洛酮所阻断，表明它属于阿片样外周镇痛作用[10]。Smith等发现N-甲基吗啡(不能透过血脑屏障)只对醋酸扭体反应(为炎症刺激)有抑制作用，而不能影响热板测痛的实验结果，表明阿片样的外周镇痛作用可能对炎症痛具有特异的选择性[11]。进一步的研究表明，炎症局部皮下浸润的各种免疫细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞)中存在大量的EOP[12]。这些EOP可自发地释放，作用于炎症局部感觉神经元外周末梢上的阿片受体，实现局部的镇痛作用。当在应激刺激时(如CWS)，这些免疫细胞中的EOP释放增加，便产生了增强的镇痛效应[13]。朱氏及胡氏等也发现，AA形成时炎症痛本身可激活EOP系统，以制约痛反应及痛觉过敏，同时发现EA对炎症局部的痛敏有特异性的对抗作用，在EA治疗炎症痛时炎症局部EOP系统参与了外周镇痛机制[2、3]。本实验在此基础上，进一步证明了EA镇痛时可引起AA大鼠炎症局部EOP中β-EP和LEK含量的增加，表明EA可促进AA大鼠炎症局部的EOP释放，其作用于炎症局部的感觉神经元末梢的阿片受体，产生EA的外周镇痛效应，这可能是EA对炎症痛镇痛的外周机制之一。
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作者简介：赵仓焕，男，37岁，暨南大学医学院附属医院针灸科科主任，博士，副主任医师，主要从事针刺镇痛机理的研究。
参考文献
[1]Stein C.Peripherral Mechanisms of Opioid Analgesia.Anesth Analg,1993，76:182.
[2]朱丽霞，黎春元，吉长福，等.阿片系统在针刺镇痛外周机制中的作用.针刺研究，1993，18(3)：214.
[3]胡三觉，沙建慧，顾建文，等.针刺对炎症性痛过敏的外周镇痛作用.针刺研究，1991，16(3，4)：236.
[4]胡月娟.见李仪奎主编.中药药理实验方法学.上海：上海科学技术出版社，1991.305.
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[5]中国畜牧兽医学会.中国兽医针灸学.北京：农业出版社，1984.213.
[6]赵飞跃，朱丽霞，李艳华.电针对大鼠急性实验性关节炎的资料作用.针刺研究，1990，15(3)：197.
[7]祝元祥，管小滨.β-内啡肽的抗血清制备及其放免测定.第二军医大学学报，1986，7(5)：322.
[8]韩济生.中枢神经介质概论.第2版.北京：科学出版社，1980.438.
[9]韩济生.神经科学纲要.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.502.
[10]Stein C,Gramsch C,Herz A.Intrinsic mechanisms of antinociception in inflammation.Local opioid receptors and β-endorphin.J Neurosci,1990,10:1292.
, 百拇医药
[11]Smith TW,Buchan P,Parsons DN,et al.Peripheral antinociceptive effects of N-methlyl morphine.Life Sci,1982，31:1205.
[12]Stein C,Hassan AHS,Przewlocki R,et al.Opioids from immunocytes interact with receptors on sensory nerves to inhibit nociception in inflammation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:5935.
[13]罗 非，韩济生.阿片样物质的外周镇痛作用.生理科学进展，1993，24(1)：64.
(收稿日期 1999—05—06 修回日期 1999—06—03), http://www.100md.com