软肝煎防治大鼠免疫损伤性肝纤维化的实验研究
作者：付修文，车念聪，高连印，钱 英
单位：北京联合大学中医药学院，北京 100700
关键词：软肝煎；免疫损伤性；肝纤维化
中国中医基础医学杂志990809 “软肝煎”是我院钱英教授临床应用二十余年治疗慢性病毒性肝炎、早期肝硬化的有效经验方。近年来经临床验证该方具有改善肝功能、回缩肝脾、抑制病毒复制、降低肝纤维化血清学指标HA、P Ⅲ P的作用[1、2]。为了证明“软肝煎”抗肝纤维化作用及探讨其作用机理，我们采用北京友谊医院1989年推荐的免疫损伤性肝纤维化动物模型[3]，观察了“软肝煎”抗大鼠免疫损伤性肝纤维化的作用，取得了有意义的结果。现报告如下：
材料与方法
1 药物
, http://www.100md.com
软肝煎由炙鳖甲、女贞子、党参、白术、丹参、郁金、半边莲等16味中药组成(购于北京同仁堂药店)。水煎成生药浓度为2 g/ml，用量为2 ml/100 g/d(以体重计算相当于人用量的7倍)。
2 动物分组及造模方法
2.1 动物
选取Wistar系成年、健康、体重为160 g～180 g大鼠60只，雌雄各半，购自北京医科大学实验动物科学部。
2.2 造模方法
以人血清白蛋白(由北京市血液中心提供)用生理盐水稀释加不完全福氏佐剂，于大鼠皮下多点注射0.5 ml(内含白蛋白4 mg)，间隔14 d(1～2次)及10 d(2～4次)，共4次(第一阶段)。末次免疫结束当天取血测抗体，取抗体阳性大鼠于尾静脉攻击注射白蛋白，每周2次，白蛋白剂量由2.5 mg/只，渐增至5.0 mg/只，共16次(第二阶段)。最后一次攻击注射后3d，拉椎处死动物，迅速取肝组织做病理及免疫荧光组织化学检查。
, 百拇医药
2.3 实验分组
先将实验动物随机分为三组：①正常对照组20只；②病理模型组20只；③“软肝煎”防治组20只。
②③组均进行第一阶段白蛋白免疫攻击(24 d前)，将③组测得白蛋白抗体阳性大鼠挑出并开始灌服“软肝煎”汤剂(60d)，继续第二阶段白蛋白攻击，第②组抗体阳性大鼠同时开始第二阶段白蛋白攻击。
由于有未产生抗体及死亡的大鼠，最后将3组大鼠随机各选出10只于实验结束后处死。
3 染色方法
处死大鼠后速取肝组织，每例标本均为2份，1份经固定、包埋、切片，行HE、Masson、VG、网织纤维4种染色。另一份标本立即置于西德Leica-1800型恒冷切片机冷冻室(-20℃)，5μm厚连续切片，行Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫荧光染色。封固后，用Olmpus荧光显微镜观察、摄影和记录。
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结果
1 光学显微镜观察
1.1 肝纤维化病变程度参照文献[4]分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。
0级 肝组织正常，无纤维组织增生。
Ⅰ级 汇管区及窦隙有少量纤维增生。
Ⅱ级 肝小叶结构有破坏，可见纤维组织增生，纤维间隔形成不完整。
Ⅲ级 肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，假小叶广泛形成。
1.2 4种染色观察
肝硬化假小叶的纤维间隔3种特殊染色观察 masson染色显示纤维间隔胶原纤维呈绿色；网织纤维染色显示纤维间隔网织纤维呈黑色；VG染色显示纤维间隔胶原纤维呈红色(肝硬化纤维间隔中主要为胶原纤维和网织纤维)。
, 百拇医药
1.3 各组肝脏病理与4种染色结果
表1 各组肝脏病理与4种染色结果 组 别
鼠数(只)
HE染色
masson染色
网织染色
VG染色
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
, 百拇医药
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
对照组
10
10
10
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10
10
肝损伤组
10
10
10
10
10
软肝煎组
10
6
4
6
4
, 百拇医药
6
4
6
4
注：经x2检验： x2=8.51，P<0.01。
观察表明：
1.3.1 正常对照组 肝小叶结构正常，肝组胞无明显变性、坏死，汇管区不扩大。
1.3.2 肝损伤组 10只大鼠均为正常肝小叶结构破坏，增生的纤维经组织分割形成广泛的假小叶。假小叶大小较一致，纤维间隔较窄而一致。 汇管区纤维增生、扩大，无明显炎细胞浸润及淤胆现象。部分肝细胞变性。
1.3.3 “软肝煎”防治组 肝小叶结构基本正常(6只)或肝小叶破坏程度减轻，部分纤维间隔形成不完整，部分无明显肝硬变。
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以上结果表明：经“软肝煎”灌服2个月，防治组大鼠肝纤维化程度较病理损伤组明显减轻(P<0.01)，说明“软肝煎”对大鼠免疫损伤性肝纤维化有较好的防治作用。
2 免疫荧光染色Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白观察
Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白免疫荧光染色荧光呈较亮的黄绿色。
2.1 正常对照组 未见特异性荧光。
2.2 肝损伤组 主要分布于假小叶；纤维间隔及汇管区增生的纤维组织中，荧光较亮，分布较广而连续。
2.3 “软肝煎”防治组 荧光弱，有的呈间断性分布。
表2 免疫荧光染色结果 组 别
鼠(只)
, 百拇医药
Ⅰ型胶原
Ⅲ型胶原
(-)
(+)
(-)
(+)
对照组
10
10
10
肝损伤组
10
10
, 百拇医药
10
软肝煎组
10
6
4
7
3
注：Ⅰ型胶原治疗组与肝损伤组比较，经x2检验：x2=8.57，P<0.01。
Ⅲ型胶原治疗组与肝损伤组比较，经x2检验：x2=10.77，P<0.01。
结果表明，“软肝煎”对白蛋白免疫损伤性肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白形成有明显抑制作用而且与肝损伤组相比有显著性差异，P<0.01。
, 百拇医药
讨论
肝纤维化是指在各种致病因子持续作用下，造成肝脏纤维组织异常增生，特点为汇管区肝小叶内有大量纤维组织增生和沉积，但尚未形成小叶内间隔，是肝硬化的早期阶段，其病变有一定可逆性，但若病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝硬化。由肝炎病毒造成肝纤维化及肝硬化的机制中，免疫因素起主要作用[5]。研究表明，至今尚无病毒性肝炎引起的肝纤维化动物模型，而免疫性肝纤维化模型大鼠的病变与表现均类似于人类门脉性肝纤维化[3、6]。因此，我们采用人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型，旨在验证“软肝煎”有治疗慢性病毒性肝炎、早期肝硬化的过程中有无抗肝纤维化的作用。
由于肝纤维化是造成慢性肝炎、早期肝硬化肝功能异常和影响预后的重要因素，也是慢性肝炎向肝硬化发展的必经阶段，因此抗肝纤维化应是治疗上述疾病的主要治则之一。
, http://www.100md.com
实验研究证明，“软肝煎”可明显抑制大鼠肝纤维化主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原的形成，并能使由胶原构成的网状纤维、结缔组织增生、沉积、沿小叶间及在小叶边延伸受到抑制，说明本方具有良好的抗肝纤维化作用。
中医古籍中并无肝纤维化、肝硬化等病名，但依据症状、体征等可归属于积、膨胀等范畴。目前，中医对肝纤维化的发病机理的认识多数学者认为，是“本虚标实”证，病位在肝、脾、肾。虚者为血虚不能养肝，脾虚运化失常，肾虚阴阳衰败；实者，气滞、血瘀，湿热为患。其治法现已不是单一的活血化瘀，而是与疏肝、益气、养阴、补肾、健脾等治法辨证组合应用，并具有较好的抗肝纤维化作用。
“软肝煎”是依据明.李中梓：肝肾同源、乙癸同治及汉.张仲景“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”及中医有关湿、痰、瘀相关合病的理论，并结合现代中西医防治肝纤维化的研究进展，从“一贯煎”、“鳖甲煎丸”中优选药物化裁组成，方中炙鳖甲、女贞子为君药，滋补肝肾，养血柔肝，软坚软结；党参、白术健脾益气为臣药，佐以丹参、三七活血化瘀通络；郁金、厚朴，理气、化湿除痰。纵观全方，其组方药物据现代药理研究大部分具有抗肝纤维化的组份及作用。其“滋补肝肾，健脾行气，化瘀软坚，利湿解毒”之法则基本符合目前抗肝纤维化的学术思想，并且在临床及此次实验中均收到了较好的抗肝纤维化效果，但其作用机理还需今后进一步深入研究探讨。
, 百拇医药
作者简介：付修文，北京联合大学中医药学院肝病研究中心主治医师，医学硕士。
参考文献
[1]付修文.肝肾相关与慢性肝病.北京中医，1995，(2)：48.
[2]高连印，等.软肝煎Ⅱ号治疗慢性活动型乙型肝炎及肝纤维化临床观察.北京中医，1997，(4)：46.
[3]王宝恩，等.实验性免疫性肝纤维化模型的研究.中华医学杂志，1989，69(9)：503.
[4]Ruwart MJ,et al. 16-Dimethyl Prostglandin Ez Delays Lollage Formation in Nutritional Injuryin Rat Liver Hepatology,1989，8:61.
[5]王宝恩，等.肝脏病学进展.上海：上海科学技术文献出版社，1991：180.
[6]朱起贵，等.牛血清白蛋白致免疫性肝纤维化动物模型的研究.中华病理学杂志，1993，22(2)：121.
[7]张孟仁，张育轩.中医药防治实验肝损伤及肝纤维组织增生的研究概况.中医杂志，1993，34(2)：114.
(收稿日期 1998—12—04 修回日期 1998—01—22), 百拇医药
单位：北京联合大学中医药学院，北京 100700
关键词：软肝煎；免疫损伤性；肝纤维化
中国中医基础医学杂志990809 “软肝煎”是我院钱英教授临床应用二十余年治疗慢性病毒性肝炎、早期肝硬化的有效经验方。近年来经临床验证该方具有改善肝功能、回缩肝脾、抑制病毒复制、降低肝纤维化血清学指标HA、P Ⅲ P的作用[1、2]。为了证明“软肝煎”抗肝纤维化作用及探讨其作用机理，我们采用北京友谊医院1989年推荐的免疫损伤性肝纤维化动物模型[3]，观察了“软肝煎”抗大鼠免疫损伤性肝纤维化的作用，取得了有意义的结果。现报告如下：
材料与方法
1 药物
, http://www.100md.com
软肝煎由炙鳖甲、女贞子、党参、白术、丹参、郁金、半边莲等16味中药组成(购于北京同仁堂药店)。水煎成生药浓度为2 g/ml，用量为2 ml/100 g/d(以体重计算相当于人用量的7倍)。
2 动物分组及造模方法
2.1 动物
选取Wistar系成年、健康、体重为160 g～180 g大鼠60只，雌雄各半，购自北京医科大学实验动物科学部。
2.2 造模方法
以人血清白蛋白(由北京市血液中心提供)用生理盐水稀释加不完全福氏佐剂，于大鼠皮下多点注射0.5 ml(内含白蛋白4 mg)，间隔14 d(1～2次)及10 d(2～4次)，共4次(第一阶段)。末次免疫结束当天取血测抗体，取抗体阳性大鼠于尾静脉攻击注射白蛋白，每周2次，白蛋白剂量由2.5 mg/只，渐增至5.0 mg/只，共16次(第二阶段)。最后一次攻击注射后3d，拉椎处死动物，迅速取肝组织做病理及免疫荧光组织化学检查。
, 百拇医药
2.3 实验分组
先将实验动物随机分为三组：①正常对照组20只；②病理模型组20只；③“软肝煎”防治组20只。
②③组均进行第一阶段白蛋白免疫攻击(24 d前)，将③组测得白蛋白抗体阳性大鼠挑出并开始灌服“软肝煎”汤剂(60d)，继续第二阶段白蛋白攻击，第②组抗体阳性大鼠同时开始第二阶段白蛋白攻击。
由于有未产生抗体及死亡的大鼠，最后将3组大鼠随机各选出10只于实验结束后处死。
3 染色方法
处死大鼠后速取肝组织，每例标本均为2份，1份经固定、包埋、切片，行HE、Masson、VG、网织纤维4种染色。另一份标本立即置于西德Leica-1800型恒冷切片机冷冻室(-20℃)，5μm厚连续切片，行Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫荧光染色。封固后，用Olmpus荧光显微镜观察、摄影和记录。
, http://www.100md.com
结果
1 光学显微镜观察
1.1 肝纤维化病变程度参照文献[4]分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。
0级 肝组织正常，无纤维组织增生。
Ⅰ级 汇管区及窦隙有少量纤维增生。
Ⅱ级 肝小叶结构有破坏，可见纤维组织增生，纤维间隔形成不完整。
Ⅲ级 肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，假小叶广泛形成。
1.2 4种染色观察
肝硬化假小叶的纤维间隔3种特殊染色观察 masson染色显示纤维间隔胶原纤维呈绿色；网织纤维染色显示纤维间隔网织纤维呈黑色；VG染色显示纤维间隔胶原纤维呈红色(肝硬化纤维间隔中主要为胶原纤维和网织纤维)。
, 百拇医药
1.3 各组肝脏病理与4种染色结果
表1 各组肝脏病理与4种染色结果 组 别
鼠数(只)
HE染色
masson染色
网织染色
VG染色
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
, 百拇医药
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
对照组
10
10
10
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10
10
肝损伤组
10
10
10
10
10
软肝煎组
10
6
4
6
4
, 百拇医药
6
4
6
4
注：经x2检验： x2=8.51，P<0.01。
观察表明：
1.3.1 正常对照组 肝小叶结构正常，肝组胞无明显变性、坏死，汇管区不扩大。
1.3.2 肝损伤组 10只大鼠均为正常肝小叶结构破坏，增生的纤维经组织分割形成广泛的假小叶。假小叶大小较一致，纤维间隔较窄而一致。 汇管区纤维增生、扩大，无明显炎细胞浸润及淤胆现象。部分肝细胞变性。
1.3.3 “软肝煎”防治组 肝小叶结构基本正常(6只)或肝小叶破坏程度减轻，部分纤维间隔形成不完整，部分无明显肝硬变。
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以上结果表明：经“软肝煎”灌服2个月，防治组大鼠肝纤维化程度较病理损伤组明显减轻(P<0.01)，说明“软肝煎”对大鼠免疫损伤性肝纤维化有较好的防治作用。
2 免疫荧光染色Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白观察
Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白免疫荧光染色荧光呈较亮的黄绿色。
2.1 正常对照组 未见特异性荧光。
2.2 肝损伤组 主要分布于假小叶；纤维间隔及汇管区增生的纤维组织中，荧光较亮，分布较广而连续。
2.3 “软肝煎”防治组 荧光弱，有的呈间断性分布。
表2 免疫荧光染色结果 组 别
鼠(只)
, 百拇医药
Ⅰ型胶原
Ⅲ型胶原
(-)
(+)
(-)
(+)
对照组
10
10
10
肝损伤组
10
10
, 百拇医药
10
软肝煎组
10
6
4
7
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注：Ⅰ型胶原治疗组与肝损伤组比较，经x2检验：x2=8.57，P<0.01。
Ⅲ型胶原治疗组与肝损伤组比较，经x2检验：x2=10.77，P<0.01。
结果表明，“软肝煎”对白蛋白免疫损伤性肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白形成有明显抑制作用而且与肝损伤组相比有显著性差异，P<0.01。
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讨论
肝纤维化是指在各种致病因子持续作用下，造成肝脏纤维组织异常增生，特点为汇管区肝小叶内有大量纤维组织增生和沉积，但尚未形成小叶内间隔，是肝硬化的早期阶段，其病变有一定可逆性，但若病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝硬化。由肝炎病毒造成肝纤维化及肝硬化的机制中，免疫因素起主要作用[5]。研究表明，至今尚无病毒性肝炎引起的肝纤维化动物模型，而免疫性肝纤维化模型大鼠的病变与表现均类似于人类门脉性肝纤维化[3、6]。因此，我们采用人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型，旨在验证“软肝煎”有治疗慢性病毒性肝炎、早期肝硬化的过程中有无抗肝纤维化的作用。
由于肝纤维化是造成慢性肝炎、早期肝硬化肝功能异常和影响预后的重要因素，也是慢性肝炎向肝硬化发展的必经阶段，因此抗肝纤维化应是治疗上述疾病的主要治则之一。
, http://www.100md.com
实验研究证明，“软肝煎”可明显抑制大鼠肝纤维化主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原的形成，并能使由胶原构成的网状纤维、结缔组织增生、沉积、沿小叶间及在小叶边延伸受到抑制，说明本方具有良好的抗肝纤维化作用。
中医古籍中并无肝纤维化、肝硬化等病名，但依据症状、体征等可归属于积、膨胀等范畴。目前，中医对肝纤维化的发病机理的认识多数学者认为，是“本虚标实”证，病位在肝、脾、肾。虚者为血虚不能养肝，脾虚运化失常，肾虚阴阳衰败；实者，气滞、血瘀，湿热为患。其治法现已不是单一的活血化瘀，而是与疏肝、益气、养阴、补肾、健脾等治法辨证组合应用，并具有较好的抗肝纤维化作用。
“软肝煎”是依据明.李中梓：肝肾同源、乙癸同治及汉.张仲景“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”及中医有关湿、痰、瘀相关合病的理论，并结合现代中西医防治肝纤维化的研究进展，从“一贯煎”、“鳖甲煎丸”中优选药物化裁组成，方中炙鳖甲、女贞子为君药，滋补肝肾，养血柔肝，软坚软结；党参、白术健脾益气为臣药，佐以丹参、三七活血化瘀通络；郁金、厚朴，理气、化湿除痰。纵观全方，其组方药物据现代药理研究大部分具有抗肝纤维化的组份及作用。其“滋补肝肾，健脾行气，化瘀软坚，利湿解毒”之法则基本符合目前抗肝纤维化的学术思想，并且在临床及此次实验中均收到了较好的抗肝纤维化效果，但其作用机理还需今后进一步深入研究探讨。
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作者简介：付修文，北京联合大学中医药学院肝病研究中心主治医师，医学硕士。
参考文献
[1]付修文.肝肾相关与慢性肝病.北京中医，1995，(2)：48.
[2]高连印，等.软肝煎Ⅱ号治疗慢性活动型乙型肝炎及肝纤维化临床观察.北京中医，1997，(4)：46.
[3]王宝恩，等.实验性免疫性肝纤维化模型的研究.中华医学杂志，1989，69(9)：503.
[4]Ruwart MJ,et al. 16-Dimethyl Prostglandin Ez Delays Lollage Formation in Nutritional Injuryin Rat Liver Hepatology,1989，8:61.
[5]王宝恩，等.肝脏病学进展.上海：上海科学技术文献出版社，1991：180.
[6]朱起贵，等.牛血清白蛋白致免疫性肝纤维化动物模型的研究.中华病理学杂志，1993，22(2)：121.
[7]张孟仁，张育轩.中医药防治实验肝损伤及肝纤维组织增生的研究概况.中医杂志，1993，34(2)：114.
(收稿日期 1998—12—04 修回日期 1998—01—22), 百拇医药