用分级定量RT-PCR测定中国人血清中HCV RNA
作者：郭晏海 闫小君 侯瑜 任峰玲 赵锦荣 崔大祥 韩锋产 段杰 李陕区 苏成芝
单位：中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033
关键词：丙型肝炎病毒；RNA，病毒/ 分析；聚合酶链反应
世界华人消化杂志990935
中国图书馆分类号 R 373.21
Subject headings hepatitis C virus; RNA, viral/ analysis; polymerase chain reaction
基因的定量分析对分子生物的研究有着重要的作用，而采用PCR方法进行基因定量已成为一种有效的方式. 并且，目前已有多种利用PCR进行基因定量的方法，其中以竞争PCR定量和PE公司既时定量PCR方法测定结果较为准确，应用较多既时定量PCR方法采用了特殊设计的荧光-淬灭探针和精密的既时荧光检测设备进行定量. 该方法简化的操作，提高的测定的灵敏性和准确性，但其试剂和仪器的价值目前相当昂贵，一般实验室难于承担[1]. 而竞争PCR方法虽然操作比较麻烦，但也能进行较准确的定量，适合一般实验室使用，为了进一步简化竞争PCR方法，我们对实验进行了改进，建立分级定量的方法，只用3种浓度的竞争模板与样品RNA的恒定cDNA混合进行3个PCR反应，通过测定待测模板与竞争模板的终产物荧光强度比值来确定待测RNA的初始量. 该方法也适合多个样品同时测定.
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1 材料和方法
1.1 材料 GQS-960凝胶成象分析系统(第四军医大学基因诊断技术应用研究所)，Thermolyne PCR扩增仪(美国)，Taq DNA聚合酶、dNTP和Tth酶(Promega公司). 用Beckman Du640核酸和蛋白分析仪(美国). 引物出自HCV RNA 5’端非编码区，经oligo软件设计，引物位置和序列为：C1：(51～70)5’-GTCTTCACGCAGAAAGCGTC，C2：(308～290)5’-GGGCACTCGCAAGCACC扩增片段长度为260 bp由上海深工生物工程公司合成. 竞争模板为一段克隆于PUC 19的DNA序列，其两端为C1，C2引物的互补区，其中部与相应的HCV RNA序列只差40 bp序列，为代插入片段，目的是最终分离竞争模板和HCV RNA扩增产物.
1.2 方法 竞争模板的pUC 19质粒的提取方法按文献[2]方法，用EcoRⅠ酶切使质粒线性化，用Beckman Du640核酸和蛋白分析仪进行竞争模板的定量标定. 血清按酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀方法进行血清HCV RNA提取. 反转录合成cDNA：将HCV RNA用Tth酶反转录合成HCV RNA的cDNA具体过程按文献[3]的方法. 分级定量PCR扩增：将反转录合成的cDNA等量取3份分别与3个定量反应管的PCR反应液混合，3个PCR反应液中分别含有102cop，104cop，106cop的竞争模板. PCR反应成分为50 mmol/ L KCl，100 mmol/ L Tris-HCl pH 8.3，1.5 mmol/ L MgCl2，200 μmol/ L dNTP，C1和C2引物各30 pmol, Taq DNA聚合酶1 U，反应总体积30 μL，反应程序：94℃，预变性2min，然后94℃ 30s，55℃ 40s，71℃ 50s循环35次，最后72℃延伸5min，最后各准确取10 μL PCR反应物. 进行3%琼脂凝胶电泳，荧光强度测定：将用溴化乙锭染色的凝胶板置于GQS-960型凝胶定象分析系统上扫描，测定待测模板和竞争模板的PCR产物的荧光强度比值，并用微机计算结果.
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2 结果
2.1 竞争模板与待测模板cDNA扩增效率 对3个待测模板cDNA与竞争模板PCR产物荧光强度比分别为10∶1，1∶1，1∶10的反应液进行106倍稀释，各取3 μL稀释后的溶液进行再次PCR扩增，扩增条件与原PCR相同，循环35次最后测定两者荧光强度之比仍为10∶1，1∶1，1∶10，说明所用引物对待测模板和竞争模板的扩增效率相等.
2.2 引物对两种模板的检测灵敏度 用传统的竞争PCR方法测定一血清提取HCV DNA反转录合成cDNA，cDNA分别与竞争模板102，104，106 cop/ tub的PCR荧光强度为1∶1，将这些样品稀释成1×105，1×104，1×103，1×102，1×106，分别进行PCR扩增反应，扩增35次，结果两种模板都被检测到1×101cop的模板量.
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2.3 三个反应的试性范围 通过用已知拷贝数的cDNA配制101，5×101，102，5×102，1×103，5×103，1×104，5×104，1×105，5×105，1×106，5×106，1×107. 分别用102cop的竞争模板与1×101，5×101，1×102，5×102，1×103；104cop竞争模板与1×103，5×103，1×104，5×104，1×105cop;106cop竞争模板与1×105，5×105，1×106，5×106，1×107 cop分别混合进行PCR扩增，结果所得图形线形良好(图1).
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图1 竞争模板和待测模板初始量与荧光强度比的标准曲线.
当竞争模板为102cop时，方程式为lgAx/ A0=lgX-lgM0，Ax为待测模板扩增产物光密度值，A0为竞争模板扩增产物光密度值， M0为竞争模板初始量，X为待测模板初始量，当竞争模板为104cop，106cop时标准曲线与上图类似(未给出，只是lgM0=4，6).
2.4 临床样品的检测结果 用该定量法对20份HCV感染者的血清进行定量测定，结果平均血清HCV RNA的含量为5×107 cop/ L，最少含量为1×105 cop/ L，最高含量为5×108 cop/ L.
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3 讨论
用竞争模板定量需要有一个前提条件，既竞争模板和待测模板的扩增效率相等[5]，在实验中对模板和待测模板一定比例的3个反应体系进行再扩增，发现两者扩增产物的比值在扩增前后没有明显改变，说明两者的扩增效率是相等的. 该实验中竞争模板比待测模板长40 bp，引物结合区序列完全相同. 在实验中，为了便于最后的凝胶电泳分离，我们增加了两者的差距(70 bp，100 bp)，但发现竞争模板与待测模板长度相差越大扩增效率差别越大，尤其是在两者初始模板量相差较大时(10∶1或1∶10)扩增会出现大的偏差，而相差40 bp时偏差最小. 不过在该情况下，要求扩增的特异高，同时要走高浓度(30 g/ L)的琼脂糖凝胶才可将待测与竞争模板扩增产物分离开.
实验中采用的是Tth DNA聚合酶进行一步RT-PCR方法，该方法在65℃情况下先进反转录合成cDNA，因而减少了非特异产物的出现[2]. 而传统的巢式RT-PCR方法虽然有更高的灵敏度和特异性. 由于操作麻烦而且定量误差较大，在本实验中未被采纳. 另外我们用Tth的同时又用了Taq DNA聚合酶，是为了提高扩增过程中的保险系数. 该方法的理论基础是Ax/ A0=(265Yx)/ (305Y0)=[265×(1+e)]/ [305M0(1+e)]，Ax/ A0为待测模板与竞争模板的扩增产物带荧光强度比；Yx/ Y0为待测模板与竞争模板的扩增产物拷贝数之比，，265为待测模板的碱基数305为竞争模板的硷数，X为待测模板的初始量，M0为竞争模板的初始量，e为扩增效率；n为扩增次数. 当两种模板扩增效率相同，循环次数相等时，上式可变为lg(Ax/ A0)=lgx+lg(265/ 305M0)，因此，lgX与lg(Ax/ A0)是呈线性关系[4-6]. 在实际中由于采用GQS 9600型凝胶呈象分析仪进行凝胶荧光扫描测定，可以保证在竞争模板与待测模板差1个数量级之内，上述等式呈线性关系[7，8]. 而超过1个数量级则偏离线性，这可能是由于超出检测系统的线性范围.
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用该定量方法对HCV血清进行测定，结果血清中HCV RNA含量在3×105～6×108 cop/ L，平均在1×106 cop/ L，这一结果与文献报道的一致. 但我们认为这一结果要比实际值低，因为该方法中采用的竞争模板是DNA，没有从RNA开始进行竞争反应，忽略了反转录过程的因素.
通讯作者 郭晏海
4 参考文献
1 Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR, genome research. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996;6:986-994
2 Kumar U, Thomas HC, Monjardino J. Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay; correlation with serum AST. J Virol Meth, 1994;47:95-102
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3 Chomeyanski P, Sacchi NA. Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chlorofrom extraction. Anal Biochem, 1987;162:156-159
4 Kricka LJ. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin Chem, 1991;37:1472-1481
5 Martin CS, Butler L, Bronstein I. Quantitation of PCR products with chemiluminescence. Biotechniques, 1995;18:908-913
6 Chen B, Cheng ZH, Zhu JF. A novel method of detecting products of PCR. Chin J Med Lab Sci, 1996;19:151-159
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7 Dewey WC, Thompson LL, Trinh ML, Latz DL, Ward JF. A charg-coupled-device camera image analysis system for quantifying DNA distributions in agarose gels after pulsed-field gel electrophoresis. Radiat Res, 1994;140:37-47
8 Minamikawa-Tachino R, Ishii K, Sakuraba H, Suzuki S, Kaminuma K. Quantitative analysis of dystrophin gene amplification products using a PC-based image analysis system. Int J Bio Med Comput, 1993;33:277-286
收稿日期 1999-05-25 修回日期 1999-07-24, 百拇医药
单位：中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033
关键词：丙型肝炎病毒；RNA，病毒/ 分析；聚合酶链反应
世界华人消化杂志990935
中国图书馆分类号 R 373.21
Subject headings hepatitis C virus; RNA, viral/ analysis; polymerase chain reaction
基因的定量分析对分子生物的研究有着重要的作用，而采用PCR方法进行基因定量已成为一种有效的方式. 并且，目前已有多种利用PCR进行基因定量的方法，其中以竞争PCR定量和PE公司既时定量PCR方法测定结果较为准确，应用较多既时定量PCR方法采用了特殊设计的荧光-淬灭探针和精密的既时荧光检测设备进行定量. 该方法简化的操作，提高的测定的灵敏性和准确性，但其试剂和仪器的价值目前相当昂贵，一般实验室难于承担[1]. 而竞争PCR方法虽然操作比较麻烦，但也能进行较准确的定量，适合一般实验室使用，为了进一步简化竞争PCR方法，我们对实验进行了改进，建立分级定量的方法，只用3种浓度的竞争模板与样品RNA的恒定cDNA混合进行3个PCR反应，通过测定待测模板与竞争模板的终产物荧光强度比值来确定待测RNA的初始量. 该方法也适合多个样品同时测定.
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1 材料和方法
1.1 材料 GQS-960凝胶成象分析系统(第四军医大学基因诊断技术应用研究所)，Thermolyne PCR扩增仪(美国)，Taq DNA聚合酶、dNTP和Tth酶(Promega公司). 用Beckman Du640核酸和蛋白分析仪(美国). 引物出自HCV RNA 5’端非编码区，经oligo软件设计，引物位置和序列为：C1：(51～70)5’-GTCTTCACGCAGAAAGCGTC，C2：(308～290)5’-GGGCACTCGCAAGCACC扩增片段长度为260 bp由上海深工生物工程公司合成. 竞争模板为一段克隆于PUC 19的DNA序列，其两端为C1，C2引物的互补区，其中部与相应的HCV RNA序列只差40 bp序列，为代插入片段，目的是最终分离竞争模板和HCV RNA扩增产物.
1.2 方法 竞争模板的pUC 19质粒的提取方法按文献[2]方法，用EcoRⅠ酶切使质粒线性化，用Beckman Du640核酸和蛋白分析仪进行竞争模板的定量标定. 血清按酚/ 氯仿抽提，乙醇沉淀方法进行血清HCV RNA提取. 反转录合成cDNA：将HCV RNA用Tth酶反转录合成HCV RNA的cDNA具体过程按文献[3]的方法. 分级定量PCR扩增：将反转录合成的cDNA等量取3份分别与3个定量反应管的PCR反应液混合，3个PCR反应液中分别含有102cop，104cop，106cop的竞争模板. PCR反应成分为50 mmol/ L KCl，100 mmol/ L Tris-HCl pH 8.3，1.5 mmol/ L MgCl2，200 μmol/ L dNTP，C1和C2引物各30 pmol, Taq DNA聚合酶1 U，反应总体积30 μL，反应程序：94℃，预变性2min，然后94℃ 30s，55℃ 40s，71℃ 50s循环35次，最后72℃延伸5min，最后各准确取10 μL PCR反应物. 进行3%琼脂凝胶电泳，荧光强度测定：将用溴化乙锭染色的凝胶板置于GQS-960型凝胶定象分析系统上扫描，测定待测模板和竞争模板的PCR产物的荧光强度比值，并用微机计算结果.
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2 结果
2.1 竞争模板与待测模板cDNA扩增效率 对3个待测模板cDNA与竞争模板PCR产物荧光强度比分别为10∶1，1∶1，1∶10的反应液进行106倍稀释，各取3 μL稀释后的溶液进行再次PCR扩增，扩增条件与原PCR相同，循环35次最后测定两者荧光强度之比仍为10∶1，1∶1，1∶10，说明所用引物对待测模板和竞争模板的扩增效率相等.
2.2 引物对两种模板的检测灵敏度 用传统的竞争PCR方法测定一血清提取HCV DNA反转录合成cDNA，cDNA分别与竞争模板102，104，106 cop/ tub的PCR荧光强度为1∶1，将这些样品稀释成1×105，1×104，1×103，1×102，1×106，分别进行PCR扩增反应，扩增35次，结果两种模板都被检测到1×101cop的模板量.
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2.3 三个反应的试性范围 通过用已知拷贝数的cDNA配制101，5×101，102，5×102，1×103，5×103，1×104，5×104，1×105，5×105，1×106，5×106，1×107. 分别用102cop的竞争模板与1×101，5×101，1×102，5×102，1×103；104cop竞争模板与1×103，5×103，1×104，5×104，1×105cop;106cop竞争模板与1×105，5×105，1×106，5×106，1×107 cop分别混合进行PCR扩增，结果所得图形线形良好(图1).
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图1 竞争模板和待测模板初始量与荧光强度比的标准曲线.
当竞争模板为102cop时，方程式为lgAx/ A0=lgX-lgM0，Ax为待测模板扩增产物光密度值，A0为竞争模板扩增产物光密度值， M0为竞争模板初始量，X为待测模板初始量，当竞争模板为104cop，106cop时标准曲线与上图类似(未给出，只是lgM0=4，6).
2.4 临床样品的检测结果 用该定量法对20份HCV感染者的血清进行定量测定，结果平均血清HCV RNA的含量为5×107 cop/ L，最少含量为1×105 cop/ L，最高含量为5×108 cop/ L.
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3 讨论
用竞争模板定量需要有一个前提条件，既竞争模板和待测模板的扩增效率相等[5]，在实验中对模板和待测模板一定比例的3个反应体系进行再扩增，发现两者扩增产物的比值在扩增前后没有明显改变，说明两者的扩增效率是相等的. 该实验中竞争模板比待测模板长40 bp，引物结合区序列完全相同. 在实验中，为了便于最后的凝胶电泳分离，我们增加了两者的差距(70 bp，100 bp)，但发现竞争模板与待测模板长度相差越大扩增效率差别越大，尤其是在两者初始模板量相差较大时(10∶1或1∶10)扩增会出现大的偏差，而相差40 bp时偏差最小. 不过在该情况下，要求扩增的特异高，同时要走高浓度(30 g/ L)的琼脂糖凝胶才可将待测与竞争模板扩增产物分离开.
实验中采用的是Tth DNA聚合酶进行一步RT-PCR方法，该方法在65℃情况下先进反转录合成cDNA，因而减少了非特异产物的出现[2]. 而传统的巢式RT-PCR方法虽然有更高的灵敏度和特异性. 由于操作麻烦而且定量误差较大，在本实验中未被采纳. 另外我们用Tth的同时又用了Taq DNA聚合酶，是为了提高扩增过程中的保险系数. 该方法的理论基础是Ax/ A0=(265Yx)/ (305Y0)=[265×(1+e)]/ [305M0(1+e)]，Ax/ A0为待测模板与竞争模板的扩增产物带荧光强度比；Yx/ Y0为待测模板与竞争模板的扩增产物拷贝数之比，，265为待测模板的碱基数305为竞争模板的硷数，X为待测模板的初始量，M0为竞争模板的初始量，e为扩增效率；n为扩增次数. 当两种模板扩增效率相同，循环次数相等时，上式可变为lg(Ax/ A0)=lgx+lg(265/ 305M0)，因此，lgX与lg(Ax/ A0)是呈线性关系[4-6]. 在实际中由于采用GQS 9600型凝胶呈象分析仪进行凝胶荧光扫描测定，可以保证在竞争模板与待测模板差1个数量级之内，上述等式呈线性关系[7，8]. 而超过1个数量级则偏离线性，这可能是由于超出检测系统的线性范围.
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用该定量方法对HCV血清进行测定，结果血清中HCV RNA含量在3×105～6×108 cop/ L，平均在1×106 cop/ L，这一结果与文献报道的一致. 但我们认为这一结果要比实际值低，因为该方法中采用的竞争模板是DNA，没有从RNA开始进行竞争反应，忽略了反转录过程的因素.
通讯作者 郭晏海
4 参考文献
1 Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR, genome research. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996;6:986-994
2 Kumar U, Thomas HC, Monjardino J. Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay; correlation with serum AST. J Virol Meth, 1994;47:95-102
, 百拇医药
3 Chomeyanski P, Sacchi NA. Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chlorofrom extraction. Anal Biochem, 1987;162:156-159
4 Kricka LJ. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin Chem, 1991;37:1472-1481
5 Martin CS, Butler L, Bronstein I. Quantitation of PCR products with chemiluminescence. Biotechniques, 1995;18:908-913
6 Chen B, Cheng ZH, Zhu JF. A novel method of detecting products of PCR. Chin J Med Lab Sci, 1996;19:151-159
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7 Dewey WC, Thompson LL, Trinh ML, Latz DL, Ward JF. A charg-coupled-device camera image analysis system for quantifying DNA distributions in agarose gels after pulsed-field gel electrophoresis. Radiat Res, 1994;140:37-47
8 Minamikawa-Tachino R, Ishii K, Sakuraba H, Suzuki S, Kaminuma K. Quantitative analysis of dystrophin gene amplification products using a PC-based image analysis system. Int J Bio Med Comput, 1993;33:277-286
收稿日期 1999-05-25 修回日期 1999-07-24, 百拇医药