原发性肝细胞癌中ras P21，C-erbB-2和P16蛋白的表达意义
作者：王影 杨素琼 王在国 覃胜 孙维纲 刘光中
单位：王影 杨素琼 覃胜 孙维纲 四川省肿瘤医院 病理科 四川省成都市 610041；王在国 刘光中 四川省肿瘤医院 外科 四川省成都市 610041
关键词：肝肿瘤；癌，肝细胞；ras P21；C-erbB-2；P16蛋白
世界华人消化杂志990933 中国图书馆分类号 R 735.7
Subject headings liver neoplasms; carcinoma, hepatocellular; ras P21; C-erbB-2; P16 protein
原发性肝细胞癌(HCC)的发生与癌基因、抑癌基因的异常调控密切相关. 我们应用免疫组织化学方法研究HCC及其癌旁组织中的癌基因ras，c-erbB-2和抑癌基因P16蛋白的表达，探讨两者之间的关系.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 收集四川省肿瘤医院外科1988/ 1994手术切除并经病理证实为HCC的标本45例. 每例取癌组织及癌旁肝组织各一块. 同时收集非肝病死亡的尸检肝组织2例作对照. 所有标本均经100 mL/ L福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm连续切片. 按Edmondson肝癌分级标准进行分级，45例中，Ⅰ级10例，Ⅱ级12例，Ⅲ级13例，Ⅳ级10例. 男42例，女3例，年龄25岁～72岁. 平均48.5岁.
1.2 方法 应用LSAB免疫组织化学技术染色. 抗P16多克隆抗体、抗c-erbB-2多克隆抗体和抗P21单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品. 它们的工作浓度分别为1∶50，1∶100和1∶70. 以正常鼠、兔抗血清作阴性对照，最后作DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明封片.
结果判断：染色的阳性标记为棕黄色. 每张切片分别观察10个高倍视野，每个高倍视野计数100个肿瘤细胞或非肿瘤肝细胞内的免疫染色阳性细胞数，计算出每张切片的阳性细胞百分数，按阳性细胞百分数分为5个等级，低于1%为阴性(-)，1%～25%为+，26%～50%为++，51%～75%为+++，76%以上为++++.
, 百拇医药
统计学处理 实验数据采用χ2检验进行统计分析.
2 结果
2.1 ras P21 C-erbB-2和P16蛋白的表达 ras P21蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞质内，癌组织中以弥漫、灶状分布为主，癌旁组织中阳性细胞以灶状分布为主；C-erbB-2蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞质和胞膜，癌组织以胞质为主，癌旁以胞膜为主，阳性细胞均呈灶状或弥漫分布；P16蛋白位于肝细胞和肝癌细胞质内，呈弥漫性或颗粒性分布，偶见细胞核内着色. ras P21，C-erbB-2和P16蛋白在癌组织中的阳性率分别为66.7%，55.6%和40.0%；癌旁组织的阳性率分别为35.6%，28.9%和84.4%；2例正常肝组织P16蛋白均为阳性，C-erbB-2和ras P21蛋白均为阴性，癌组织和癌旁组织间ras P21和C-erbB-2蛋白阳性率有显著性差异(P<0.05)，P16蛋白阳性率有极显著性差异(P<0.01). 各患者ras P21, c-erbB-2和p16基因蛋白表达强度并不一致，P16蛋白表达以(+)-(++)为主，C-erbB-2和P21蛋白表达以(++)-(++++)为主.
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2.2 癌基因蛋白表达与病理组织学分级的关系 病理组织学分级Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ级，其ras P21表达率分别为50%(5/ 10)，58%(7/ 12)，76%(10/ 13)及80%(8/ 10)，c-erbB-2表达率分别为40%(4/ 10)，50%(6/ 12)，62%(8/ 13)及70%(7/ 10). 两组分别经χ2检验，无显著性差异(P>0.05)，但各级阳性表达率呈逐渐明显增高趋势. P16阳性表达率分别为70%(7/ 10)，42%(5/ 12)，30%(4/ 13)及20%(2/ 10)，经χ2检验， 有显著性差异(P<0.05).
2.3 肝癌组织中P16蛋白与ras P21, C-erbB-2表达的关系 P16蛋白和ras P21， C-erbB-2表达具有负相关性(P<0.05)，同时也说明同一患者有多基因的联合表达.
3 讨论
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细胞增殖失控是肿瘤组织最显著的特点. 癌基因激活和抑癌基因失活导致细胞增殖周期各环节直接和间接的调控发生异常，从而导致肿瘤的发生. 我们应用免疫组织化学染色方法，检测HCC和癌旁组织ras P21, C-erbB-2和P16蛋白表达，从而进一步证实了一些学者提出的HCC不是单基因表达，而是多基因表达的癌基因谱的概念[1]，同时探讨了ras P21, C-erbB-2和P16蛋白与HCC生物学特性关系及基因间的相互关系.
ras基因是最常见的癌基因，参与细胞信息的传递，对细胞周期起调控作用. 有学者提出ras基因的活化及致癌作用，必须有其他基因的协同参与，单个ras基因激活后，即使其产物达致癌水平仍不能致癌[2，3]. c-erbB-2为具有酪氨酸激酶活性的细胞膜糖蛋白，称P185，与表皮生长因子受体(EGFR)的基因及蛋白有部分同源性，过表达可见于多种人类原发肿瘤[4]，P16蛋白是多重肿瘤抑制基因1(MTS1)编码产物，位于人染色体9P21，P16蛋白能与CDK4结合，抑制了CDK4/ 周期蛋白复合物的催化活性，从而抑制细胞增生和恶性转化[5]. Yan et al[6]提出人体内存在一个包括P16,CDK和pRb的细胞周期负反馈调节环路，致使细胞不能进入G1-S期. 此外，研究还发现，丧失P53功能的细胞中P16 mRNA水平也较高，提示P53可能对P16的表达起负调节作用，只是P53通过激活P21，抑制CDK的活性而发挥作用的[7]，说明P16在抑制细胞增殖过程中并非单一发挥作用，而是与体内其他基因有密切联系. 本结果显示，ras P21，C-erbB-2和P16蛋白在2例正常肝组织中分别为阴性(0/ 2) 阴性(0/ 2)和阳性(2/ 2)，癌旁组织的阳性率分别为35.6%，28.9%和84.4%，肝癌组织的阳性率分别为66.7%，55.6%和40%，差异有显著性，说明c-erbB-2和ras P21基因活化与HCC发生有密切关系. 同时还发现， ras P21和c-erbB-2的表达率随病理分级逐级提高而明显增高趋势，P16蛋白表达率随病理分级提高而降低，即癌组织分化越差，癌基因蛋白ras P21和c-erbB-2的表达越高，而抑癌基因P16蛋白表达下降，提示 ras P21, c-erbB-2与肿瘤的恶性度有一定关系，P16蛋白与肿瘤的恶性度显著相关. 因此，我们认为抑癌基因p16和癌基因ras P21, c-erbB-2在HCC发生和发展的癌基因学中起重要作用，其中ras P21， c-erbB-2和P16之间存在的负相关性具有重要意义.
, 百拇医药
通讯作者 王影
4 参考文献
1 顾建人，陈渊卿，蒋惠秋，徐国成，刘超亭，洪伟娜. 人原发性肝癌的癌基因谱. 肿瘤，1988；8：289-291
2 Cho KR, Vogelstein R. Genetic alterations in the adenocarcinoma scqucncc. Cancer, 1992;70:1727-1731
3 Tada M, Omata M, Ohto M. Analysis of ras gene mutation in human hepatic malignant tumors by polymerase chain reaction and direct sequencing. Cacner Res, 1990;50:1121-1124
, http://www.100md.com
4 Wood DP, Wartinger DD, Reuter V. DNA RNA and immunohistochemical characterization of the HER-2/ neu oncogene in transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol, 1991;145:1398-1413
5 Kamb A, Gruis NA, Feldhaus WJ. A cell cycle regulator potenially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994;264:436-442
6 Yan L, Nichols MA, Jcrry WS, Yue X. Transcriptional repression of the D type cyclin-drpendent kinase inhibitor P16 by the retinoblastoma susceptibility gene product pRb. Cancer Res, 1994;54:6078-6082
7 Goabin F, Ducommun B. Idcntification of binding domains on the P21 cipl cyclin-dependent kinase inhibitor. Oncogene, 1995;10:2281-2288
收稿日期 1999-05-19, http://www.100md.com
单位：王影 杨素琼 覃胜 孙维纲 四川省肿瘤医院 病理科 四川省成都市 610041；王在国 刘光中 四川省肿瘤医院 外科 四川省成都市 610041
关键词：肝肿瘤；癌，肝细胞；ras P21；C-erbB-2；P16蛋白
世界华人消化杂志990933 中国图书馆分类号 R 735.7
Subject headings liver neoplasms; carcinoma, hepatocellular; ras P21; C-erbB-2; P16 protein
原发性肝细胞癌(HCC)的发生与癌基因、抑癌基因的异常调控密切相关. 我们应用免疫组织化学方法研究HCC及其癌旁组织中的癌基因ras，c-erbB-2和抑癌基因P16蛋白的表达，探讨两者之间的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 收集四川省肿瘤医院外科1988/ 1994手术切除并经病理证实为HCC的标本45例. 每例取癌组织及癌旁肝组织各一块. 同时收集非肝病死亡的尸检肝组织2例作对照. 所有标本均经100 mL/ L福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm连续切片. 按Edmondson肝癌分级标准进行分级，45例中，Ⅰ级10例，Ⅱ级12例，Ⅲ级13例，Ⅳ级10例. 男42例，女3例，年龄25岁～72岁. 平均48.5岁.
1.2 方法 应用LSAB免疫组织化学技术染色. 抗P16多克隆抗体、抗c-erbB-2多克隆抗体和抗P21单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品. 它们的工作浓度分别为1∶50，1∶100和1∶70. 以正常鼠、兔抗血清作阴性对照，最后作DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明封片.
结果判断：染色的阳性标记为棕黄色. 每张切片分别观察10个高倍视野，每个高倍视野计数100个肿瘤细胞或非肿瘤肝细胞内的免疫染色阳性细胞数，计算出每张切片的阳性细胞百分数，按阳性细胞百分数分为5个等级，低于1%为阴性(-)，1%～25%为+，26%～50%为++，51%～75%为+++，76%以上为++++.
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统计学处理 实验数据采用χ2检验进行统计分析.
2 结果
2.1 ras P21 C-erbB-2和P16蛋白的表达 ras P21蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞质内，癌组织中以弥漫、灶状分布为主，癌旁组织中阳性细胞以灶状分布为主；C-erbB-2蛋白位于肝细胞和肝癌细胞的胞质和胞膜，癌组织以胞质为主，癌旁以胞膜为主，阳性细胞均呈灶状或弥漫分布；P16蛋白位于肝细胞和肝癌细胞质内，呈弥漫性或颗粒性分布，偶见细胞核内着色. ras P21，C-erbB-2和P16蛋白在癌组织中的阳性率分别为66.7%，55.6%和40.0%；癌旁组织的阳性率分别为35.6%，28.9%和84.4%；2例正常肝组织P16蛋白均为阳性，C-erbB-2和ras P21蛋白均为阴性，癌组织和癌旁组织间ras P21和C-erbB-2蛋白阳性率有显著性差异(P<0.05)，P16蛋白阳性率有极显著性差异(P<0.01). 各患者ras P21, c-erbB-2和p16基因蛋白表达强度并不一致，P16蛋白表达以(+)-(++)为主，C-erbB-2和P21蛋白表达以(++)-(++++)为主.
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2.2 癌基因蛋白表达与病理组织学分级的关系 病理组织学分级Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ级，其ras P21表达率分别为50%(5/ 10)，58%(7/ 12)，76%(10/ 13)及80%(8/ 10)，c-erbB-2表达率分别为40%(4/ 10)，50%(6/ 12)，62%(8/ 13)及70%(7/ 10). 两组分别经χ2检验，无显著性差异(P>0.05)，但各级阳性表达率呈逐渐明显增高趋势. P16阳性表达率分别为70%(7/ 10)，42%(5/ 12)，30%(4/ 13)及20%(2/ 10)，经χ2检验， 有显著性差异(P<0.05).
2.3 肝癌组织中P16蛋白与ras P21, C-erbB-2表达的关系 P16蛋白和ras P21， C-erbB-2表达具有负相关性(P<0.05)，同时也说明同一患者有多基因的联合表达.
3 讨论
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细胞增殖失控是肿瘤组织最显著的特点. 癌基因激活和抑癌基因失活导致细胞增殖周期各环节直接和间接的调控发生异常，从而导致肿瘤的发生. 我们应用免疫组织化学染色方法，检测HCC和癌旁组织ras P21, C-erbB-2和P16蛋白表达，从而进一步证实了一些学者提出的HCC不是单基因表达，而是多基因表达的癌基因谱的概念[1]，同时探讨了ras P21, C-erbB-2和P16蛋白与HCC生物学特性关系及基因间的相互关系.
ras基因是最常见的癌基因，参与细胞信息的传递，对细胞周期起调控作用. 有学者提出ras基因的活化及致癌作用，必须有其他基因的协同参与，单个ras基因激活后，即使其产物达致癌水平仍不能致癌[2，3]. c-erbB-2为具有酪氨酸激酶活性的细胞膜糖蛋白，称P185，与表皮生长因子受体(EGFR)的基因及蛋白有部分同源性，过表达可见于多种人类原发肿瘤[4]，P16蛋白是多重肿瘤抑制基因1(MTS1)编码产物，位于人染色体9P21，P16蛋白能与CDK4结合，抑制了CDK4/ 周期蛋白复合物的催化活性，从而抑制细胞增生和恶性转化[5]. Yan et al[6]提出人体内存在一个包括P16,CDK和pRb的细胞周期负反馈调节环路，致使细胞不能进入G1-S期. 此外，研究还发现，丧失P53功能的细胞中P16 mRNA水平也较高，提示P53可能对P16的表达起负调节作用，只是P53通过激活P21，抑制CDK的活性而发挥作用的[7]，说明P16在抑制细胞增殖过程中并非单一发挥作用，而是与体内其他基因有密切联系. 本结果显示，ras P21，C-erbB-2和P16蛋白在2例正常肝组织中分别为阴性(0/ 2) 阴性(0/ 2)和阳性(2/ 2)，癌旁组织的阳性率分别为35.6%，28.9%和84.4%，肝癌组织的阳性率分别为66.7%，55.6%和40%，差异有显著性，说明c-erbB-2和ras P21基因活化与HCC发生有密切关系. 同时还发现， ras P21和c-erbB-2的表达率随病理分级逐级提高而明显增高趋势，P16蛋白表达率随病理分级提高而降低，即癌组织分化越差，癌基因蛋白ras P21和c-erbB-2的表达越高，而抑癌基因P16蛋白表达下降，提示 ras P21, c-erbB-2与肿瘤的恶性度有一定关系，P16蛋白与肿瘤的恶性度显著相关. 因此，我们认为抑癌基因p16和癌基因ras P21, c-erbB-2在HCC发生和发展的癌基因学中起重要作用，其中ras P21， c-erbB-2和P16之间存在的负相关性具有重要意义.
, 百拇医药
通讯作者 王影
4 参考文献
1 顾建人，陈渊卿，蒋惠秋，徐国成，刘超亭，洪伟娜. 人原发性肝癌的癌基因谱. 肿瘤，1988；8：289-291
2 Cho KR, Vogelstein R. Genetic alterations in the adenocarcinoma scqucncc. Cancer, 1992;70:1727-1731
3 Tada M, Omata M, Ohto M. Analysis of ras gene mutation in human hepatic malignant tumors by polymerase chain reaction and direct sequencing. Cacner Res, 1990;50:1121-1124
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4 Wood DP, Wartinger DD, Reuter V. DNA RNA and immunohistochemical characterization of the HER-2/ neu oncogene in transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol, 1991;145:1398-1413
5 Kamb A, Gruis NA, Feldhaus WJ. A cell cycle regulator potenially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994;264:436-442
6 Yan L, Nichols MA, Jcrry WS, Yue X. Transcriptional repression of the D type cyclin-drpendent kinase inhibitor P16 by the retinoblastoma susceptibility gene product pRb. Cancer Res, 1994;54:6078-6082
7 Goabin F, Ducommun B. Idcntification of binding domains on the P21 cipl cyclin-dependent kinase inhibitor. Oncogene, 1995;10:2281-2288
收稿日期 1999-05-19, http://www.100md.com