冠心病患者载脂蛋白E基因型及表型的研究与临床意义
作者：彭 健 龚五星 彭 澍 王 骏 石 理 林岫芳
单位：暨南大学医学院第三附属医院(519000)
关键词：冠状动脉疾病；载脂蛋白E类；基因型；聚合酶链反应
实用医学杂志990904 摘 要 目的：探讨在冠心病(CHD)发生发展中载脂蛋白E(apoE)基因多态性的作用及其对血脂水平的影响。方法：采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，测定210例CHD患者和172例正常对照者的apoE基因型。应用SPSS统计软件包分析该基因对两组受试者的血脂、脂蛋白和载脂蛋白AI(apoAI)、载脂蛋白B100(apoB100)的影响及其与CHD的临床相关关系。结果：CHD组apoE4/3基因型和ε4等位基因频率均显著高于对照组(P<0.01)；CHD组总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著高于对照组(P<0.01)；在CHD组的apoE各亚型之间，TC和LDL-C水平之间存在统计学差异(P<0.05)。结论：apoE基因多态性对血脂、脂蛋白水平有明显作用，ε4等位基因携带者CHD发病的危险性显著增加。
, http://www.100md.com
冠心病(CHD)是遗传、环境等多因素所致疾病，其发病机制迄今未明。在众多的发病因素中，高脂血症，尤其是高胆固醇(TC)血症与CHD关系最为密切。载脂蛋白E(apoE)作为脂蛋白的配体和结构与功能蛋白对血脂代谢起重要调节作用。apoE基因变异与CHD发病遗传易患性的相关关系，是近年研究的热点。我们应用聚合酶链反应(PCR)技术和分子生物学方法，检测了一组汉族正常人与CHD患者的apoE基因频率和表型分布，旨在探讨apoE基因遗传变异与CHD发病的关联作用及其对血脂质、脂蛋白水平的影响。
1 对象与方法
1.1 研究对象 病例组210例，男117例，女93例，平均年龄62.4±2.3岁(36～88岁)。对照组172例为健康体检者，男95例，女77例，平均年龄59.1±1.7岁(41～78岁)。两组研究对象基线条件互相匹配。CHD的诊断以1979年WHO的诊断标准，并排除糖尿病、肝肾疾病、老年性痴呆症等。两组研究对象皆为汉族人群，研究个体之间无血缘关系。
, 百拇医药
1.2 研究方法
1.2.1 apoE的基因分型 按低渗溶血、酚/氯仿法抽提白细胞基因组DNA，PCR法对apoE基因进行扩增，HhaI内切酶酶切，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染法显示apoE的不同基因分型。apoE基因型的判定以PBR322DNA/HaeⅢ为标准分子标记物，标准参照Richard等[1]方法。所有测定均于6个月内完成。
1.2.2 血脂测定 采用常规方法测定TC、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、apoAI和apoB。
1.3 统计学处理 apoE基因型与等位基因频率采用频率计数法计算；组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验及计算比值比(oddsratio,OR)进行关联性分析；组间血脂比较采用t检验；不同基因型间血脂均数比较采用单因素方差分析法。均应用国际通用的SPSS统计软件包进行统计分析，以P<0.05表示有统计学差异，P<0.01表示有显著差异。
, 百拇医药
2 结果
2.1 apoE基因型及等位基因频率分布 382例研究对象的目的基因均得到满意扩增，PCR产物片段大小为292bp。共检测出五种apoE基因型，分别为E3/3、E3/2、E4/3、E4/2和E4/4，见图1。冠心病组apoE4/3基因型明显高于对照组(P<0.01)，见表1。通过计算OR分析apoE多态性与CHD发生的关联性，显示ε4等位基因与CHD发病存在密切关联，OR(95%CI)＝1.92(1.55～2.29)，P<0.01。E/2及E4/4例数较少，未行统计学比较。
图1 apoE目的基因PCR产物及各基因型酶切片段
(marker:pBR322DNA/HeaⅢ分子标记物)
表1 CHD组和对照组apoE基因型与等位基因频率比较(例，%) 组别
, 百拇医药
n
基因型频率
等位基因型频率
E2/2
E3/3
E4/4
E3/2
E4/3
E4/2
ε2
ε3
ε4
CHD组
, 百拇医药
210
0
124(59.0)
3(1.4)
28(13.3)
53(25.2)
2(0.9)
30(7.1)
329(78.3)
61(14.5)
对照组
172
, 百拇医药 0
120(69.8)
0
24(14.0)
23(13.4*)
5(2.9)
29(8.4)
287(83.4)
28(8.1*)
与CHD组比较*P<0.01
2.2 apoE等位基因频率在不同人群中的分布 本研究所测正常中国汉族人群中apoε4等位基因频率(0.081)与日本人群检测结果(0.067)接近，而低于欧美人群(P<0.05)，与文献报道相符[2]。
, 百拇医药
2.3 apoE基因多态性对血脂、脂蛋白的影响 CHD组的TC和LDL-C水平明显高于对照组(P<0.01)，其余各项血脂、脂蛋白水平没有统计学差异(P>0.01)，见图2。将CHD患者按基因型分组进行比较分析，在不同基因型之间，TC和LDL-C水平存在统计学差异(P<0.05)，其余各项血脂、脂蛋白水平则没有统计学差异(P>0.05)，见表2。E4/2及E4/4例数较少，未行统计学比较。
表2 CHD组各基因型之间血脂、脂蛋白水平比较(
±s) apoE基因型
TC(mmol/L)
TG(mmol/L)
HDL-C(mmol/L)
LDL-C(mmol/L)
, 百拇医药
apoAI(g/L)
apoB(g/L)
E3/3
5.15±0.68
1.39±0.34
1.10±0.28
3.19±0.19
1.09±0.11
1.17±0.09
E3/2
4.44±0.52
1.41±0.21
, http://www.100md.com
1.12±0.39
2.06±0.27
0.99±0.10
1.21±0.12
E4/3
5.39±0.61
1.46±0.29
1.06±0.35
2.99±0.28
1.14±0.13
1.16±0.10
P值
, http://www.100md.com
<0.05
>0.05
>0.05
<0.05
>0.05
>0.05
图2 CHD组和对照组血脂、脂蛋白水平比较
3 讨论
国内外关于CHD的研究文献较多，研究涉及CHD的流行病学、临床表现、诊断治疗和预后、康复等各个方面。有关apoE与CHD的遗传流行病学及临床相关性的研究在近年才开始，但已显示出重要的临床指导意义。人群apoE由位于第19号染色体的单一结构基因所编码，有3种复等位基因ε2、ε3和ε4构成常见的6种表型：3种纯合子E2/2、E3/3、E4/4和3种杂合子E3/2、E4/3、E4/2[4]。apoE3种异构体的受体结合活性存在明显差异，从而可能对血脂水平和冠心病发病产生不同影响。apoE基因频率在正常人群中的分布有明显的共同特征，表现为E3/3表型分布频率最高，均超过50%，ε3等位基因频率均超过72%；E2/2、E4/4和E4/2表型分布最低，三者之和不超过8%，本研究结果与其相符。亚洲人apoE基因型出现频率较为一致，但与欧美人群比较存在差异，该差异显示与不同国家或种族人群的血脂水平与CHD发病率的差异高度一致。
, 百拇医药
apoE的重要生理功能是作为脂蛋白的受体参与脂质的肝脏代谢，尤其是CM残基的代谢。apoE不同基因型可通过不同的血脂代谢作用而影响CHD的发病。血清TC是CHD独立的、主要的危险因素，TC水平的升高反映了LDL-C的升高。本研究对CHD组与对照组进行血脂及脂蛋白水平的比较，证实CHD组TC及LDL-C水平明显增高，与流行病学的研究相符。近年有关TG、HDL-C与CHD的关系亦逐渐受到临床重视，血清TG增高与HDL-C降低也视为CHD的独立危险因素，但本组资料并未显示有差异。本研究还表明，在apoE不同基因型之间，TC和LDL-C水平存在统计学差异，从而揭示apoE基因多态性、血脂水平与CHD之间存在因果关系。
早有研究人员注意到，CHD的发病有明显的遗传倾向和家族性，并一直在寻找遗传易患标记。Stengard[5]报道apoE基因多态性与血TC水平及CHD死亡率之间有相关性，ε4等位基因尤其为一项有价值的CHD危险因素。Kuusisto[6]报道apoE4和非apoE4基因携带者的CHD死亡率、总心脏事件和CHD总发病率无显著差异。我国在该领域的研究亦得到不同结论[7，8]。本研究结果表明，CHD组apoE4/3基因型和ε4等位基因频率明显高于正常对照组，ε4等位基因与CHD的发生存在密切关联。
, 百拇医药
各种引起血脂代谢异常的疾病几乎均可导致CHD的发生，吸烟、酗酒、肥胖、性别等也是CHD发病的危险因素。本研究排除了可能引起高脂血症及与apoE基因多态性可能有关的各种疾病，并在病例组和对照组之间平衡各项危险因素。研究表明apoE基因多态性是影响血浆TC浓度的重要遗传因素之一[9]。本研究证实，apoE基因多态性与CHD发生密切相关，这不仅与其影响TC及LDL-C水平有关，尚可通过分子生物学机制发挥作用；apoEε4等位基因是CHD一个重要的遗传易患和危险因素。apoE基因多态性检测有望成为CHD的早期预防、筛查、诊断、监测和干预治疗的指标之一而发挥重要的临床意义。继续深入研究载脂蛋白的基因表达和调控以及CHD患者apoE保护基因型，可为CHD和脂代谢紊乱的有关基因治疗提供理论与实验基础，并为CHD和动脉粥样硬化的防治开拓新的前景。
本课题受国务院侨务办公室(部级)重点学科科研基金资助(基金编号1998175)和广东省医药科研基金资助(基金编号1998567)
, 百拇医药
4 参考文献
1 Richard P,David F,Visvikis S,et al. Common and rare genotypes of hu man apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase c hain reaction amplified DNA. Clin Chem,1994,40(1):24～29.
2 Evans AE,Zhang W,Moreel JF,et al. Polymorphisms of the apolipoprote in B and E genes and their relationship to plasma lipid variables in healthy Chi nese men. Hum Cenet,1993,92(2):101～107.
, http://www.100md.com
3 Stengard JH,Weiss KM,Sing CF. An ecological study of association be tween coronary heart disease mortality rates in men and the relative frequencies of common allelic variations in the gene coding for apolipoprotein E. Hum Genet ,1998,103:234～241.
4 Kuusisto J,Mykkanen L,Kesaniemi YA,et al. Apolipoprotein E4 phenoty pe is not an important risk factor for coronary heart disease or stroke in elder ly subjects. Arterioscler J Thromb Vasc Biol,1995，15(9)：1280～1286.
5 鄢盛凯，周 新，林其燧，等. 汉族人群载脂蛋白E基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系的研究. 中华医学杂志，1998，78(10)：790～791.
6 赵 毅，沈 霞. 心肌梗塞患者apoE多态性与血脂的关系. 上海第二医科大学学报，1998，18(5)：378～380.
7 Siest G,Pillot T,Regis-Bailly A,et al. Apoliporotein E:An important gene and protein to follow in laboratory medicine. Clin Chem,1995，41：1068～10 86., 百拇医药
单位：暨南大学医学院第三附属医院(519000)
关键词：冠状动脉疾病；载脂蛋白E类；基因型；聚合酶链反应
实用医学杂志990904 摘 要 目的：探讨在冠心病(CHD)发生发展中载脂蛋白E(apoE)基因多态性的作用及其对血脂水平的影响。方法：采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，测定210例CHD患者和172例正常对照者的apoE基因型。应用SPSS统计软件包分析该基因对两组受试者的血脂、脂蛋白和载脂蛋白AI(apoAI)、载脂蛋白B100(apoB100)的影响及其与CHD的临床相关关系。结果：CHD组apoE4/3基因型和ε4等位基因频率均显著高于对照组(P<0.01)；CHD组总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著高于对照组(P<0.01)；在CHD组的apoE各亚型之间，TC和LDL-C水平之间存在统计学差异(P<0.05)。结论：apoE基因多态性对血脂、脂蛋白水平有明显作用，ε4等位基因携带者CHD发病的危险性显著增加。
, http://www.100md.com
冠心病(CHD)是遗传、环境等多因素所致疾病，其发病机制迄今未明。在众多的发病因素中，高脂血症，尤其是高胆固醇(TC)血症与CHD关系最为密切。载脂蛋白E(apoE)作为脂蛋白的配体和结构与功能蛋白对血脂代谢起重要调节作用。apoE基因变异与CHD发病遗传易患性的相关关系，是近年研究的热点。我们应用聚合酶链反应(PCR)技术和分子生物学方法，检测了一组汉族正常人与CHD患者的apoE基因频率和表型分布，旨在探讨apoE基因遗传变异与CHD发病的关联作用及其对血脂质、脂蛋白水平的影响。
1 对象与方法
1.1 研究对象 病例组210例，男117例，女93例，平均年龄62.4±2.3岁(36～88岁)。对照组172例为健康体检者，男95例，女77例，平均年龄59.1±1.7岁(41～78岁)。两组研究对象基线条件互相匹配。CHD的诊断以1979年WHO的诊断标准，并排除糖尿病、肝肾疾病、老年性痴呆症等。两组研究对象皆为汉族人群，研究个体之间无血缘关系。
, 百拇医药
1.2 研究方法
1.2.1 apoE的基因分型 按低渗溶血、酚/氯仿法抽提白细胞基因组DNA，PCR法对apoE基因进行扩增，HhaI内切酶酶切，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染法显示apoE的不同基因分型。apoE基因型的判定以PBR322DNA/HaeⅢ为标准分子标记物，标准参照Richard等[1]方法。所有测定均于6个月内完成。
1.2.2 血脂测定 采用常规方法测定TC、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、apoAI和apoB。
1.3 统计学处理 apoE基因型与等位基因频率采用频率计数法计算；组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验及计算比值比(oddsratio,OR)进行关联性分析；组间血脂比较采用t检验；不同基因型间血脂均数比较采用单因素方差分析法。均应用国际通用的SPSS统计软件包进行统计分析，以P<0.05表示有统计学差异，P<0.01表示有显著差异。
, 百拇医药
2 结果
2.1 apoE基因型及等位基因频率分布 382例研究对象的目的基因均得到满意扩增，PCR产物片段大小为292bp。共检测出五种apoE基因型，分别为E3/3、E3/2、E4/3、E4/2和E4/4，见图1。冠心病组apoE4/3基因型明显高于对照组(P<0.01)，见表1。通过计算OR分析apoE多态性与CHD发生的关联性，显示ε4等位基因与CHD发病存在密切关联，OR(95%CI)＝1.92(1.55～2.29)，P<0.01。E/2及E4/4例数较少，未行统计学比较。
图1 apoE目的基因PCR产物及各基因型酶切片段
(marker:pBR322DNA/HeaⅢ分子标记物)
表1 CHD组和对照组apoE基因型与等位基因频率比较(例，%) 组别
, 百拇医药
n
基因型频率
等位基因型频率
E2/2
E3/3
E4/4
E3/2
E4/3
E4/2
ε2
ε3
ε4
CHD组
, 百拇医药
210
0
124(59.0)
3(1.4)
28(13.3)
53(25.2)
2(0.9)
30(7.1)
329(78.3)
61(14.5)
对照组
172
, 百拇医药 0
120(69.8)
0
24(14.0)
23(13.4*)
5(2.9)
29(8.4)
287(83.4)
28(8.1*)
与CHD组比较*P<0.01
2.2 apoE等位基因频率在不同人群中的分布 本研究所测正常中国汉族人群中apoε4等位基因频率(0.081)与日本人群检测结果(0.067)接近，而低于欧美人群(P<0.05)，与文献报道相符[2]。
, 百拇医药
2.3 apoE基因多态性对血脂、脂蛋白的影响 CHD组的TC和LDL-C水平明显高于对照组(P<0.01)，其余各项血脂、脂蛋白水平没有统计学差异(P>0.01)，见图2。将CHD患者按基因型分组进行比较分析，在不同基因型之间，TC和LDL-C水平存在统计学差异(P<0.05)，其余各项血脂、脂蛋白水平则没有统计学差异(P>0.05)，见表2。E4/2及E4/4例数较少，未行统计学比较。
表2 CHD组各基因型之间血脂、脂蛋白水平比较(
±s) apoE基因型TC(mmol/L)
TG(mmol/L)
HDL-C(mmol/L)
LDL-C(mmol/L)
, 百拇医药
apoAI(g/L)
apoB(g/L)
E3/3
5.15±0.68
1.39±0.34
1.10±0.28
3.19±0.19
1.09±0.11
1.17±0.09
E3/2
4.44±0.52
1.41±0.21
, http://www.100md.com
1.12±0.39
2.06±0.27
0.99±0.10
1.21±0.12
E4/3
5.39±0.61
1.46±0.29
1.06±0.35
2.99±0.28
1.14±0.13
1.16±0.10
P值
, http://www.100md.com
<0.05
>0.05
>0.05
<0.05
>0.05
>0.05
图2 CHD组和对照组血脂、脂蛋白水平比较
3 讨论
国内外关于CHD的研究文献较多，研究涉及CHD的流行病学、临床表现、诊断治疗和预后、康复等各个方面。有关apoE与CHD的遗传流行病学及临床相关性的研究在近年才开始，但已显示出重要的临床指导意义。人群apoE由位于第19号染色体的单一结构基因所编码，有3种复等位基因ε2、ε3和ε4构成常见的6种表型：3种纯合子E2/2、E3/3、E4/4和3种杂合子E3/2、E4/3、E4/2[4]。apoE3种异构体的受体结合活性存在明显差异，从而可能对血脂水平和冠心病发病产生不同影响。apoE基因频率在正常人群中的分布有明显的共同特征，表现为E3/3表型分布频率最高，均超过50%，ε3等位基因频率均超过72%；E2/2、E4/4和E4/2表型分布最低，三者之和不超过8%，本研究结果与其相符。亚洲人apoE基因型出现频率较为一致，但与欧美人群比较存在差异，该差异显示与不同国家或种族人群的血脂水平与CHD发病率的差异高度一致。
, 百拇医药
apoE的重要生理功能是作为脂蛋白的受体参与脂质的肝脏代谢，尤其是CM残基的代谢。apoE不同基因型可通过不同的血脂代谢作用而影响CHD的发病。血清TC是CHD独立的、主要的危险因素，TC水平的升高反映了LDL-C的升高。本研究对CHD组与对照组进行血脂及脂蛋白水平的比较，证实CHD组TC及LDL-C水平明显增高，与流行病学的研究相符。近年有关TG、HDL-C与CHD的关系亦逐渐受到临床重视，血清TG增高与HDL-C降低也视为CHD的独立危险因素，但本组资料并未显示有差异。本研究还表明，在apoE不同基因型之间，TC和LDL-C水平存在统计学差异，从而揭示apoE基因多态性、血脂水平与CHD之间存在因果关系。
早有研究人员注意到，CHD的发病有明显的遗传倾向和家族性，并一直在寻找遗传易患标记。Stengard[5]报道apoE基因多态性与血TC水平及CHD死亡率之间有相关性，ε4等位基因尤其为一项有价值的CHD危险因素。Kuusisto[6]报道apoE4和非apoE4基因携带者的CHD死亡率、总心脏事件和CHD总发病率无显著差异。我国在该领域的研究亦得到不同结论[7，8]。本研究结果表明，CHD组apoE4/3基因型和ε4等位基因频率明显高于正常对照组，ε4等位基因与CHD的发生存在密切关联。
, 百拇医药
各种引起血脂代谢异常的疾病几乎均可导致CHD的发生，吸烟、酗酒、肥胖、性别等也是CHD发病的危险因素。本研究排除了可能引起高脂血症及与apoE基因多态性可能有关的各种疾病，并在病例组和对照组之间平衡各项危险因素。研究表明apoE基因多态性是影响血浆TC浓度的重要遗传因素之一[9]。本研究证实，apoE基因多态性与CHD发生密切相关，这不仅与其影响TC及LDL-C水平有关，尚可通过分子生物学机制发挥作用；apoEε4等位基因是CHD一个重要的遗传易患和危险因素。apoE基因多态性检测有望成为CHD的早期预防、筛查、诊断、监测和干预治疗的指标之一而发挥重要的临床意义。继续深入研究载脂蛋白的基因表达和调控以及CHD患者apoE保护基因型，可为CHD和脂代谢紊乱的有关基因治疗提供理论与实验基础，并为CHD和动脉粥样硬化的防治开拓新的前景。
本课题受国务院侨务办公室(部级)重点学科科研基金资助(基金编号1998175)和广东省医药科研基金资助(基金编号1998567)
, 百拇医药
4 参考文献
1 Richard P,David F,Visvikis S,et al. Common and rare genotypes of hu man apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase c hain reaction amplified DNA. Clin Chem,1994,40(1):24～29.
2 Evans AE,Zhang W,Moreel JF,et al. Polymorphisms of the apolipoprote in B and E genes and their relationship to plasma lipid variables in healthy Chi nese men. Hum Cenet,1993,92(2):101～107.
, http://www.100md.com
3 Stengard JH,Weiss KM,Sing CF. An ecological study of association be tween coronary heart disease mortality rates in men and the relative frequencies of common allelic variations in the gene coding for apolipoprotein E. Hum Genet ,1998,103:234～241.
4 Kuusisto J,Mykkanen L,Kesaniemi YA,et al. Apolipoprotein E4 phenoty pe is not an important risk factor for coronary heart disease or stroke in elder ly subjects. Arterioscler J Thromb Vasc Biol,1995，15(9)：1280～1286.
5 鄢盛凯，周 新，林其燧，等. 汉族人群载脂蛋白E基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系的研究. 中华医学杂志，1998，78(10)：790～791.
6 赵 毅，沈 霞. 心肌梗塞患者apoE多态性与血脂的关系. 上海第二医科大学学报，1998，18(5)：378～380.
7 Siest G,Pillot T,Regis-Bailly A,et al. Apoliporotein E:An important gene and protein to follow in laboratory medicine. Clin Chem,1995，41：1068～10 86., 百拇医药