血清学与PCR检测HLA-B27的比较
作者：陈盛强 胡朝辉 高俊 陈柏铭 黄文辉 陶怡
单位：陈盛强 胡朝辉 高俊 陈柏铭 广州医学院检验系(510182)；黄文辉 陶怡 广州医学院第二附属医院风湿科(510260)
关键词：血清学；聚合酶链反应；人类白细胞抗原B27
广东医学990911 【摘要】 目的 比较血清学与PCR检测HLA-B27的方法, 从中找出一种实用、可靠的方法为临床诊断提供依据。方法 分别用血清学和PCR对62例临床怀疑AS的病人标本进行检测HLA-B27。结果 在所有62例标本中, 两种检测方法的检出率差异无显著性(χ2=1.7，P<0.05)。PCR检测的灵敏度为100%，特异性为85.7%；血清学检测的灵敏度为90.6%，特异性为71.5%。结论 PCR检测HLA-B27的方法具有快速、简便、准确、特异性高等优点，在无优质抗血清的情况下,可用PCR代替血清学检测HLA-B27。
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HLA-B27是具有高度遗传多态性的人白细胞抗原B座位上的一个等位基因。HLA-B27与血清阴性脊柱关节病如强直性脊柱炎等疾病相关[1，2]。目前检测HLA-B27抗原的方法有多种，其中最经典和应用最广泛的是血清学分型法。近年来，国外有报道采用分子生物学方法直接检测HLA-B27基因，国内这方面的研究还不多，我们应用PCR-SSP技术建立了检测HLA-B27基因的方法，本文通过对血清学和PCR法检测HLA-B27的比较，从中找出一种更实用可靠的方法，为疾病的诊断提供更可靠的依据。
1 资料与方法
1.1 样本 被检对象是1997年10月～1998年4月间广东省人民医院、广州医学院第二附属医院风湿科62名临床疑为AS，Reiter病等患者，其中经临床确诊为AS的有32例，确诊为其他疾病的14例，其余为门诊病人和最后未确诊的病人(诊断参照修订的纽约标准)，静脉采血，肝素抗凝，5名HLA-B27抗原标准细胞采自广州医学院HLA标准细胞库。
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1.2 血清学检测 分阶段采用微量淋巴细胞毒试验，HLA-B27分型血清板含有阳性对照、阴性对照，HLA-B27抗血清分别购自北京307医院、北京中日友好医院、美国莱姆德公司。
1.3 PCR-SSP检测
1.3.1 模板DNA抽提 取抗凝血0.3 mL用酚抽提DNA。
1.3.2 引物设计 根据1992年第十一届国际组织相容性专题讨论会公布的HLA-B27 DNA序列，参照Olerup等设计的B27序列特异引物而设计引物，P1：5-CAG TCT GTG CCT TGG CGTTGC， P2：5-GGC TAC GTG GAG GAC ACG CT，扩增产物为144 bp，并以人类生长激素(HGH)基因特异引物为内对照，序列为5-GCC TTC CCA ACC CCC TTA，5-TCA CGG ATT TCT GTT GTG TTT，扩增产物为429 bp引物，由加拿大真达科技贸易有限公司合成并纯化。
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1.3.3 PCR反应 反应体系为20 μL，包括50～100 ng基因DNA，lu的聚合酶，B27特异性引物(0.5 μM)，200 md NTp，PCR缓冲液，变性95℃ 5 min，在基因扩增仪上进行30个循环，三个温度条件分别是94℃ 30 s，58℃ 40 s，72℃ 60s，扩增后取产物10 μL与适量的溴酚蓝混匀，加到2%琼脂糖凝胶上，与100 bp Ladder 的分子量Marker作为对照一起在0.5 XTBE缓冲液中电泳30 min(5 V/cm)，取出电泳后的凝胶放入紫外线透射检测仪中观察结果并拍照，阳性的结果有一条荧光黄色的扩增带出现在阳性对照带的位置。
2 结果
2.1 重复性试验 用5份阳性标本与5例阴性标本分别用PCR-SSP测定，同样条件重复5次，检测结果完全一致。
2.2 血清学与PCR检测结果比较 62名需做HLA-B27抗原检测者，血清学测定结果是29例阳性，33例阴性。PCR法结果阳性有32例，阴性有30例。配对χ2检验，χ2=1.7，P>0.05。两种方法的检出率差异无显著性，在确诊为AS的32例标本中PCR全为阳性，而血清学有29例阳性和3例阴性，PCR的灵敏度为100%，特异性为85.7%，血清学的灵敏度为90.6%，特异性为71.5%，经χ2检验，在灵敏度、特异性方面两种方法比较差异无显著性(P>0.05)。
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3 讨论
在AS患者中的HLA-B27的检测灵敏度差异无显著性，且在PCR法中32例AS病人中均为阳性，而血清学只有29例为阳性，与国外文献[1]报道的B27抗原在AS患者中的频率为90%以上相符。血清学中出现3例阴性的原因可能是由于漏检，因为血清学所需的抗血清质量要求高，而实际上难以获得相关系数(r)为1.00或强度(SI)为100%的B27单价抗血清。目前证实HLA-B27有7个基因亚型，从理论上说抗血清也有7种，单份血清就可能引起漏检，同时由于操作过程中试剂的pH值、孵育的时间、室温等影响下使结果在可疑的范围内，此时需要凭检验者的“经验”判读结果，由于人为的主观因素使结果误判，易造成漏检。
微量淋巴细胞毒试验在分离淋巴细胞时，会遇到淋巴细胞粘附红细胞的现象，往往需要用蒸馏水来裂解红细胞，由于个体差异，有些淋巴细胞的形态也会发生改变，干扰读数，有时溶解红细胞不充分，使红细胞混在淋巴细胞中，在判读结果时也会产生干扰，使红细胞与死亡的淋巴细胞难以区分。同时HLA-B27与HLA-B7，HLA-B22抗原有交叉反应[2]，这两种情况可引起结果出现假阳性。
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PCR方法所需的标本量较少，微量的DNA就可以扩增达到106～107倍的量，达到常规方法检测所需的浓度，极少量的污染也会使结果出现假阳性，因此在开展PCR时要在严格的试验条件下进行，技术要求比较高，实验操作要精细，标本的采集、分离、DNA的提取和扩增皆应严防器材和标本中的DNA交叉污染。同时PCR方法中有一些抑制因素存在，比如镁离子的浓度，抗凝剂的选用及循环的温度和时间等，为减少假阴性的出现，PCR扩增时同时加入内对照扩增，观察在电泳时是否有内对照扩增带出现来增加结果的可靠性。同时PCR的引物是根据HLA-B27的DNA序列特异位点设计的，它包括了HLA-B27的7个亚型，避免漏检。
血清学为了保证分离的淋巴细胞数量，需要3 mL左右的新鲜抗凝血，如果检验结果可疑，难以判断，或者操作过程中偶然失误而使标本破坏，需复查，又要重新抽血，给病人带来不必要的痛苦。而PCR方法提取DNA，不仅血量需用少，且可以用陈旧标本，提取的DNA也可以保存起来，根据需要，反复多次试验，在临床应用有一定价值。因此在无优质血清的情况下，可用PCR法代替。
4 参考文献
1 Benjamin R, Parham P. Guide by association: HLA-B27 and ankylosing spondylitis. Immunol Today，1990,11:137
2 赵桐茂，郑素琴，顾之娟,等.HLA分型原理和应用.上海:上海科学技术出版社，1984.65～99, 百拇医药
单位：陈盛强 胡朝辉 高俊 陈柏铭 广州医学院检验系(510182)；黄文辉 陶怡 广州医学院第二附属医院风湿科(510260)
关键词：血清学；聚合酶链反应；人类白细胞抗原B27
广东医学990911 【摘要】 目的 比较血清学与PCR检测HLA-B27的方法, 从中找出一种实用、可靠的方法为临床诊断提供依据。方法 分别用血清学和PCR对62例临床怀疑AS的病人标本进行检测HLA-B27。结果 在所有62例标本中, 两种检测方法的检出率差异无显著性(χ2=1.7，P<0.05)。PCR检测的灵敏度为100%，特异性为85.7%；血清学检测的灵敏度为90.6%，特异性为71.5%。结论 PCR检测HLA-B27的方法具有快速、简便、准确、特异性高等优点，在无优质抗血清的情况下,可用PCR代替血清学检测HLA-B27。
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HLA-B27是具有高度遗传多态性的人白细胞抗原B座位上的一个等位基因。HLA-B27与血清阴性脊柱关节病如强直性脊柱炎等疾病相关[1，2]。目前检测HLA-B27抗原的方法有多种，其中最经典和应用最广泛的是血清学分型法。近年来，国外有报道采用分子生物学方法直接检测HLA-B27基因，国内这方面的研究还不多，我们应用PCR-SSP技术建立了检测HLA-B27基因的方法，本文通过对血清学和PCR法检测HLA-B27的比较，从中找出一种更实用可靠的方法，为疾病的诊断提供更可靠的依据。
1 资料与方法
1.1 样本 被检对象是1997年10月～1998年4月间广东省人民医院、广州医学院第二附属医院风湿科62名临床疑为AS，Reiter病等患者，其中经临床确诊为AS的有32例，确诊为其他疾病的14例，其余为门诊病人和最后未确诊的病人(诊断参照修订的纽约标准)，静脉采血，肝素抗凝，5名HLA-B27抗原标准细胞采自广州医学院HLA标准细胞库。
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1.2 血清学检测 分阶段采用微量淋巴细胞毒试验，HLA-B27分型血清板含有阳性对照、阴性对照，HLA-B27抗血清分别购自北京307医院、北京中日友好医院、美国莱姆德公司。
1.3 PCR-SSP检测
1.3.1 模板DNA抽提 取抗凝血0.3 mL用酚抽提DNA。
1.3.2 引物设计 根据1992年第十一届国际组织相容性专题讨论会公布的HLA-B27 DNA序列，参照Olerup等设计的B27序列特异引物而设计引物，P1：5-CAG TCT GTG CCT TGG CGTTGC， P2：5-GGC TAC GTG GAG GAC ACG CT，扩增产物为144 bp，并以人类生长激素(HGH)基因特异引物为内对照，序列为5-GCC TTC CCA ACC CCC TTA，5-TCA CGG ATT TCT GTT GTG TTT，扩增产物为429 bp引物，由加拿大真达科技贸易有限公司合成并纯化。
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1.3.3 PCR反应 反应体系为20 μL，包括50～100 ng基因DNA，lu的聚合酶，B27特异性引物(0.5 μM)，200 md NTp，PCR缓冲液，变性95℃ 5 min，在基因扩增仪上进行30个循环，三个温度条件分别是94℃ 30 s，58℃ 40 s，72℃ 60s，扩增后取产物10 μL与适量的溴酚蓝混匀，加到2%琼脂糖凝胶上，与100 bp Ladder 的分子量Marker作为对照一起在0.5 XTBE缓冲液中电泳30 min(5 V/cm)，取出电泳后的凝胶放入紫外线透射检测仪中观察结果并拍照，阳性的结果有一条荧光黄色的扩增带出现在阳性对照带的位置。
2 结果
2.1 重复性试验 用5份阳性标本与5例阴性标本分别用PCR-SSP测定，同样条件重复5次，检测结果完全一致。
2.2 血清学与PCR检测结果比较 62名需做HLA-B27抗原检测者，血清学测定结果是29例阳性，33例阴性。PCR法结果阳性有32例，阴性有30例。配对χ2检验，χ2=1.7，P>0.05。两种方法的检出率差异无显著性，在确诊为AS的32例标本中PCR全为阳性，而血清学有29例阳性和3例阴性，PCR的灵敏度为100%，特异性为85.7%，血清学的灵敏度为90.6%，特异性为71.5%，经χ2检验，在灵敏度、特异性方面两种方法比较差异无显著性(P>0.05)。
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3 讨论
在AS患者中的HLA-B27的检测灵敏度差异无显著性，且在PCR法中32例AS病人中均为阳性，而血清学只有29例为阳性，与国外文献[1]报道的B27抗原在AS患者中的频率为90%以上相符。血清学中出现3例阴性的原因可能是由于漏检，因为血清学所需的抗血清质量要求高，而实际上难以获得相关系数(r)为1.00或强度(SI)为100%的B27单价抗血清。目前证实HLA-B27有7个基因亚型，从理论上说抗血清也有7种，单份血清就可能引起漏检，同时由于操作过程中试剂的pH值、孵育的时间、室温等影响下使结果在可疑的范围内，此时需要凭检验者的“经验”判读结果，由于人为的主观因素使结果误判，易造成漏检。
微量淋巴细胞毒试验在分离淋巴细胞时，会遇到淋巴细胞粘附红细胞的现象，往往需要用蒸馏水来裂解红细胞，由于个体差异，有些淋巴细胞的形态也会发生改变，干扰读数，有时溶解红细胞不充分，使红细胞混在淋巴细胞中，在判读结果时也会产生干扰，使红细胞与死亡的淋巴细胞难以区分。同时HLA-B27与HLA-B7，HLA-B22抗原有交叉反应[2]，这两种情况可引起结果出现假阳性。
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PCR方法所需的标本量较少，微量的DNA就可以扩增达到106～107倍的量，达到常规方法检测所需的浓度，极少量的污染也会使结果出现假阳性，因此在开展PCR时要在严格的试验条件下进行，技术要求比较高，实验操作要精细，标本的采集、分离、DNA的提取和扩增皆应严防器材和标本中的DNA交叉污染。同时PCR方法中有一些抑制因素存在，比如镁离子的浓度，抗凝剂的选用及循环的温度和时间等，为减少假阴性的出现，PCR扩增时同时加入内对照扩增，观察在电泳时是否有内对照扩增带出现来增加结果的可靠性。同时PCR的引物是根据HLA-B27的DNA序列特异位点设计的，它包括了HLA-B27的7个亚型，避免漏检。
血清学为了保证分离的淋巴细胞数量，需要3 mL左右的新鲜抗凝血，如果检验结果可疑，难以判断，或者操作过程中偶然失误而使标本破坏，需复查，又要重新抽血，给病人带来不必要的痛苦。而PCR方法提取DNA，不仅血量需用少，且可以用陈旧标本，提取的DNA也可以保存起来，根据需要，反复多次试验，在临床应用有一定价值。因此在无优质血清的情况下，可用PCR法代替。
4 参考文献
1 Benjamin R, Parham P. Guide by association: HLA-B27 and ankylosing spondylitis. Immunol Today，1990,11:137
2 赵桐茂，郑素琴，顾之娟,等.HLA分型原理和应用.上海:上海科学技术出版社，1984.65～99, 百拇医药