自身抗原Ro/SSA抗原优势决定簇分析
作者：邓安梅 仲人前 陈孙孝 施笑梅 孔宪涛
单位：第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海，200003
关键词：自身抗原；Ro/SSA；决定簇分析
第二军医大学学报991009 摘要 目的: 探讨自身抗原Ro/SSA(Mr=60 000)的抗原决定簇，为自身免疫性疾病机制的研究提供依据。方法: 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析，采用PCR法克隆自身抗原Ro/SSA(Mr=60 000)多肽片段的cDNA，定向插入表达载体PGEX-2T，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用GST亲和层析柱进行纯化，经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应。结果: Ro/SSA(Mr=60 000)的抗原优势决定簇主要存在于100～190位和191～300位，不同患者、不同病程抗原优势决定簇有所不同。结论：抗原驱动机制在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。
, 百拇医药
中图分类号 R 392.11 文献标识码：A
Determinants analysis of autoantigen Ro/SSA
Deng Anmei, Zhong Renqian, Chen Sunxiao, Shi Xiaomei, Kong Xiantao
(Clinical Immunology Center,Changzheng Hospital, Second Military Medical university, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To analyze the determinants of autoantigen Ro/SSA for the understanding of molecular mechanism of autoimmune diseases. Methods: Based on the sequence analysis of autoantigen Ro/SSA, the 6 fractions of Ro/SSA GST-antigen fusion proteins induced by IPTG in E.coli JM109 were obtained. The determinants of Ro/SSA were analyzed by IBT and competitive inhibition reaction. Results: The determinants of Ro/SSA existed on aa 100～190 and 191～300. Conclusion: The antigen-deriving mechanism plays an important role in the pathogenesis of autoimmune diseases.
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KEY WORDS autoantigen, Ro/SSA; determinants analysis
系统性红斑狼疮(SLE)是慢性自身免疫性疾病，其发生机制尚不明确。约50%的SLE患者常存在抗Ro/SSA抗体[1]。Ro/SSA抗原是一种小细胞质核糖核蛋白复合物，其蛋白质成分包括Mr为60 000和52 000两种，与Y-RNA分子相连接[2]。自身抗原和抗体的反应在自身免疫病的发病机制中起着重要的作用。分析患者血清识别的自身抗原表位有利于了解特定的自身抗体产生过程中的主导机制，对于研究自身免疫病发生机制有重要意义。因此我们在计算机软件分析抗原位点的基础上，应用重组DNA和PCR技术克隆 Mr为 60000 Ro/SSA 片段，而后分析其与抗血清的反应，以期确定其抗原优势表位，为疾病的诊治提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 抗Ro阳性血清为本中心保存，来自本院SLE患者常规检测血清标本，与本中心克隆表达的Mr为60 000 Ro/SSA全抗原反应阳性[3]；PGEX-2T质粒，JM109菌株为Promega公司产品; QINprep Plasmid Miniprep Kit, DNA extraction Kit购自QINGENE公司。
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1.2 Ro/SSA cDNA片段的克隆 根据计算机软件分析Ro/SSA 抗原序列的结果[4]，用PCR法扩增6个cDNA片段，分别编码氨基酸1～190，1～100，191～350，240～350，351～525，425～525位。PCR反应条件参见文献[3]。
1.3 Ro/SSA cDNA片段的表达 将经过DNA测序鉴定[5]的纯化的PCR扩增产物定向插入PGEX-2T。 挑取重组克隆，加入IPTG，诱导3 h，菌液经GST亲和层析柱纯化，得到Ro/SSA抗原的6种片段肽。进行SDS-PAGE电泳，经考马斯蓝染色。
1.4 免疫印迹法分析各片段抗原性 将上述各片段肽经SDS-PAGE电泳后转印，将转印后的NC膜剪成条带，用含3% BSA的PBS (pH7.4)封闭1 h。分别用封闭液1∶500稀释40份抗Ro阳性血清混和物和正常人血清，孵育1 h，PBS洗涤3次。加1∶1 000稀释的HRP标记的兔抗人IgG抗体，37孵育1 h。充分洗涤后加入3，3-二氨联苯胺底物反应显色。
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1.5 竞争抑制法分析各片段抗原性 将抗Ro/SSA血清混合物与重组60 kd-Ro/SSA抗原及上述各片段肽预先在室温孵育1 h，而后与Molt-4细胞裂解液转印条带进行免疫印迹反应，方法同上。
2 结 果
2.1 Ro/SSA cDNA片段的PCR产物 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，在300～570 bp之间可见6条清晰的特异性扩增条带，符合我们的预期目的。
图1 Ro/SSA cDNA片段PCR产物电泳图
Fig 1 Gel electrophoresis of the PCR products
of Ro/SSA cDNA fraction
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1～6: PCR products of Ro606～Ro601; 7: DNA marker
2.2 重组融合蛋白的表达、纯化 6个片段肽在大肠杆菌JM109株中，通过表达载体PGEX-2T得到表达。其纯化产物经10%SDS-PAGE电泳后，经考马斯蓝染色，结果如图2。
图2 Ro/SSA片段重组融合蛋白SDS-PAGE电泳图
Fig 2 SDS-PAGE electrophoresis of the recombinant fusion
proteins of Ro/SSA fractions
1～6: Fractions of Ro606～Ro601; 7: Protein marker
, 百拇医药
2.3 免疫学鉴定 将40份Ro/SSA阳性血清混合后，与6个片段肽的印迹条反应，结果如图3。而以前的研究结果已证实这40份血清与本中心克隆表达的Ro/SSA全抗原反应阳性，与GST蛋白反应阴性[3]。Ro601和Ro603与血清反应阳性，而其他片段反应阴性，表明在100～190位和191～240位可能存在与抗体结合的抗原决定簇。竞争抑制实验表明，重组60 kd-Ro/SSA，Ro601和Ro603可消除标准抗SSA/Ro血清与Molt-4细胞裂解液转印条之间的免疫反应，而其他抗原片段无此作用。
图3 免疫学鉴定
Fig 3 Immunoblot of fractions
1～2:Ro/SSA; 3～8: Ro601～Ro606
, 百拇医药
2.4 临床应用 我们跟踪研究了3个SLE患者的血清反应，发现3年内随着病情发展，其抗体与抗原片段的反应有所不同，见表1。
表1 SLE患者血清与抗原片段反应的动态观察
Tab 1 Longitual studies of SLE patients′ sera Patient
Antigen fractions binding to antibody
First year
Second year
Third year
1
Ro601,R0603
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Ro603,Ro605,Ro603
2
Ro603
Ro603
Ro603
3
Ro601
Ro603
Ro603
3 讨 论
自身免疫病是免疫系统对自身组织的异常反应，其中有很多问题还未得到解决，如：自身免疫机制和自身抗体的来源尚不明确，尚不能确定抗原的哪些决定簇更具有抗原性，不同患者间的优势决定簇有何不同。因此，分析患者血清识别的自身抗原决定簇对于研究自身免疫病机制有着重要意义。
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我们过去利用计算机软件综合分析了Ro/SSA 克隆的蛋白质分子[3]特性，推测自身抗原Ro/SSA 的抗原决定簇可能存在于50～100，150～190位以及210～240，350～400位间[4]。在此基础上，本研究重组得到6个Ro/SSA cDNA片段，通过免疫印迹法和竞争抑制法来考察各片段对抗体的结合性，以分析其抗原优势决定簇。我们用40份与完整重组抗原Ro/SSA 反应阳性的血清混和物来代表患者总体水平，反映Ro/SSA 的抗原优势决定簇。结果表明，在100～190位和191～240位可能存在与抗体结合的抗原决定簇,包括了抗原性预测中的2个，而抗原性预测中的50～100位、350～400位，在本实验中未显示抗原性。蛋白质作为B细胞抗原所暴露的部位取决于蛋白质的性质和宿主因素，其间还涉及抗原、抗体的其他因素(如三级结构、翻译后修饰、RNA结合等)[6]。可能我们选择的亚克隆位点对免疫反应性会有所影响，重组融合抗原和组织提纯La蛋白的抗原位点呈现可能有所差异，重组融合抗原的抗体结合位点可能被邻近的GST蛋白掩盖或歪曲，不同的位点的竞争抑制性不同。自身抗原常是RNP复合物的成分，要确定抗原位点，还需明确三维结构[7]。
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Veldhoven等[8]制备了抗Ro/SSA单抗来研究决定簇，发现Ro/SSA 至少存在3个线性决定簇，其中在C端有一个，在RNP结构和“锌指”区有两个决定簇，在哺乳动物基因中属保守性区域，可能属于1个结构型决定簇,或者属于不同的结构型决定簇而可同时与抗体结合。经免疫印迹法不能检测出抗天然结构型决定簇的抗体，因而本研究在免疫印迹法中检测到的是抗Ro自身抗体的一个亚群，也可能是结构型决定簇的一个部分。尽管如此，我们认为本研究中确定的抗原性位点对于探讨自身免疫病的发病机制仍有积极的意义。
本研究对3个SLE患者血清抗Ro/SSA 片段抗原的反应进行了跟踪检测，发现各患者血清与抗原片段的反应性并不一致，存在个体差异性；而且在不同病程，抗原决定簇有所差异，这与前人提出的“决定簇扩展”相一致[9]。本研究的结果显示，在最初出现抗Ro/SSA aa 100～190位的患者中出现针对其他优势决定簇的抗体，提示aa 100～190位可能是Ro/SSA中首先被识别的决定簇。抗体产生不仅取决于蛋白质性质，也与个体遗传背景有关。因此各个患者的抗血清识别的决定簇不一定完全相同。
, 百拇医药
随着对已知蛋白一级结构、特定结构或与生物信号相关性研究的不断深入，蛋白质结构预测准确率可达60%～80%。本研究的实验已验证了4个预测决定簇中的两个。可以设想人类自身免疫反应由一定的分子的有限区域所激发，确定这样的区域有助于我们了解疾病发生机制并作进一步研究。
文章编号：0258-879X(1999)10-0737-03
参考文献
1 Reichlin M. Autoantibodies to the RoRNP particles[J]. Clin Exp Immunol, 1995, 99(1):7
2 邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. SSA/Ro抗原研究进展及临床应用[J]. 中国免疫学杂志, 1997,13(专刊)：92
3 邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. 自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达[J]. 第二军医大学学报, 1998, 19(1)：20
, 百拇医药
4 邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. 自身抗原Ro/SSA的序列结构及决定簇分析[J]. 第二军医大学学报, 1999,20(3):194
5 杜 恺. DNA序列测定. 见：卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 1993. 340～364
6 Routsias JG， Tzioufas AG, Sakarellos-Daitsiotis M, et al. Epitope mapping of the Ro/SSA-60kD autoantigen reveals disease-specific antibody-binding profiles[J]. Eur J Clin Invest， 1996，26(6): 514
7 Scofield RH, Frank MB, Neas BR,et al. Cooperative association of T cell beta receptor and HLA-DQ alleles in the production of anti-Ro in systemic lupus erythematosus[J]. Clin Immunol Immunopathol， 1994，72(3): 335
, 百拇医药
8 Veldhoven CHA,Pruijn GJM,Milof JF,et al.Characterization of murine monoclonal antibodies against 60 kD Ro/SSA and La/SSB autoantigens[J]. Clin Exp Immunol,1995，101(1):45
9 Bachmann M, Zaubitzer T, Muller WE. The autoantigen La/SSB:detection on and uptake by mitotic cells[J]. Exp Cell Res，1992, 201(2): 387
(1999-02-20收稿，1999-08-12修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海，200003
关键词：自身抗原；Ro/SSA；决定簇分析
第二军医大学学报991009 摘要 目的: 探讨自身抗原Ro/SSA(Mr=60 000)的抗原决定簇，为自身免疫性疾病机制的研究提供依据。方法: 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析，采用PCR法克隆自身抗原Ro/SSA(Mr=60 000)多肽片段的cDNA，定向插入表达载体PGEX-2T，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用GST亲和层析柱进行纯化，经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应。结果: Ro/SSA(Mr=60 000)的抗原优势决定簇主要存在于100～190位和191～300位，不同患者、不同病程抗原优势决定簇有所不同。结论：抗原驱动机制在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。
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中图分类号 R 392.11 文献标识码：A
Determinants analysis of autoantigen Ro/SSA
Deng Anmei, Zhong Renqian, Chen Sunxiao, Shi Xiaomei, Kong Xiantao
(Clinical Immunology Center,Changzheng Hospital, Second Military Medical university, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To analyze the determinants of autoantigen Ro/SSA for the understanding of molecular mechanism of autoimmune diseases. Methods: Based on the sequence analysis of autoantigen Ro/SSA, the 6 fractions of Ro/SSA GST-antigen fusion proteins induced by IPTG in E.coli JM109 were obtained. The determinants of Ro/SSA were analyzed by IBT and competitive inhibition reaction. Results: The determinants of Ro/SSA existed on aa 100～190 and 191～300. Conclusion: The antigen-deriving mechanism plays an important role in the pathogenesis of autoimmune diseases.
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KEY WORDS autoantigen, Ro/SSA; determinants analysis
系统性红斑狼疮(SLE)是慢性自身免疫性疾病，其发生机制尚不明确。约50%的SLE患者常存在抗Ro/SSA抗体[1]。Ro/SSA抗原是一种小细胞质核糖核蛋白复合物，其蛋白质成分包括Mr为60 000和52 000两种，与Y-RNA分子相连接[2]。自身抗原和抗体的反应在自身免疫病的发病机制中起着重要的作用。分析患者血清识别的自身抗原表位有利于了解特定的自身抗体产生过程中的主导机制，对于研究自身免疫病发生机制有重要意义。因此我们在计算机软件分析抗原位点的基础上，应用重组DNA和PCR技术克隆 Mr为 60000 Ro/SSA 片段，而后分析其与抗血清的反应，以期确定其抗原优势表位，为疾病的诊治提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 抗Ro阳性血清为本中心保存，来自本院SLE患者常规检测血清标本，与本中心克隆表达的Mr为60 000 Ro/SSA全抗原反应阳性[3]；PGEX-2T质粒，JM109菌株为Promega公司产品; QINprep Plasmid Miniprep Kit, DNA extraction Kit购自QINGENE公司。
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1.2 Ro/SSA cDNA片段的克隆 根据计算机软件分析Ro/SSA 抗原序列的结果[4]，用PCR法扩增6个cDNA片段，分别编码氨基酸1～190，1～100，191～350，240～350，351～525，425～525位。PCR反应条件参见文献[3]。
1.3 Ro/SSA cDNA片段的表达 将经过DNA测序鉴定[5]的纯化的PCR扩增产物定向插入PGEX-2T。 挑取重组克隆，加入IPTG，诱导3 h，菌液经GST亲和层析柱纯化，得到Ro/SSA抗原的6种片段肽。进行SDS-PAGE电泳，经考马斯蓝染色。
1.4 免疫印迹法分析各片段抗原性 将上述各片段肽经SDS-PAGE电泳后转印，将转印后的NC膜剪成条带，用含3% BSA的PBS (pH7.4)封闭1 h。分别用封闭液1∶500稀释40份抗Ro阳性血清混和物和正常人血清，孵育1 h，PBS洗涤3次。加1∶1 000稀释的HRP标记的兔抗人IgG抗体，37孵育1 h。充分洗涤后加入3，3-二氨联苯胺底物反应显色。
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1.5 竞争抑制法分析各片段抗原性 将抗Ro/SSA血清混合物与重组60 kd-Ro/SSA抗原及上述各片段肽预先在室温孵育1 h，而后与Molt-4细胞裂解液转印条带进行免疫印迹反应，方法同上。
2 结 果
2.1 Ro/SSA cDNA片段的PCR产物 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，在300～570 bp之间可见6条清晰的特异性扩增条带，符合我们的预期目的。
图1 Ro/SSA cDNA片段PCR产物电泳图
Fig 1 Gel electrophoresis of the PCR products
of Ro/SSA cDNA fraction
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1～6: PCR products of Ro606～Ro601; 7: DNA marker
2.2 重组融合蛋白的表达、纯化 6个片段肽在大肠杆菌JM109株中，通过表达载体PGEX-2T得到表达。其纯化产物经10%SDS-PAGE电泳后，经考马斯蓝染色，结果如图2。
图2 Ro/SSA片段重组融合蛋白SDS-PAGE电泳图
Fig 2 SDS-PAGE electrophoresis of the recombinant fusion
proteins of Ro/SSA fractions
1～6: Fractions of Ro606～Ro601; 7: Protein marker
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2.3 免疫学鉴定 将40份Ro/SSA阳性血清混合后，与6个片段肽的印迹条反应，结果如图3。而以前的研究结果已证实这40份血清与本中心克隆表达的Ro/SSA全抗原反应阳性，与GST蛋白反应阴性[3]。Ro601和Ro603与血清反应阳性，而其他片段反应阴性，表明在100～190位和191～240位可能存在与抗体结合的抗原决定簇。竞争抑制实验表明，重组60 kd-Ro/SSA，Ro601和Ro603可消除标准抗SSA/Ro血清与Molt-4细胞裂解液转印条之间的免疫反应，而其他抗原片段无此作用。
图3 免疫学鉴定
Fig 3 Immunoblot of fractions
1～2:Ro/SSA; 3～8: Ro601～Ro606
, 百拇医药
2.4 临床应用 我们跟踪研究了3个SLE患者的血清反应，发现3年内随着病情发展，其抗体与抗原片段的反应有所不同，见表1。
表1 SLE患者血清与抗原片段反应的动态观察
Tab 1 Longitual studies of SLE patients′ sera Patient
Antigen fractions binding to antibody
First year
Second year
Third year
1
Ro601,R0603
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Ro603,Ro605,Ro603
2
Ro603
Ro603
Ro603
3
Ro601
Ro603
Ro603
3 讨 论
自身免疫病是免疫系统对自身组织的异常反应，其中有很多问题还未得到解决，如：自身免疫机制和自身抗体的来源尚不明确，尚不能确定抗原的哪些决定簇更具有抗原性，不同患者间的优势决定簇有何不同。因此，分析患者血清识别的自身抗原决定簇对于研究自身免疫病机制有着重要意义。
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我们过去利用计算机软件综合分析了Ro/SSA 克隆的蛋白质分子[3]特性，推测自身抗原Ro/SSA 的抗原决定簇可能存在于50～100，150～190位以及210～240，350～400位间[4]。在此基础上，本研究重组得到6个Ro/SSA cDNA片段，通过免疫印迹法和竞争抑制法来考察各片段对抗体的结合性，以分析其抗原优势决定簇。我们用40份与完整重组抗原Ro/SSA 反应阳性的血清混和物来代表患者总体水平，反映Ro/SSA 的抗原优势决定簇。结果表明，在100～190位和191～240位可能存在与抗体结合的抗原决定簇,包括了抗原性预测中的2个，而抗原性预测中的50～100位、350～400位，在本实验中未显示抗原性。蛋白质作为B细胞抗原所暴露的部位取决于蛋白质的性质和宿主因素，其间还涉及抗原、抗体的其他因素(如三级结构、翻译后修饰、RNA结合等)[6]。可能我们选择的亚克隆位点对免疫反应性会有所影响，重组融合抗原和组织提纯La蛋白的抗原位点呈现可能有所差异，重组融合抗原的抗体结合位点可能被邻近的GST蛋白掩盖或歪曲，不同的位点的竞争抑制性不同。自身抗原常是RNP复合物的成分，要确定抗原位点，还需明确三维结构[7]。
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Veldhoven等[8]制备了抗Ro/SSA单抗来研究决定簇，发现Ro/SSA 至少存在3个线性决定簇，其中在C端有一个，在RNP结构和“锌指”区有两个决定簇，在哺乳动物基因中属保守性区域，可能属于1个结构型决定簇,或者属于不同的结构型决定簇而可同时与抗体结合。经免疫印迹法不能检测出抗天然结构型决定簇的抗体，因而本研究在免疫印迹法中检测到的是抗Ro自身抗体的一个亚群，也可能是结构型决定簇的一个部分。尽管如此，我们认为本研究中确定的抗原性位点对于探讨自身免疫病的发病机制仍有积极的意义。
本研究对3个SLE患者血清抗Ro/SSA 片段抗原的反应进行了跟踪检测，发现各患者血清与抗原片段的反应性并不一致，存在个体差异性；而且在不同病程，抗原决定簇有所差异，这与前人提出的“决定簇扩展”相一致[9]。本研究的结果显示，在最初出现抗Ro/SSA aa 100～190位的患者中出现针对其他优势决定簇的抗体，提示aa 100～190位可能是Ro/SSA中首先被识别的决定簇。抗体产生不仅取决于蛋白质性质，也与个体遗传背景有关。因此各个患者的抗血清识别的决定簇不一定完全相同。
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随着对已知蛋白一级结构、特定结构或与生物信号相关性研究的不断深入，蛋白质结构预测准确率可达60%～80%。本研究的实验已验证了4个预测决定簇中的两个。可以设想人类自身免疫反应由一定的分子的有限区域所激发，确定这样的区域有助于我们了解疾病发生机制并作进一步研究。
文章编号：0258-879X(1999)10-0737-03
参考文献
1 Reichlin M. Autoantibodies to the RoRNP particles[J]. Clin Exp Immunol, 1995, 99(1):7
2 邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. SSA/Ro抗原研究进展及临床应用[J]. 中国免疫学杂志, 1997,13(专刊)：92
3 邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. 自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达[J]. 第二军医大学学报, 1998, 19(1)：20
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4 邓安梅, 仲人前, 孔宪涛. 自身抗原Ro/SSA的序列结构及决定簇分析[J]. 第二军医大学学报, 1999,20(3):194
5 杜 恺. DNA序列测定. 见：卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 1993. 340～364
6 Routsias JG， Tzioufas AG, Sakarellos-Daitsiotis M, et al. Epitope mapping of the Ro/SSA-60kD autoantigen reveals disease-specific antibody-binding profiles[J]. Eur J Clin Invest， 1996，26(6): 514
7 Scofield RH, Frank MB, Neas BR,et al. Cooperative association of T cell beta receptor and HLA-DQ alleles in the production of anti-Ro in systemic lupus erythematosus[J]. Clin Immunol Immunopathol， 1994，72(3): 335
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8 Veldhoven CHA,Pruijn GJM,Milof JF,et al.Characterization of murine monoclonal antibodies against 60 kD Ro/SSA and La/SSB autoantigens[J]. Clin Exp Immunol,1995，101(1):45
9 Bachmann M, Zaubitzer T, Muller WE. The autoantigen La/SSB:detection on and uptake by mitotic cells[J]. Exp Cell Res，1992, 201(2): 387
(1999-02-20收稿，1999-08-12修回), 百拇医药