糖皮质激素受体基因片段的克隆和目标载体的构建
作者：姚玉成 胡以平
单位：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室，上海，200433
关键词：基因；糖皮质激素受体；目标载体；克隆
第二军医大学学报991006 摘要 目的：构建针对糖皮质激素受体(GR)基因第2外显子的目标载体，为获得糖皮质激素受体基因缺陷型胚胎干细胞准备条件。方法：通过限制性酶切对DNA片段进行了结构分析，克隆相应DNA片段进行DNA序列测定，利用pTK-Neo质粒框架和同源片段构建载体。结果：详细分析了GR基因第2外显子及其侧翼的基因组DNA片段结构，克隆了同源片段，构建了目标载体。结论：这一载体的构建将为进一步建立GR基因剔除小鼠奠定基础，而且有助于深入研究GR基因的表达调控。
中图分类号 Q 781 文献标识码：A
Cloning of genomic fragment of glucocorticoid receptor gene and construction of targeting vector for deletion of GR gene
, 百拇医药
Yao Yucheng, Hu Yiping
(Department of Cell Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University,Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To mutate the mouse glucocorticoid receptor (GR) gene, it is important base to constract targeting vector. Methods: Restriction endoclease was used to analyze the structure of DNA fragment. Some fine regions was cloned and sequenced. Homology regions and pTK-Neo were reconstructed. Results: Based on the feature of these regions and the requirement of knockout identification, the targeting vector was constructed (PTK-NEO-GR). Conclusion: PTK-NEO-GR provides the important base for the generation of the knockout mice of the GR gene and its functional analysis.
, 百拇医药
KEY WORDS genes, glucocorticoid receptor; targeting vector; cloning
糖皮质激素是肾上腺合成分泌的，其作用涉及调节糖和脂类代谢、免疫反应以及各种神经系统的生理反应(如应激反应和行为等)[1]。糖皮质激素的生理作用是通过细胞内糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR) 来介导的，其功能如同一个转录激活因子。小鼠GR基因全长约110 kb, 由9个外显子组成，基因的表达至少受到3个启动子的控制，其中一个是T淋巴细胞专一性的，另外两个在各种细胞和组织中都有不同程度的表达[2]。GR基因第3,4外显子为DNA结合区，第5,6,7,8,9外显子为激素结合区，第2外显子则可能是发挥生理作用的关键部位。由于没有满意的GR基因缺陷的动物模型，对于GR的研究多数停留在细胞和药物引导的动物模型上进行[3]。因此，制作GR基因剔除(knockout)小鼠模型，将为在体内直接进行GR及糖皮质激素的研究提供条件。近几年，Cole和Reichardt等分别用不同的方法将小鼠GR基因的2和3，4外显子破坏，但前者由于致死效应未能获得小鼠模型，而后者虽然获得了模型但却没有表型，因此获得满意的GR基因缺陷型小鼠模型以供研究使用仍是迫切需要解决的问题[4,5]。本研究的目的是构建针对第2外显子的目标载体，为进一步制作GR基因剔除小鼠模型准备条件。为此，我们对从129SvTer小鼠的DNA文库中所克隆的一个约15 kb的含有第2外显子的基因组DNA片段作了限制性酶切图谱分析，克隆了相应的同源片段，利用pTK-Neo质粒构建了针对GR基因第2外显子的目标载体。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料和试剂 pBluescript质粒及DH5α菌种由本室保存；pTK-NEO目标载体框架由美国Roswell Park Cancer Institute的Paul Solowey教授赠送，GR基因片段由本室克隆。限制性内切酶PstⅠ,SalⅠ,EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅢ等，T4 DNA连接酶，DNA polymerase Ilarge(klenow) fragment购自Promega公司；尼龙膜购自Amersham公司；DNA测序试剂盒购自Pharmacia Biotech公司；32P-dCTP购自北京亚辉生物公司；胶回收试剂盒购自Clontech公司；质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物制品公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组片段的连接 限制性内切酶酶切相应片段，以Agarose Ⅰ凝胶电泳分离，胶回收目的片段，粘端连接按插入片段与载体3∶1的比例，以T4 DNA连接酶16～20℃连接12～14 h。平端连接先将插入片段和载体用klenow酶加dNTP补平后，再按上述条件进行连接。
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1.2.2 重组质粒的转化和阳性质粒的筛选 按文献[4]的方法进行重组质粒的转化。得到培养好的转化子后，以牙签挑取法，分别将原平板复制成为编有同样序号的两块培养平板，培养过夜后将一块平板上的转化子保存，用另一块平板上的转化子进行印膜杂交，5～6 h后放射自显影。
1.2.3 重组质粒DNA的初步鉴定 应用碱裂解法小量快速抽提质粒DNA，以相应限制性内切酶酶切，电泳分离，通过分析酶切片段长度来判断重组片段的位置、方向和长度。
1.2.4 重组体DNA序列的分析鉴定 制备聚丙烯酰胺凝胶，以质粒DNA为模板，T3,T7,SP6等为引物，32P-dCTP作为标记物进行测序反应，电泳分离5～8 h后放射自显影。
2 结 果
2.1 GR基因亚克隆片段的获得 通过对GR基因片段的酶谱分析，以pBluescript为载体，分别亚克隆了GR基因第2外显子上游约1.0 kb至其467 bp处的1.4 kb片段、包含从467 kb至第2外显子下游0.5 kb的1.3 kb片段，并分别对其长度和方向作了确定(图1)。以T3和T7为引物进行DNA测序所得结果与该基因的序列是一致的。
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图1 GR基因片段的克隆
Fig 1 Cloning of genomic fragment of GR gene
A:1.4 kb fragment of GR gene; B:1.3 kb fragment
of GR gene
以上结果表明，所得到的两个亚克隆分别含有GR基因中两个相邻的区域，它们的大小、限制性酶切位点及特定区域的核苷酸顺序等条件均能满足进一步的目标载体构建的要求。
2.2 GR基因目标载体的构建 为了避免GR基因第二外显子起始密码与PstⅠ位点之间的467 bp在基因剔除后仍有活性产物产生，干扰基因剔除的效果，在具体的操作中分别以1.4 kb片段中的0.8，1.3 kb片段为同源片段构建载体，过程如图2。
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图2 靶基因PTK-NEO-GR的构建
Fig 2 Construction of the targeting vector
PTK-NEO-GR
经3个同源片段与目标载体框架的重组，并进行转化子的印膜杂交筛选，分别得到0.8 kb片段阳性转化子2个，1.3 kb片段阳性转化子50个,从中得到方向和长度都正确的克隆。目标载体酶切分析见图3。
图3 PTK-NEO-GR的限制性酶切分析
Fig 3 Analysis of PTK-NEO-GR
1: XbaⅠ; 2:SalⅠ+HindⅢ; 3:SalⅠ+SacⅠ;4: SacⅠ;5: HindⅢ+
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BamHⅠ;6:BamHⅠ;7:HindⅢ;M:λHindⅢ marker
以上结果表明，所得到的目标载体的结构与设计要求是一致的，可以用作进一步的小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的转染。
3 讨 论
GR基因第2外显子的完整克隆及部分片段的亚克隆，都严格地进行了分析和鉴定，这对于今后进行GR基因表达调控研究以及功能片段的研究提供了材料。由于有了完整的GR基因第2外显子，对于进行体外表达和其功能特点的特性研究提供了良好的实验材料。GR基因knockout载体的构建成功不仅对于下一步通过ES细胞途径而获得GR基因knockout小鼠模型奠定了基础，而且也为体内、外进行GR基因缺陷型的研究创造了条件，从而在病理生理、生理和免疫等方面的研究中都可能会得到意想不到的结果。
文章编号：0258-879X(1999)10-0726-03
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参考文献
1 Karin M. New twists in gene regulation by glucocorticoid receptor:is DNA binding dispensable[J]? Cell,1998,93(4):487
2 Strahle U, Schmidt A, Kelsey G, et al. At least three promoters direct expression of the mouse glucocorticoid receptor gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89(15):6731
3 Danielsen M, Northrop JP,Ringold GM. The mouse glucocorticoid receptor: mapping of functional domains by cloning, sequencing and expression of wild-type and mutant receptor proteins[J]. EMBO J, 1986,5(10):2513
, 百拇医药
4 Cole TJ, Blendy JA, Monaghan AP, et al. Targeted disruption of the glucocorticoid receptor gene blocks adrenergic chromaffin cell development and severely retards lung maturation[J]. Genes Devel,1995,9(13):1608
5 Reichardt HM, Kaestner KH, Tuckermann J, et al. DNA binding of the glucocorticoid receptor is not essential for survival[J]. Cell,1998, 93(4):531
(1999-01-26收稿，1999-08-20修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室，上海，200433
关键词：基因；糖皮质激素受体；目标载体；克隆
第二军医大学学报991006 摘要 目的：构建针对糖皮质激素受体(GR)基因第2外显子的目标载体，为获得糖皮质激素受体基因缺陷型胚胎干细胞准备条件。方法：通过限制性酶切对DNA片段进行了结构分析，克隆相应DNA片段进行DNA序列测定，利用pTK-Neo质粒框架和同源片段构建载体。结果：详细分析了GR基因第2外显子及其侧翼的基因组DNA片段结构，克隆了同源片段，构建了目标载体。结论：这一载体的构建将为进一步建立GR基因剔除小鼠奠定基础，而且有助于深入研究GR基因的表达调控。
中图分类号 Q 781 文献标识码：A
Cloning of genomic fragment of glucocorticoid receptor gene and construction of targeting vector for deletion of GR gene
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Yao Yucheng, Hu Yiping
(Department of Cell Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University,Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To mutate the mouse glucocorticoid receptor (GR) gene, it is important base to constract targeting vector. Methods: Restriction endoclease was used to analyze the structure of DNA fragment. Some fine regions was cloned and sequenced. Homology regions and pTK-Neo were reconstructed. Results: Based on the feature of these regions and the requirement of knockout identification, the targeting vector was constructed (PTK-NEO-GR). Conclusion: PTK-NEO-GR provides the important base for the generation of the knockout mice of the GR gene and its functional analysis.
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KEY WORDS genes, glucocorticoid receptor; targeting vector; cloning
糖皮质激素是肾上腺合成分泌的，其作用涉及调节糖和脂类代谢、免疫反应以及各种神经系统的生理反应(如应激反应和行为等)[1]。糖皮质激素的生理作用是通过细胞内糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR) 来介导的，其功能如同一个转录激活因子。小鼠GR基因全长约110 kb, 由9个外显子组成，基因的表达至少受到3个启动子的控制，其中一个是T淋巴细胞专一性的，另外两个在各种细胞和组织中都有不同程度的表达[2]。GR基因第3,4外显子为DNA结合区，第5,6,7,8,9外显子为激素结合区，第2外显子则可能是发挥生理作用的关键部位。由于没有满意的GR基因缺陷的动物模型，对于GR的研究多数停留在细胞和药物引导的动物模型上进行[3]。因此，制作GR基因剔除(knockout)小鼠模型，将为在体内直接进行GR及糖皮质激素的研究提供条件。近几年，Cole和Reichardt等分别用不同的方法将小鼠GR基因的2和3，4外显子破坏，但前者由于致死效应未能获得小鼠模型，而后者虽然获得了模型但却没有表型，因此获得满意的GR基因缺陷型小鼠模型以供研究使用仍是迫切需要解决的问题[4,5]。本研究的目的是构建针对第2外显子的目标载体，为进一步制作GR基因剔除小鼠模型准备条件。为此，我们对从129SvTer小鼠的DNA文库中所克隆的一个约15 kb的含有第2外显子的基因组DNA片段作了限制性酶切图谱分析，克隆了相应的同源片段，利用pTK-Neo质粒构建了针对GR基因第2外显子的目标载体。
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1 材料和方法
1.1 材料和试剂 pBluescript质粒及DH5α菌种由本室保存；pTK-NEO目标载体框架由美国Roswell Park Cancer Institute的Paul Solowey教授赠送，GR基因片段由本室克隆。限制性内切酶PstⅠ,SalⅠ,EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅢ等，T4 DNA连接酶，DNA polymerase Ilarge(klenow) fragment购自Promega公司；尼龙膜购自Amersham公司；DNA测序试剂盒购自Pharmacia Biotech公司；32P-dCTP购自北京亚辉生物公司；胶回收试剂盒购自Clontech公司；质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物制品公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组片段的连接 限制性内切酶酶切相应片段，以Agarose Ⅰ凝胶电泳分离，胶回收目的片段，粘端连接按插入片段与载体3∶1的比例，以T4 DNA连接酶16～20℃连接12～14 h。平端连接先将插入片段和载体用klenow酶加dNTP补平后，再按上述条件进行连接。
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1.2.2 重组质粒的转化和阳性质粒的筛选 按文献[4]的方法进行重组质粒的转化。得到培养好的转化子后，以牙签挑取法，分别将原平板复制成为编有同样序号的两块培养平板，培养过夜后将一块平板上的转化子保存，用另一块平板上的转化子进行印膜杂交，5～6 h后放射自显影。
1.2.3 重组质粒DNA的初步鉴定 应用碱裂解法小量快速抽提质粒DNA，以相应限制性内切酶酶切，电泳分离，通过分析酶切片段长度来判断重组片段的位置、方向和长度。
1.2.4 重组体DNA序列的分析鉴定 制备聚丙烯酰胺凝胶，以质粒DNA为模板，T3,T7,SP6等为引物，32P-dCTP作为标记物进行测序反应，电泳分离5～8 h后放射自显影。
2 结 果
2.1 GR基因亚克隆片段的获得 通过对GR基因片段的酶谱分析，以pBluescript为载体，分别亚克隆了GR基因第2外显子上游约1.0 kb至其467 bp处的1.4 kb片段、包含从467 kb至第2外显子下游0.5 kb的1.3 kb片段，并分别对其长度和方向作了确定(图1)。以T3和T7为引物进行DNA测序所得结果与该基因的序列是一致的。
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图1 GR基因片段的克隆
Fig 1 Cloning of genomic fragment of GR gene
A:1.4 kb fragment of GR gene; B:1.3 kb fragment
of GR gene
以上结果表明，所得到的两个亚克隆分别含有GR基因中两个相邻的区域，它们的大小、限制性酶切位点及特定区域的核苷酸顺序等条件均能满足进一步的目标载体构建的要求。
2.2 GR基因目标载体的构建 为了避免GR基因第二外显子起始密码与PstⅠ位点之间的467 bp在基因剔除后仍有活性产物产生，干扰基因剔除的效果，在具体的操作中分别以1.4 kb片段中的0.8，1.3 kb片段为同源片段构建载体，过程如图2。
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图2 靶基因PTK-NEO-GR的构建
Fig 2 Construction of the targeting vector
PTK-NEO-GR
经3个同源片段与目标载体框架的重组，并进行转化子的印膜杂交筛选，分别得到0.8 kb片段阳性转化子2个，1.3 kb片段阳性转化子50个,从中得到方向和长度都正确的克隆。目标载体酶切分析见图3。
图3 PTK-NEO-GR的限制性酶切分析
Fig 3 Analysis of PTK-NEO-GR
1: XbaⅠ; 2:SalⅠ+HindⅢ; 3:SalⅠ+SacⅠ;4: SacⅠ;5: HindⅢ+
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BamHⅠ;6:BamHⅠ;7:HindⅢ;M:λHindⅢ marker
以上结果表明，所得到的目标载体的结构与设计要求是一致的，可以用作进一步的小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的转染。
3 讨 论
GR基因第2外显子的完整克隆及部分片段的亚克隆，都严格地进行了分析和鉴定，这对于今后进行GR基因表达调控研究以及功能片段的研究提供了材料。由于有了完整的GR基因第2外显子，对于进行体外表达和其功能特点的特性研究提供了良好的实验材料。GR基因knockout载体的构建成功不仅对于下一步通过ES细胞途径而获得GR基因knockout小鼠模型奠定了基础，而且也为体内、外进行GR基因缺陷型的研究创造了条件，从而在病理生理、生理和免疫等方面的研究中都可能会得到意想不到的结果。
文章编号：0258-879X(1999)10-0726-03
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参考文献
1 Karin M. New twists in gene regulation by glucocorticoid receptor:is DNA binding dispensable[J]? Cell,1998,93(4):487
2 Strahle U, Schmidt A, Kelsey G, et al. At least three promoters direct expression of the mouse glucocorticoid receptor gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89(15):6731
3 Danielsen M, Northrop JP,Ringold GM. The mouse glucocorticoid receptor: mapping of functional domains by cloning, sequencing and expression of wild-type and mutant receptor proteins[J]. EMBO J, 1986,5(10):2513
, 百拇医药
4 Cole TJ, Blendy JA, Monaghan AP, et al. Targeted disruption of the glucocorticoid receptor gene blocks adrenergic chromaffin cell development and severely retards lung maturation[J]. Genes Devel,1995,9(13):1608
5 Reichardt HM, Kaestner KH, Tuckermann J, et al. DNA binding of the glucocorticoid receptor is not essential for survival[J]. Cell,1998, 93(4):531
(1999-01-26收稿，1999-08-20修回), http://www.100md.com