丁型肝炎重型化机制中Fas/FasL的作用
作者：顾小红 李奇芬 张云东
单位：顾小红 李奇芬(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心) 重庆，400038；张云东(附属大坪医院野战外科研究所神经外科) 重庆，400042
关键词：丁型肝炎；丁型肝炎病毒抗原；Fas；Fas配体；免疫组化
提 要 目的
提 要 目的：探讨Fas/FasL途径介导的肝细胞凋亡在丁型肝炎重型化机制中的作用。方法：采用免疫组化双重染色和连续切片技术，检测48例丁型肝炎病人肝组织丁型肝炎病毒抗原HDAg、Fas/FasL表达，以54例乙型肝炎作疾病对照。结果：Fas以肝细胞浆表达为主，HDAg以核浆型表达为主，两抗原表达及分布有相关性。FasL主要表达在浸润淋巴细胞浆、肝细胞核，与HDAg表达及分布不全一致，丁型肝炎Fas、FasL检出率及表达强度较对照组高，HDAg、Fas、FasL 3成分在各型肝炎中的表达强度有显著性差异。结论：HDV感染可诱导肝细胞表达Fas,细胞毒T淋巴细胞(CTL)通过Fas/FasL途径介导的肝细胞凋亡在丁型肝炎病情重型化机制中可能有重要作用。
, 百拇医药
中图法分类号 R512.6+4 文献标识码：A
The role of Fas and FasL in pathogenetic mechanisms of severe hepatitis D
Gu Xiaohong, Li Qifen, Zhang Yundong (Center of Infections Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract Objective: To study the pathogenetic role and expression of Fas antigen (Fas) and Fas ligand (FasL) in severe cases of hepatitis D. Methods: Immunohistochemistry, double staining and serial section techniques were employed to study the expression of Fas, FasL and hepatitis D virus antigen (HDAg) in liver biopsy specimens of 48 cases of hepatitis D. Results: Fas was mainly expressed in the cytoplasm of hepatocytes, HDAg in the nucleus of hepatocytes and FasL in the cytoplasm of infiltrating lymphocytes and the nucleus of hepatocytes. Most of the positive hepatocytes were distributed in the spaces between infiltrating lymphocytes especially along the advancing edge of “piecemeal necrosis”. The distribution and expression of Fas and HDAg were quite closely correlated in hepatitis D. The expression intensity of Fas, FasL and HDAg in hepatocytes was quite different in various types of hepatitis (P<0.01). The detection rate and Kiyoshi's score of Fas and FasL were higher in HDV infection than in HBV infection. Conclusion: In HDV infection, the distribution and expression of Fas, FasL and HDAg are significantly correlated to the inflammation intensity and the severity of liver damage. HDV infection induces the expression of Fas in the hepatocytes and apoptosis caused by cytotoxic T cells through Fas-FasL interaction may play an important role in hepatocyte damage in HDV infection.
, http://www.100md.com
Key words hepatitis D; hepatitis D virus antigen; Fas; Fas ligand; immunohistochemistry
丁型肝炎病毒(HDV)感染比单独HBV感染的病情及病理改变严重，其机制不十分清楚。在病毒性肝炎的组织病理研究中发现由细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)介导的肝细胞凋亡起重要作用，而肝细胞凋亡机制中：Fas/FasL(Fas ligand)是其主要途径之一[1]。为了解细胞凋亡相关分子Fas/FasL在丁型肝炎发病机制中的作用，我们采用了免疫组化双重染色技术，对48例丁型肝炎病人肝组织Fas/FasL和丁型肝炎病毒抗原(Hepatitis D virus antigen,HDAg)表达进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 病例和标本
, 百拇医药
病例均为我院住院病人，丁型肝炎48例，其中急性肝炎(Acute hepatitis D,AHD)5例，慢性肝炎轻度(Chronic hepatitis D mild,CHD-Mild)5例，慢性肝炎中度(Chronic hepatitis D moderate,CHD-Mode)22例，重型肝炎(Severe hepatitis D,SHD)16例(含慢性肝炎重度9例，亚急性重型肝炎7例)。乙型肝炎组54例，其中AHB 8例，CHB-Mild 13例，CHB-Mode 29例，SHB 4例(慢性肝炎重度2例，亚急性重症肝炎2例)，所有病例均经肝组织病理检查确诊。每例患者经皮肝穿获得肝组织，标本均固定于10%中性福尔马林，常规石蜡包埋，用于免疫组化检测。
1.2 主要试剂来源
兔抗人Fas、FasL多克隆抗体和免疫组化双标记(His-tostain-DS)试剂盒为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术公司，丁型肝炎多克隆抗体由本科自行选定的HDV合成肽抗原经免疫家兔制备[2]，工作浓度1∶160。免疫组化染色的过氧化酶标记选用链霉卵白素(S-P)试剂盒，为美国Maxin Biotech Inc产品，购自福州迈新生物技术开发公司。操作步骤按试剂盒说明书进行。
, 百拇医药
1.3 对照
阳性对照为已知Fas、FasL和HDAg阳性的丁型肝炎肝组织切片，阴性对照选自正常人肝组织，血清各型肝炎标志物均阴性，包括肝组织Fas、FasL、HDAg、HBsAg、HBeAg、HBcAg及HCVNS3抗原免疫组化检测为阴性。此外，分别用鼠血清和PBS代替第一抗体作为替代实验，每张切片先分别检测Fas、FasL和HDAg，然后进行双重染色检测。
1.4 结果判断标准
免疫组化：有棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性，无色者为阴性。双重染色：Fas、FasL阳性颗NBT显色为紫黑色，HDAg阳性颗粒AEC显色为红棕色。结果半定量分析参照Kiyoshi[3]法：未见阳性颗粒为(-)，阳性颗粒占肝小叶全部肝细胞的1/3以下为(+)，1/3～2/3为(+ +)，2/3以上为(+++)。
1.5 统计学处理
, 百拇医药
采用χ2检验。
2 结果
2.1 丁型肝炎HDAg、Fas和FasL表达
HDAg阳性物呈细颗粒状弥漫分布于肝细胞内，以胞核表达最多，其次是胞浆。在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDAg呈浆型强阳性表达，还发现HDAg阳性标记呈眉弓状分布在有病变的肝细胞膜下。各型肝炎HDAg阳性细胞分布各有特点：CHD-Mode和SHD中HDAg阳性细胞呈弥散型、灶型、片簇状分布于肝小叶内，在门脉周围、坏死灶处较密集，见图1。在AHD和CHD-Mild，HDAg阳性细胞多呈单个或小灶状稀疏分布于小叶内。HDAg阳性表达强度及阳性细胞分布均与肝组织炎症活动度及病理损害程度正相关(P<0.01),见表1。
, 百拇医药
图1 慢性丁型肝炎中度病人肝组织HDAg表达 (S-P×200)
Fig 1 Expression of HDAg in liver tissue of patients with moderate chronic hepatitis D (S-P×200)
表1 各型丁型肝炎Fas、FasL表达
Tab 1 Expression of Fas and FasL in different hepatitis D types
Type
n
Hepatitis D
n
, 百拇医药
Hepatatis B
Fas
FasL
Fas
FasL
-
+
+ +
+++
Total
-
+
+ +
, 百拇医药
+++
Total
-
+
+ +
+++
Total
-
+
++
+++
Total
AHD
, 百拇医药 5
2
2
1
0
3(60%)
2
2
1
0
3(60%)
8
4
2
, http://www.100md.com
2
0
4(50%)
3
4
1
0
5(63%)
CHD-Mild
5
1
3
1
0
, 百拇医药
4(80%)
3
1
1
0
2(40%)
13
5
7
1
0
8(62%)
5
5
, 百拇医药
3
0
8(62%)
CHD-Mode
22
1
8
10
3
21(95%)
2
5
13
, 百拇医药 2
20(91%)
29
7
11
7
4
22(75%)
6
9
12
2
23(79%)
SHD
, 百拇医药
16
0
0
9
7
16(100%)
0
1
6
9
16(100%)
4
0
0
, http://www.100md.com
2
2
4(100%)
0
0
2
2
4(100%)
Total
48
4
13
21
, 百拇医药 10
44(92%)△
7
9
21
11
41(85%)
54
16
20
12
6
38(70%)
, 百拇医药
14
18
18
4
40(74%)
△:P<0.01 vs Fas expression of hepatitis B
Fas主要表达于肝细胞浆内，在CHD-Mode和SHD中，阳性细胞呈小灶状或片簇状分布于肝小叶周边，主要在门脉周围、碎屑状坏死区尤其明显，见图2，在CHD-Milde和AHD中，阳性细胞较少且分散，表达强度也较弱；乙型肝炎肝组织中，Fas表达及阳性细胞分布基本与丁型肝炎的一致，但片簇状较少见，表达程度稍弱。
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图2 慢性丁型肝炎中度病人肝组织Fas表达 (S-P×400)
Fig 2 Expression of Fas in liver tissue of patients with moderate chronic hepatitis D (S-P×400)
FasL主要表达在浸润的淋巴细胞浆或肝细胞核内，阳性细胞主要在肝小叶碎屑状、桥样及灶状坏死区较为密集，见图3。各型肝炎中FasL表达强度、阳性细胞分布在CHD-Mode和SHD中较在AHD和CHD-Mild强、密集；乙型肝炎中Fas、FasL表达及阳性细胞分布与丁型肝炎基本一致。2组比较，丁型肝炎Fas阳性检测率和表达强度较乙型肝炎高，见表2。
, 百拇医药
图3 慢性丁型肝炎中度病人肝组织中浸润淋巴细胞
和肝细胞FasL表达 (S-P×400)
Fig 3 Expression of FasL in infiltrating lymphocytes and hepatocytes in liver tissue of patients with moderate chronic hepatitis D (S-P×400)
表2 各型丁型肝炎HDAg表达状况
Tab 2 Degree of HDAg-Positivity in different hrpatitis D types
Type
n
, 百拇医药
+
+ +
+ + +
AHD
5
3
2
0
CHD-Mild
5
4
1
0
CHD-Mode
, 百拇医药
22
3
12
7
SHD
16
0
8
8
Total
48
10(21%)
23(48%)
, http://www.100md.com 15(31%)
2.2 丁型肝炎病人肝组织HDAg和Fas/FasL关系
双标记检测发现HDAg、Fas/FasL结果与单标记检测基本一致。Fas、HDAg多同时表达在同一肝细胞，单独表达的细胞也有，但数量较少，阳性细胞分布比较一致，HDAg和FasL亦可同时表达于同一肝细胞，但数目较少，较多见的是2种抗原各自表达于不同的肝细胞，可见汇管区浸润的淋巴细胞大量表达FasL,HDAg阳性细胞明显多于FasL阳性细胞，FasL、HDAg阳性细胞分布也不全一致。另外发现Fas和FasL在肝细胞内，多数为同时表达，少数肝细胞可Fas强FasL弱或Fas弱FasL强表达。
3 讨论
Fas是介导细胞凋亡的Ⅰ型膜蛋白，含325个氨基酸，分子量为45×103u，属肿瘤坏死因子α受体(TNF-α)家族，Fas蛋白位于细胞膜内的C端，有一段80个氨基酸序列与细胞凋亡信号传递相关，称为“死亡信号传递区”[4]，是凋亡因子受体，起凋亡“按钮”的作用；作为死亡因子的Fas配体FasL是Ⅱ型膜蛋白，分子量约40×103u，是Fas的天然配体，当Fas配体或抗体与Fas结合即启动细胞死亡程序，对表达Fas的细胞有很强的杀伤作用。病毒性肝炎时，感染病毒的肝细胞膜上有大量病毒抗原存在，可诱生Fas表达[5]，Fas和FasL相互作用是介导肝细胞凋亡的主要途径之一[1]。
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实验可见Fas强FasL弱或Fas弱FasL强表达，但二者阳性强度均随组织炎症坏死程度加重而增强，推测其意义可能为：同一肝细胞自身的Fas和FasL交联，通过顺式触发使肝细胞发生“自杀(Suicide)”或分别表达Fas或FasL相邻肝细胞相互交联，导致“同胞残杀(Fratricide)”[5]。另外发现不是所有病毒抗原和Fas抗原表达的区域都有淋巴细胞浸润，因此推测除了表达FasL的CTL与靶细胞Fas结合介导细胞凋亡外，有可能存在其它方式，如自分泌性杀伤及旁分泌死亡等途径[6]，即表达FasL的CTL等细胞分泌可溶性FasL(SFasL)，通过血循环到达靶肝细胞，从而介导肝细胞凋亡。另外由于CTL通过Fas/FasL路径引起的细胞凋亡缺乏抗原特异性，凡是Fas阳性的细胞都有可能被激活的FasL阳性CTL诱导而凋亡，与细胞是否携带病毒抗原无关，就是所谓的“旁观者溶解(Bystander Lysis)”[7]。在研究发现FasL表达及阳性细胞分布与Fas、HDAg表达及阳性细胞分布不全一致，却与肝组织炎症及病理损害一致，提示也可能存在旁观者效应。
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丁型肝炎病人肝组织有Fas/FasL表达，对HDAg、Fas、FasL在各型肝炎的表达强度分析发现：Fas、FasL、HDAg均与肝组织炎症活动度和病理损害程度正相关，且丁型肝炎Fas、FasL检出率较乙型肝炎高，提示：Fas/FasL与HDV致病可能有关。丁型肝炎中除了乙肝病毒抗原可诱导肝细胞表达Fas外，HDAg也可诱生肝细胞表达Fas,正是HDV感染后HDAg诱导Fas表达的叠加作用，使感染HDV的病人大量或过度表达Fas，同时与浸润的淋巴细胞(CTL)、肝细胞的FasL及血浆中SFasL结合，一方面导致肝细胞凋亡，被病毒感染的细胞随之被清除；另一方面则导致大量肝细胞坏死，使病情和病理损害加重。因此，在丁型肝炎病情重型化机制中，CTL通过Fas/FasL途径介导的肝细胞凋亡可能有重要作用。
作者简介：顾小红，女，31岁，主治医师，硕士，现在附属大坪医院野战外科研究所消化内科 重庆，400042
参考文献
, http://www.100md.com
1 Kaga D, Vignaux F, Ledermann B, et al. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity. Science,1994,265(3):528
2 郑 红，李奇芬，林晓红，等.人工合成丁型肝炎病毒抗原多肽片段的特征与临床应用.中华医学杂志，1993，77(5)：273
3 Kiyoshi M, Norio H, Naoki H, et al. Fas antigen expression in liver tissues of patients with chronic hepatitis B. J of Hepatol,1996,24(1):1
4 Trauth B C, Klas C, Peters A M, et al. Monoclone antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science,1989,245(7):301
, 百拇医药
5 Galle P R, Hofmann W J, Walczak H, et al. Involvement of the CD95(APO-/Fas) receptor and ligand in liver damage. J Eep Med,1995,182(5):1223
6 Smolarek C, Strand S, Krammer P H, et al. The Apo-1/Fas(C95) system is involved in bile-acid induced apoptosis in human hepatocytes. Hepatology,1996,24(4):956
7 Badley A D, McElhinny J A, Leibson P J, et al. Upregulation of Fas ligand expression by human immunodeficiency virus in human macrophages mediates apoptosis of uninfected T lymphocgtes. J Virol,1996,70(1):199
(收稿：1999-04-15；修回：1999-07-20), http://www.100md.com
单位：顾小红 李奇芬(第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心) 重庆，400038；张云东(附属大坪医院野战外科研究所神经外科) 重庆，400042
关键词：丁型肝炎；丁型肝炎病毒抗原；Fas；Fas配体；免疫组化
提 要 目的
提 要 目的：探讨Fas/FasL途径介导的肝细胞凋亡在丁型肝炎重型化机制中的作用。方法：采用免疫组化双重染色和连续切片技术，检测48例丁型肝炎病人肝组织丁型肝炎病毒抗原HDAg、Fas/FasL表达，以54例乙型肝炎作疾病对照。结果：Fas以肝细胞浆表达为主，HDAg以核浆型表达为主，两抗原表达及分布有相关性。FasL主要表达在浸润淋巴细胞浆、肝细胞核，与HDAg表达及分布不全一致，丁型肝炎Fas、FasL检出率及表达强度较对照组高，HDAg、Fas、FasL 3成分在各型肝炎中的表达强度有显著性差异。结论：HDV感染可诱导肝细胞表达Fas,细胞毒T淋巴细胞(CTL)通过Fas/FasL途径介导的肝细胞凋亡在丁型肝炎病情重型化机制中可能有重要作用。
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中图法分类号 R512.6+4 文献标识码：A
The role of Fas and FasL in pathogenetic mechanisms of severe hepatitis D
Gu Xiaohong, Li Qifen, Zhang Yundong (Center of Infections Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract Objective: To study the pathogenetic role and expression of Fas antigen (Fas) and Fas ligand (FasL) in severe cases of hepatitis D. Methods: Immunohistochemistry, double staining and serial section techniques were employed to study the expression of Fas, FasL and hepatitis D virus antigen (HDAg) in liver biopsy specimens of 48 cases of hepatitis D. Results: Fas was mainly expressed in the cytoplasm of hepatocytes, HDAg in the nucleus of hepatocytes and FasL in the cytoplasm of infiltrating lymphocytes and the nucleus of hepatocytes. Most of the positive hepatocytes were distributed in the spaces between infiltrating lymphocytes especially along the advancing edge of “piecemeal necrosis”. The distribution and expression of Fas and HDAg were quite closely correlated in hepatitis D. The expression intensity of Fas, FasL and HDAg in hepatocytes was quite different in various types of hepatitis (P<0.01). The detection rate and Kiyoshi's score of Fas and FasL were higher in HDV infection than in HBV infection. Conclusion: In HDV infection, the distribution and expression of Fas, FasL and HDAg are significantly correlated to the inflammation intensity and the severity of liver damage. HDV infection induces the expression of Fas in the hepatocytes and apoptosis caused by cytotoxic T cells through Fas-FasL interaction may play an important role in hepatocyte damage in HDV infection.
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Key words hepatitis D; hepatitis D virus antigen; Fas; Fas ligand; immunohistochemistry
丁型肝炎病毒(HDV)感染比单独HBV感染的病情及病理改变严重，其机制不十分清楚。在病毒性肝炎的组织病理研究中发现由细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)介导的肝细胞凋亡起重要作用，而肝细胞凋亡机制中：Fas/FasL(Fas ligand)是其主要途径之一[1]。为了解细胞凋亡相关分子Fas/FasL在丁型肝炎发病机制中的作用，我们采用了免疫组化双重染色技术，对48例丁型肝炎病人肝组织Fas/FasL和丁型肝炎病毒抗原(Hepatitis D virus antigen,HDAg)表达进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 病例和标本
, 百拇医药
病例均为我院住院病人，丁型肝炎48例，其中急性肝炎(Acute hepatitis D,AHD)5例，慢性肝炎轻度(Chronic hepatitis D mild,CHD-Mild)5例，慢性肝炎中度(Chronic hepatitis D moderate,CHD-Mode)22例，重型肝炎(Severe hepatitis D,SHD)16例(含慢性肝炎重度9例，亚急性重型肝炎7例)。乙型肝炎组54例，其中AHB 8例，CHB-Mild 13例，CHB-Mode 29例，SHB 4例(慢性肝炎重度2例，亚急性重症肝炎2例)，所有病例均经肝组织病理检查确诊。每例患者经皮肝穿获得肝组织，标本均固定于10%中性福尔马林，常规石蜡包埋，用于免疫组化检测。
1.2 主要试剂来源
兔抗人Fas、FasL多克隆抗体和免疫组化双标记(His-tostain-DS)试剂盒为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术公司，丁型肝炎多克隆抗体由本科自行选定的HDV合成肽抗原经免疫家兔制备[2]，工作浓度1∶160。免疫组化染色的过氧化酶标记选用链霉卵白素(S-P)试剂盒，为美国Maxin Biotech Inc产品，购自福州迈新生物技术开发公司。操作步骤按试剂盒说明书进行。
, 百拇医药
1.3 对照
阳性对照为已知Fas、FasL和HDAg阳性的丁型肝炎肝组织切片，阴性对照选自正常人肝组织，血清各型肝炎标志物均阴性，包括肝组织Fas、FasL、HDAg、HBsAg、HBeAg、HBcAg及HCVNS3抗原免疫组化检测为阴性。此外，分别用鼠血清和PBS代替第一抗体作为替代实验，每张切片先分别检测Fas、FasL和HDAg，然后进行双重染色检测。
1.4 结果判断标准
免疫组化：有棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性，无色者为阴性。双重染色：Fas、FasL阳性颗NBT显色为紫黑色，HDAg阳性颗粒AEC显色为红棕色。结果半定量分析参照Kiyoshi[3]法：未见阳性颗粒为(-)，阳性颗粒占肝小叶全部肝细胞的1/3以下为(+)，1/3～2/3为(+ +)，2/3以上为(+++)。
1.5 统计学处理
, 百拇医药
采用χ2检验。
2 结果
2.1 丁型肝炎HDAg、Fas和FasL表达
HDAg阳性物呈细颗粒状弥漫分布于肝细胞内，以胞核表达最多，其次是胞浆。在坏死灶边缘肝细胞和气球样变肝细胞浆内有大量的HDAg呈浆型强阳性表达，还发现HDAg阳性标记呈眉弓状分布在有病变的肝细胞膜下。各型肝炎HDAg阳性细胞分布各有特点：CHD-Mode和SHD中HDAg阳性细胞呈弥散型、灶型、片簇状分布于肝小叶内，在门脉周围、坏死灶处较密集，见图1。在AHD和CHD-Mild，HDAg阳性细胞多呈单个或小灶状稀疏分布于小叶内。HDAg阳性表达强度及阳性细胞分布均与肝组织炎症活动度及病理损害程度正相关(P<0.01),见表1。
, 百拇医药
图1 慢性丁型肝炎中度病人肝组织HDAg表达 (S-P×200)
Fig 1 Expression of HDAg in liver tissue of patients with moderate chronic hepatitis D (S-P×200)
表1 各型丁型肝炎Fas、FasL表达
Tab 1 Expression of Fas and FasL in different hepatitis D types
Type
n
Hepatitis D
n
, 百拇医药
Hepatatis B
Fas
FasL
Fas
FasL
-
+
+ +
+++
Total
-
+
+ +
, 百拇医药
+++
Total
-
+
+ +
+++
Total
-
+
++
+++
Total
AHD
, 百拇医药 5
2
2
1
0
3(60%)
2
2
1
0
3(60%)
8
4
2
, http://www.100md.com
2
0
4(50%)
3
4
1
0
5(63%)
CHD-Mild
5
1
3
1
0
, 百拇医药
4(80%)
3
1
1
0
2(40%)
13
5
7
1
0
8(62%)
5
5
, 百拇医药
3
0
8(62%)
CHD-Mode
22
1
8
10
3
21(95%)
2
5
13
, 百拇医药 2
20(91%)
29
7
11
7
4
22(75%)
6
9
12
2
23(79%)
SHD
, 百拇医药
16
0
0
9
7
16(100%)
0
1
6
9
16(100%)
4
0
0
, http://www.100md.com
2
2
4(100%)
0
0
2
2
4(100%)
Total
48
4
13
21
, 百拇医药 10
44(92%)△
7
9
21
11
41(85%)
54
16
20
12
6
38(70%)
, 百拇医药
14
18
18
4
40(74%)
△:P<0.01 vs Fas expression of hepatitis B
Fas主要表达于肝细胞浆内，在CHD-Mode和SHD中，阳性细胞呈小灶状或片簇状分布于肝小叶周边，主要在门脉周围、碎屑状坏死区尤其明显，见图2，在CHD-Milde和AHD中，阳性细胞较少且分散，表达强度也较弱；乙型肝炎肝组织中，Fas表达及阳性细胞分布基本与丁型肝炎的一致，但片簇状较少见，表达程度稍弱。
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图2 慢性丁型肝炎中度病人肝组织Fas表达 (S-P×400)
Fig 2 Expression of Fas in liver tissue of patients with moderate chronic hepatitis D (S-P×400)
FasL主要表达在浸润的淋巴细胞浆或肝细胞核内，阳性细胞主要在肝小叶碎屑状、桥样及灶状坏死区较为密集，见图3。各型肝炎中FasL表达强度、阳性细胞分布在CHD-Mode和SHD中较在AHD和CHD-Mild强、密集；乙型肝炎中Fas、FasL表达及阳性细胞分布与丁型肝炎基本一致。2组比较，丁型肝炎Fas阳性检测率和表达强度较乙型肝炎高，见表2。
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图3 慢性丁型肝炎中度病人肝组织中浸润淋巴细胞
和肝细胞FasL表达 (S-P×400)
Fig 3 Expression of FasL in infiltrating lymphocytes and hepatocytes in liver tissue of patients with moderate chronic hepatitis D (S-P×400)
表2 各型丁型肝炎HDAg表达状况
Tab 2 Degree of HDAg-Positivity in different hrpatitis D types
Type
n
, 百拇医药
+
+ +
+ + +
AHD
5
3
2
0
CHD-Mild
5
4
1
0
CHD-Mode
, 百拇医药
22
3
12
7
SHD
16
0
8
8
Total
48
10(21%)
23(48%)
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2.2 丁型肝炎病人肝组织HDAg和Fas/FasL关系
双标记检测发现HDAg、Fas/FasL结果与单标记检测基本一致。Fas、HDAg多同时表达在同一肝细胞，单独表达的细胞也有，但数量较少，阳性细胞分布比较一致，HDAg和FasL亦可同时表达于同一肝细胞，但数目较少，较多见的是2种抗原各自表达于不同的肝细胞，可见汇管区浸润的淋巴细胞大量表达FasL,HDAg阳性细胞明显多于FasL阳性细胞，FasL、HDAg阳性细胞分布也不全一致。另外发现Fas和FasL在肝细胞内，多数为同时表达，少数肝细胞可Fas强FasL弱或Fas弱FasL强表达。
3 讨论
Fas是介导细胞凋亡的Ⅰ型膜蛋白，含325个氨基酸，分子量为45×103u，属肿瘤坏死因子α受体(TNF-α)家族，Fas蛋白位于细胞膜内的C端，有一段80个氨基酸序列与细胞凋亡信号传递相关，称为“死亡信号传递区”[4]，是凋亡因子受体，起凋亡“按钮”的作用；作为死亡因子的Fas配体FasL是Ⅱ型膜蛋白，分子量约40×103u，是Fas的天然配体，当Fas配体或抗体与Fas结合即启动细胞死亡程序，对表达Fas的细胞有很强的杀伤作用。病毒性肝炎时，感染病毒的肝细胞膜上有大量病毒抗原存在，可诱生Fas表达[5]，Fas和FasL相互作用是介导肝细胞凋亡的主要途径之一[1]。
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实验可见Fas强FasL弱或Fas弱FasL强表达，但二者阳性强度均随组织炎症坏死程度加重而增强，推测其意义可能为：同一肝细胞自身的Fas和FasL交联，通过顺式触发使肝细胞发生“自杀(Suicide)”或分别表达Fas或FasL相邻肝细胞相互交联，导致“同胞残杀(Fratricide)”[5]。另外发现不是所有病毒抗原和Fas抗原表达的区域都有淋巴细胞浸润，因此推测除了表达FasL的CTL与靶细胞Fas结合介导细胞凋亡外，有可能存在其它方式，如自分泌性杀伤及旁分泌死亡等途径[6]，即表达FasL的CTL等细胞分泌可溶性FasL(SFasL)，通过血循环到达靶肝细胞，从而介导肝细胞凋亡。另外由于CTL通过Fas/FasL路径引起的细胞凋亡缺乏抗原特异性，凡是Fas阳性的细胞都有可能被激活的FasL阳性CTL诱导而凋亡，与细胞是否携带病毒抗原无关，就是所谓的“旁观者溶解(Bystander Lysis)”[7]。在研究发现FasL表达及阳性细胞分布与Fas、HDAg表达及阳性细胞分布不全一致，却与肝组织炎症及病理损害一致，提示也可能存在旁观者效应。
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丁型肝炎病人肝组织有Fas/FasL表达，对HDAg、Fas、FasL在各型肝炎的表达强度分析发现：Fas、FasL、HDAg均与肝组织炎症活动度和病理损害程度正相关，且丁型肝炎Fas、FasL检出率较乙型肝炎高，提示：Fas/FasL与HDV致病可能有关。丁型肝炎中除了乙肝病毒抗原可诱导肝细胞表达Fas外，HDAg也可诱生肝细胞表达Fas,正是HDV感染后HDAg诱导Fas表达的叠加作用，使感染HDV的病人大量或过度表达Fas，同时与浸润的淋巴细胞(CTL)、肝细胞的FasL及血浆中SFasL结合，一方面导致肝细胞凋亡，被病毒感染的细胞随之被清除；另一方面则导致大量肝细胞坏死，使病情和病理损害加重。因此，在丁型肝炎病情重型化机制中，CTL通过Fas/FasL途径介导的肝细胞凋亡可能有重要作用。
作者简介：顾小红，女，31岁，主治医师，硕士，现在附属大坪医院野战外科研究所消化内科 重庆，400042
参考文献
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(收稿：1999-04-15；修回：1999-07-20), http://www.100md.com