正常人外周血嗜酸性粒细胞的分离与培养方法的改进*
作者：赖克方 郭晓明 王长征 郭先健 钱桂生
单位：赖克方 郭晓明 王长征 郭先健 钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所) 重庆，400037
关键词：嗜酸性粒细胞；分离；培养；细胞因子
Isolation and culture of eosinophilic granulocytes from peripheral blood with an improved methodIsolation and culture of eosinophilic granulocytes from peripheral blood with an improved method
提 要 目的：探讨外周血嗜酸性粒细胞(Eos)纯化、分离与培养的方法。方法：采用Percoll密度梯度(1.082～1.100)分离外周血Eos，离心前细胞悬液预先与fMLP 37°C孵育10 min。纯化的Eos分别在加入或不加入细胞因子(IL-3、IL-5和GM-CSF)的条件下培养，观察细胞活力的变化。结果：传统Percoll密度梯度分离Eos的纯度和回收率分别为(15.8±5.3)%和(64.3±6.4)%。预先用fMLP孵育Eos使分离Eos纯度(96.5±1.8%)显著增高(P<0.01)，回收率(68.4±7.1)%无明显变化(P>0.05)。Eos体外培养存活2～3 d，加入细胞因子可使Eos存活时间延长6 d以上。结论：fMLP可有效增加Percoll密度梯度分离Eos的纯度。分离的Eos可用于体外培养。
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中图法分类号 Q813.1+1 文献标识码：B
嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)是支气管哮喘和过敏性疾病的关键效应细胞。分离培养Eos是研究上述疾病发病机制的重要手段。采用Percoll密度梯度离心是分离Eos的常用方法。由于Eos与中性粒细胞密度部分重叠，传统方法分离Eos的纯度和回收率均不理想。本文采用一种改进的方法分离外周血Eos，获得高纯度和回收率的Eos，国内尚未见报道，现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料
Percoll分离液(Pharmacia)，人重组(rh)IL-3、IL-5、GM-CSF由美国Genetics Institute(GI) MegO′Donell教授惠赠，PRMI1640(Gibcol公司)，淋巴细胞分离液(上海生化)，fMLP(Sigma)，氯化铵溶液(155 mmol/L NH4Cl，10 mmol/L KHCO3,0.1 mmol/L EDTA)。CO2恒温培养箱(TC1815型，Sandon)。
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1.2 血液来源
分离Eos的外周静脉血来源于19例健康献血者，其中男12例，女7例，平均年龄(29.8±5)岁，无哮喘等过敏性疾病病史。白细胞分类Eos占2%～5%。
1.3 Eos分离方法
枸缘酸钠(130 mmol/L,pH 7.4)抗凝，5% FCS/Hank's平衡盐液稀释，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上面(比重1.077)，室温离心1000×g20 min。离心后去掉上层单核细胞，取下层粒细胞和红细胞，加入5倍体积的氯化铵溶液冰浴15 min，400×g7 min 。沉淀细胞用Hank's液漂洗1～2次，悬浮于2 ml 5%小牛血清/Hanks液中30 min，37°C。将10 mmol/L fMLP与细胞悬浮孵育10 min，37°C。将1 ml细胞悬浮液缓慢加于不同Percoll梯度分离液上面，Percoll密度梯度由2层组成，上层Percoll(3 ml)比重分别为1.078、1.082或1.086(g/ml)，下层(1 ml)比重为1.100(g/ml),1 000×g 15 min。收集界面细胞，PBS漂洗，取少许悬液用于细胞总计数、分类计数和活力测定(台盼蓝拒染法)。分类计数采用HE染色，Eos所占百分比即为分离Eos的纯度。为计算Eos的回收率，分别收集和计数梯度顶部细胞、界面细胞和底部细胞沉淀所含的Eos数量，Eos回收率(%)等于界面Eos的数量除以整个梯度收集的Eos总量的百分比。不用fMLP孵育细胞悬液作为对照。
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1.4 培养方法
新鲜纯化的Eos悬浮于10% FCS/RPMI1640培养基，置于96孔平底培养板，每孔细胞数2.0×105，总体积200 μl。5%CO2，37°C条件下培养。分别加入不同浓度的细胞因子IL-5、IL-3、GM-CSF(10 U/ml)，以不加入细胞因子作为对照，动态观察Eos活力的变化。Eos活力检测方法采用台盼蓝拒染法， 计算存活细胞或死亡细胞百分率。
1.5 统计与分析
各组结果以
±s表示，采用非配对资料t检验，P<0.05为相差显著。
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2 结果
2.1 分离Eos的纯度和回收率
单纯Percoll密度梯度(1.082～1.100)分离所得Eos的纯度仅为(15.8±5.3)%，回收率为(64.3±6.4)%。在fMLP预孵育的前提下，采用不同Percoll密度梯度分离Eos，结果如表1所示，综合考虑纯度和回收率2个因素，Percoll密度梯度为1.082～1.100 g/ml时分离效果最好。先用fMLP孵育Eos时，Percoll密度梯度(1.082～1.100)分离Eos的纯度达到(96.5±1.8)%，显著高于单纯Percoll密度梯度分离法(P<0.01)。两者回收率类似(P>0.05)。
表1 不同Percoll密度梯度分离嗜酸性粒细胞结果的比较(n=6)
Percoll密度梯度(g/ml)
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1.078～1.100
1.082～1.100
1.086～1.100
纯度(%)
90.3±2.6
96.5±1.8
97.2±1.5
回收率(%)
84.9±5.7
68.4±7.1
41.2±5.3
2.2 IL-3/IL-5/GM-CSF对Eos存活的作用
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在缺乏细胞因子的条件下，体外培养的Eos活力迅速降低，至第3天已接近100%死亡。加入细胞因子IL-3、IL-5或GM-CSF(10 U/ml)与Eos共同培养时，可显著抑制Eos活力的下降，培养至第10天仍有相当部份Eos存活，其中IL-5可使50%的Eos存活10 d以上，结果见表2。
表2 IL-3、IL-5、GM-CSF对嗜酸性粒细胞存活率的影响(%，n=6)
1 d
2 d
3 d
4 d
6 d
10 d
对照组
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80±8
23±11
6±4
0
——
——
IL-3
87±6
83±7
65±14
48±9
32±6
0
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IL-5
92±3
86±5
73±9
65±13
61±12
50±11
GM-CSF
91±5
91±5
90±11
61±9
47±8
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31±4
3 讨论
Eos体外培养对研究Eos的功能及其在哮喘发病中的作用，药物对Eos的作用机制均有重要作用。Eos系终末分化细胞，体外培养的前提是获得足够数量和纯度的Eos。正常情况下，外周血Eos所占的比例很低，即使是支气管哮喘患者，外周血Eos增高者亦不多见[1]。Eos在所有白细胞中密度最大，分离Eos常用的方法是采用Percoll密度梯度离心法，Percoll由聚烯丙酮包被的胶样硅粒组成，具有低渗性和低粘性的特点，从而容易获得等渗密度梯度，对所分离的细胞功能活性没有影响。Percoll密度梯度为1.086～1.100时，分离获得的Eos纯度可达86%以上，但回收率仅为38%～56%，显然相当部分密度低于1.086的Eos被丢失[2]。将上层Percoll密度调至1.086以下，虽可增高Eos的回收率，但Eos的纯度也将明显降低，这是由于部分Eos与中性粒细胞密度重叠所致。fMLP是一种趋化肽，研究发现低浓度的fMLP具有激活中性粒细胞，同时降低中性粒细胞密度的作用，而对Eos功能没有影响[3，4]。本研究利用这一特性，将待分离的粒细胞悬液预先与fMLP孵育，从而降低中性粒细胞密度，拉开中性粒细胞与Eos之间的距离。结果表明fMLP显著增加了Eos分离的纯度。采用比重为1.082～1.100的Percoll密度梯度可使分离的Eos纯度达到96%以上，同时使大部分Eos得以回收。
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为证实fMLP是否影响Eos的存活活性，本研究对fMLP分离的Eos进行了体外培养和活力观察。体外培养Eos存活时间，细胞因子对Eos存活的作用，均与文献[5]报道一致，表明fMLP对Eos的存活功能没有影响，通过fMLP分离的Eos完全能用于体外培养观察研究。
由于普通Percoll密度梯度分离Eos回收率低，为获得足够数量的Eos，既往研究多选用Eos明显增高的外周血，来自疾病状态下的Eos必然影响实验结果的准确性。免疫磁珠法虽可有效分离正常人外周血的Eos，但此法价格昂贵[6]。本研究采用fMLP法能够分离Eos仅占2%的正常人外周血，纯度与回收率接近于免疫磁珠法，20 ml以上的血液即可进行分离，经济实用，为开展Eos的研究提供了有力的条件。
*国家自然科学基金资助项目，No.39670337
作者简介：赖克方，男，35岁，主治医师，博士，现在广州呼吸疾病研究所 广州，510120
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参考文献
1 Krogel C, Warner J R, Virchow Jr J C, et al. Pulmonary immune cells in health and disease: The eosinophil leukocyte (Part Ⅰ). Eur Respir J,1994,7(1):519
2 Garnter I. Separation of human eosinophils in density gradients of polyvinylyrrolidone-caated silica gel (Percoll). Immunology,1980,40(1):133
3 Laviolette M, Bosse M, Lavigne S, et al. Comparison of two modified techniques for purifying blood eosinophils. J Immunol Methods,1993,165(2):253
, 百拇医药
4 Blom M,Tool A T J,Mul F P J,et al. Eosinophils isolated with two different methods show different claracteristics of activation. J Immunol Methods,1995,178(2):183
5 Sedgwick J B, Quan S F, Calhoun W J, et al. Effect of interleukin-5 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor on in vitro eosinophil function: Comparison with airway eosinophils. J Allergy Clin Immunol,1995,96(2):375
6 Hansel T T, Vries J M D, Iff T, et al. An improved immunomagnetic procedure for the isolation of highly purified human blood eosinophils. J Immunol Methods,1991,145(1):105
(收稿：1999-03-29；修回：1999-07-22), 百拇医药
单位：赖克方 郭晓明 王长征 郭先健 钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所) 重庆，400037
关键词：嗜酸性粒细胞；分离；培养；细胞因子
Isolation and culture of eosinophilic granulocytes from peripheral blood with an improved methodIsolation and culture of eosinophilic granulocytes from peripheral blood with an improved method
提 要 目的：探讨外周血嗜酸性粒细胞(Eos)纯化、分离与培养的方法。方法：采用Percoll密度梯度(1.082～1.100)分离外周血Eos，离心前细胞悬液预先与fMLP 37°C孵育10 min。纯化的Eos分别在加入或不加入细胞因子(IL-3、IL-5和GM-CSF)的条件下培养，观察细胞活力的变化。结果：传统Percoll密度梯度分离Eos的纯度和回收率分别为(15.8±5.3)%和(64.3±6.4)%。预先用fMLP孵育Eos使分离Eos纯度(96.5±1.8%)显著增高(P<0.01)，回收率(68.4±7.1)%无明显变化(P>0.05)。Eos体外培养存活2～3 d，加入细胞因子可使Eos存活时间延长6 d以上。结论：fMLP可有效增加Percoll密度梯度分离Eos的纯度。分离的Eos可用于体外培养。
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中图法分类号 Q813.1+1 文献标识码：B
嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)是支气管哮喘和过敏性疾病的关键效应细胞。分离培养Eos是研究上述疾病发病机制的重要手段。采用Percoll密度梯度离心是分离Eos的常用方法。由于Eos与中性粒细胞密度部分重叠，传统方法分离Eos的纯度和回收率均不理想。本文采用一种改进的方法分离外周血Eos，获得高纯度和回收率的Eos，国内尚未见报道，现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料
Percoll分离液(Pharmacia)，人重组(rh)IL-3、IL-5、GM-CSF由美国Genetics Institute(GI) MegO′Donell教授惠赠，PRMI1640(Gibcol公司)，淋巴细胞分离液(上海生化)，fMLP(Sigma)，氯化铵溶液(155 mmol/L NH4Cl，10 mmol/L KHCO3,0.1 mmol/L EDTA)。CO2恒温培养箱(TC1815型，Sandon)。
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1.2 血液来源
分离Eos的外周静脉血来源于19例健康献血者，其中男12例，女7例，平均年龄(29.8±5)岁，无哮喘等过敏性疾病病史。白细胞分类Eos占2%～5%。
1.3 Eos分离方法
枸缘酸钠(130 mmol/L,pH 7.4)抗凝，5% FCS/Hank's平衡盐液稀释，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液上面(比重1.077)，室温离心1000×g20 min。离心后去掉上层单核细胞，取下层粒细胞和红细胞，加入5倍体积的氯化铵溶液冰浴15 min，400×g7 min 。沉淀细胞用Hank's液漂洗1～2次，悬浮于2 ml 5%小牛血清/Hanks液中30 min，37°C。将10 mmol/L fMLP与细胞悬浮孵育10 min，37°C。将1 ml细胞悬浮液缓慢加于不同Percoll梯度分离液上面，Percoll密度梯度由2层组成，上层Percoll(3 ml)比重分别为1.078、1.082或1.086(g/ml)，下层(1 ml)比重为1.100(g/ml),1 000×g 15 min。收集界面细胞，PBS漂洗，取少许悬液用于细胞总计数、分类计数和活力测定(台盼蓝拒染法)。分类计数采用HE染色，Eos所占百分比即为分离Eos的纯度。为计算Eos的回收率，分别收集和计数梯度顶部细胞、界面细胞和底部细胞沉淀所含的Eos数量，Eos回收率(%)等于界面Eos的数量除以整个梯度收集的Eos总量的百分比。不用fMLP孵育细胞悬液作为对照。
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1.4 培养方法
新鲜纯化的Eos悬浮于10% FCS/RPMI1640培养基，置于96孔平底培养板，每孔细胞数2.0×105，总体积200 μl。5%CO2，37°C条件下培养。分别加入不同浓度的细胞因子IL-5、IL-3、GM-CSF(10 U/ml)，以不加入细胞因子作为对照，动态观察Eos活力的变化。Eos活力检测方法采用台盼蓝拒染法， 计算存活细胞或死亡细胞百分率。
1.5 统计与分析
各组结果以
±s表示，采用非配对资料t检验，P<0.05为相差显著。, 百拇医药
2 结果
2.1 分离Eos的纯度和回收率
单纯Percoll密度梯度(1.082～1.100)分离所得Eos的纯度仅为(15.8±5.3)%，回收率为(64.3±6.4)%。在fMLP预孵育的前提下，采用不同Percoll密度梯度分离Eos，结果如表1所示，综合考虑纯度和回收率2个因素，Percoll密度梯度为1.082～1.100 g/ml时分离效果最好。先用fMLP孵育Eos时，Percoll密度梯度(1.082～1.100)分离Eos的纯度达到(96.5±1.8)%，显著高于单纯Percoll密度梯度分离法(P<0.01)。两者回收率类似(P>0.05)。
表1 不同Percoll密度梯度分离嗜酸性粒细胞结果的比较(n=6)
Percoll密度梯度(g/ml)
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1.078～1.100
1.082～1.100
1.086～1.100
纯度(%)
90.3±2.6
96.5±1.8
97.2±1.5
回收率(%)
84.9±5.7
68.4±7.1
41.2±5.3
2.2 IL-3/IL-5/GM-CSF对Eos存活的作用
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在缺乏细胞因子的条件下，体外培养的Eos活力迅速降低，至第3天已接近100%死亡。加入细胞因子IL-3、IL-5或GM-CSF(10 U/ml)与Eos共同培养时，可显著抑制Eos活力的下降，培养至第10天仍有相当部份Eos存活，其中IL-5可使50%的Eos存活10 d以上，结果见表2。
表2 IL-3、IL-5、GM-CSF对嗜酸性粒细胞存活率的影响(%，n=6)
1 d
2 d
3 d
4 d
6 d
10 d
对照组
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80±8
23±11
6±4
0
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IL-3
87±6
83±7
65±14
48±9
32±6
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IL-5
92±3
86±5
73±9
65±13
61±12
50±11
GM-CSF
91±5
91±5
90±11
61±9
47±8
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31±4
3 讨论
Eos体外培养对研究Eos的功能及其在哮喘发病中的作用，药物对Eos的作用机制均有重要作用。Eos系终末分化细胞，体外培养的前提是获得足够数量和纯度的Eos。正常情况下，外周血Eos所占的比例很低，即使是支气管哮喘患者，外周血Eos增高者亦不多见[1]。Eos在所有白细胞中密度最大，分离Eos常用的方法是采用Percoll密度梯度离心法，Percoll由聚烯丙酮包被的胶样硅粒组成，具有低渗性和低粘性的特点，从而容易获得等渗密度梯度，对所分离的细胞功能活性没有影响。Percoll密度梯度为1.086～1.100时，分离获得的Eos纯度可达86%以上，但回收率仅为38%～56%，显然相当部分密度低于1.086的Eos被丢失[2]。将上层Percoll密度调至1.086以下，虽可增高Eos的回收率，但Eos的纯度也将明显降低，这是由于部分Eos与中性粒细胞密度重叠所致。fMLP是一种趋化肽，研究发现低浓度的fMLP具有激活中性粒细胞，同时降低中性粒细胞密度的作用，而对Eos功能没有影响[3，4]。本研究利用这一特性，将待分离的粒细胞悬液预先与fMLP孵育，从而降低中性粒细胞密度，拉开中性粒细胞与Eos之间的距离。结果表明fMLP显著增加了Eos分离的纯度。采用比重为1.082～1.100的Percoll密度梯度可使分离的Eos纯度达到96%以上，同时使大部分Eos得以回收。
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为证实fMLP是否影响Eos的存活活性，本研究对fMLP分离的Eos进行了体外培养和活力观察。体外培养Eos存活时间，细胞因子对Eos存活的作用，均与文献[5]报道一致，表明fMLP对Eos的存活功能没有影响，通过fMLP分离的Eos完全能用于体外培养观察研究。
由于普通Percoll密度梯度分离Eos回收率低，为获得足够数量的Eos，既往研究多选用Eos明显增高的外周血，来自疾病状态下的Eos必然影响实验结果的准确性。免疫磁珠法虽可有效分离正常人外周血的Eos，但此法价格昂贵[6]。本研究采用fMLP法能够分离Eos仅占2%的正常人外周血，纯度与回收率接近于免疫磁珠法，20 ml以上的血液即可进行分离，经济实用，为开展Eos的研究提供了有力的条件。
*国家自然科学基金资助项目，No.39670337
作者简介：赖克方，男，35岁，主治医师，博士，现在广州呼吸疾病研究所 广州，510120
, http://www.100md.com
参考文献
1 Krogel C, Warner J R, Virchow Jr J C, et al. Pulmonary immune cells in health and disease: The eosinophil leukocyte (Part Ⅰ). Eur Respir J,1994,7(1):519
2 Garnter I. Separation of human eosinophils in density gradients of polyvinylyrrolidone-caated silica gel (Percoll). Immunology,1980,40(1):133
3 Laviolette M, Bosse M, Lavigne S, et al. Comparison of two modified techniques for purifying blood eosinophils. J Immunol Methods,1993,165(2):253
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4 Blom M,Tool A T J,Mul F P J,et al. Eosinophils isolated with two different methods show different claracteristics of activation. J Immunol Methods,1995,178(2):183
5 Sedgwick J B, Quan S F, Calhoun W J, et al. Effect of interleukin-5 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor on in vitro eosinophil function: Comparison with airway eosinophils. J Allergy Clin Immunol,1995,96(2):375
6 Hansel T T, Vries J M D, Iff T, et al. An improved immunomagnetic procedure for the isolation of highly purified human blood eosinophils. J Immunol Methods,1991,145(1):105
(收稿：1999-03-29；修回：1999-07-22), 百拇医药