溃疡性结肠炎患者淋巴细胞凋亡调控蛋白的表达
作者：江学良 权启镇 孙自勤 王要军 齐风 王东 张修礼
单位：济南军区总医院消化科 山东省济南市 250031
关键词：结肠炎，溃疡性；淋巴细胞；基因表达调控
世界华人消化杂志991029 中国图书馆分类号 R?574.62
Subject headings colitis, ulcerative; lymphocyte; gene expression regulation
溃疡性结肠炎(UC)的病因和发病机制尚未完全阐明，已知免疫功能紊乱在UC发病机制中有重要作用[1-3]，但对发生免疫功能紊乱的基因调控机制以及皮质激素对参与UC免疫调控基因表达的影响还不了解，由于淋巴细胞凋亡发生异常是导致免疫紊乱和一些疾病发生的重要原因[4-7]，为此，我们应用免疫荧光标记和流式细胞技术动态分析了调控淋巴细胞凋亡的3个关键性蛋白CD95(Apo-1/?Fas)，Apo-2.7，Bcl-2在UC患者外周血淋巴细胞(PBLC)中的表达如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 UC患者34例，男14例，女20例，平均年龄31.4岁，均符合1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制订的溃疡性结肠炎诊断标准. 其中活动期24例，缓解期10例. 20例中重度活动期UC患者应用皮质激素治疗1?mo后16例好转，4例无效或恶化. 正常人对照组20例，男8例，女12例，平均年龄30.6岁，均为健康查体者.
1.2 方法 ①试剂来源：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Apo-1, Bcl-2 mAb(Apo-1-FITC，Bcl-2-FITC)及藻红蛋白(PE)标记的Apo-2.7mAb(Apo-2.7-PE)均由法国国际免疫公司生产，淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产. ②样品处理：晨取肘静脉血2?mL，20?g/?L EDTA抗凝(抗凝剂∶血=1∶9)，悬浮于淋巴细胞分离液上，1500?r/?min离心15min，提取其中的淋巴细胞，加PBS 2?mL漂洗，同速离心弃上清，备用. ③免疫反应：反应前调整细胞数至109/?mL，分取100?μL放入3支试管及3支对照管内，试管内分别加20?μL Apo-1-FITC, Bcl-2-FITC, Apo-2.7-PE. 对照管分别加20?μL IgG-FITC，20?μL IgG-FITC和IgG-PE，室温避光反应30min，上机. ④流式细胞仪检测：流式细胞仪为FACScan型，美国Becton Dickinson生产. 上机前先以标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内，上机后收集10?000个细胞，荧光强度以对数放大，测定光散射数据，结果采用Macintosh 650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析.
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统计学处理 采用两样本均数的t检验.
2 结果
表1显示，UC患者PBLC凋亡较正常人减少(P<0.05)，凋亡抑制基因Bcl-2表达显著增加(P<0.01)，上述变化尤以活动期更为明显(P<0.05或P<0.01)，而凋亡诱导基因Apo-1变化不显著(P>0.05). 应用皮质激素治疗后好转组PBLC凋亡明显增加，Bcl-2表达下调，Apo-1表达上调(P<0.01)，而治疗无效组PBLC凋亡无显著变化，Bcl-2和Apo-1表达也无显著变化(P>0.01)相关分析表明Bcl-2与Apo-2.7呈负相关(r=0.572，P<0.05).
表1 UC患者Apo-1, Apo-2.7，Bcl-2在PBLC上的表达水平
(
±s，%) 组别
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n
Apo-1
Apo-2.7
Bcl-2
正常人
20
0.5±0.2
2.4±0.8
2.9±0.6
UC患者
34
0.8±0.5
1.2±0.5a
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16.8±9.2b
缓解期
10
0.6±0.3
1.6±0.6
8.7±3.4
活动期
24
1.1±0.5
0.8±0.4c
22.4±10.1d
激素治疗好转组
, 百拇医药
16
4.9±2.1f
7.8±4.9f
10.2±6.7f
激素治疗无效组
4
1.3±0.5
1.1±0.4
24.3±6.2
aP<0.05，bP<0.01 vs正常人；cP<0.05，dP<0.01 vs 缓解期；fP<0.01 vs无效组.
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3 讨论
Apo-2.7是线粒体膜蛋白，淋巴细胞表达此蛋白可作为细胞凋亡的早期，特异的标记，应用流式细胞仪检测此蛋白可定量反映淋巴细胞凋亡率[8]. 正常人外周血淋巴细胞有低水平Apo-2.7表达，表明部分淋巴细胞在机体的总调控下发生细胞凋亡，以去除衰老、异常细胞及控制细胞数量和体积，维持免疫系统的平衡. UC患者Apo-2.7表达减少，使部分活化的自身反应性淋巴细胞无法通过主动凋亡清除而异常增生，造成炎症反应过强，发生自身免疫，产生结肠粘膜的炎症、溃疡. 应用皮质激素治疗后好转的患者Apo-2.7表达增多，表明皮质激素可诱导活化的自身反应性淋巴细胞发生凋亡，从而抑制自身免疫反应，控制炎症. 而皮质激素治疗无效的患者Apo-2.7表达无明显变化，提示这部分患者活化的自身反应性淋巴细胞对皮质激素诱导的细胞凋亡不敏感或存在反应缺陷，能否称之为激素抵抗型UC患者尚待进一步研究.
Bcl-2基因是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂(18q21.3)[9]，近年发现，Bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因，有人又称之为自身免疫基因[10]. 在本研究中，正常人外周血淋巴细胞有低水平的Bcl-2蛋白表达以维持其存活，UC患者Bcl-2表达明显增多，且与疾病活动性有关，活动期较非活动期升高更为明显，相关分析表明Bcl-2和Apo-2.7表达呈负相关，提示Bcl-2表达增加可抑制活化的自身反应性淋巴细胞凋亡，产生自身免疫反应，加重炎症程度. 应用皮质激素治疗后好转的UC患者Bcl-2表达下调，表明皮质激素可通过抑制Bcl-2表达诱导活化的自身免疫反应性淋巴细胞凋亡，减轻炎症反应.
, http://www.100md.com
Apo-1又称Fas，现命名为CD95分子，属TNFR和神经生长因子受体家族的成员之一，它是由Fas基因编码的具有诱导细胞凋亡能力的细胞表面Ⅰ型膜蛋白[11，12]. 正常人外周血淋巴细胞有一定水平的Apo-1表达对维护免疫系统平衡具有重要作用. UC患者Apo-1表达较正常人有增高趋势，但差异无显著性，表明UC患者凋亡调控紊乱与Apo-1相关性不大，但应用皮质激素治疗后，Apo-1表达明显增加，表明皮质激素可促进淋巴细胞表达Apo-1上调，诱导细胞凋亡，抑制炎症反应.
通讯作者：江学良
参考文献
1 江学良，权启镇，孙自勤，王要军，齐风. 溃疡性结肠炎患者粘附分子表达的变化. 华人消化杂志，1998；6：54-55
2 江学良，权启镇，刘同亭，王要军，孙自勤，任洪波，张维莉，张力. 溃疡性结肠炎患者血小板活化的检测. 新消化病学杂志，1997；5：736
, 百拇医药
3 江学良，权启镇，孙自勤，王要军，齐风. 糖皮质激素对重症溃疡性结肠炎患者粘附分子表达的影响. 中国危重病急救医学，1998；10：366-369
4 Kraus MD， Shahsafaei A, Antin J, Odze RD. Relationship of Bcl-2 expression with apoptosis and proliferation in colonic graft versus host disease. Hum Pathol, 1998;29:869-875
5 Ueyama H, Kiyohara T, Sawada N, Isozaki K, Kitamuar S, Miyagawa J. High Fas ligand expression on lympocytes in lessions of ulcerative colitis. Gut, 1998;43:48-55
, 百拇医药
6 Sakai T, Kimura Y, Ohara KI, Kusugami K, Lynch DH, Yoshikai Y. Fas-mediated cytotoxity by intestinal intraepithelial lymphocyte during acute graft-versus-host desease in mice. Gastroenterology, 1997;113:167-174
7 Strater J, Wellish I, Riedl S, Walczak H, Koretz K, Tandara A, Krammer PH, Moller P. CD95(Apo-1/?Fas) mediated apoptosis in colon epithelial cell: a possible role in ulcerative colitis. Gastroenterology, 1997;113:160-167
, 百拇医药
8 Zhang C, Ao Z, Seth A, Sxhlossman SF. A mitochondrial memrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells. J Immunol, 1996;in press
9 Tsujimoto T, Finger LR, Yunis J. Cloning the chromosome break-point of neoplstic B cells with the t(14;18)chromosome thanslocation. Science, 1984;226:1097-1099
10 Talal N. Clncludin remarks: autogenes and oncogenes. Clin Immunol Imuunopathol, 1994;72:208-209
11 Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995;267:1449-1456
12 Smith CA, Farrah T, Goodwin RG. The TNF receptor superfamily of cellular and viral protein: activation and death. Cell, 1994;76:959-966
收稿日期 1999-04-28 修回日期 1999-07-03, http://www.100md.com
单位：济南军区总医院消化科 山东省济南市 250031
关键词：结肠炎，溃疡性；淋巴细胞；基因表达调控
世界华人消化杂志991029 中国图书馆分类号 R?574.62
Subject headings colitis, ulcerative; lymphocyte; gene expression regulation
溃疡性结肠炎(UC)的病因和发病机制尚未完全阐明，已知免疫功能紊乱在UC发病机制中有重要作用[1-3]，但对发生免疫功能紊乱的基因调控机制以及皮质激素对参与UC免疫调控基因表达的影响还不了解，由于淋巴细胞凋亡发生异常是导致免疫紊乱和一些疾病发生的重要原因[4-7]，为此，我们应用免疫荧光标记和流式细胞技术动态分析了调控淋巴细胞凋亡的3个关键性蛋白CD95(Apo-1/?Fas)，Apo-2.7，Bcl-2在UC患者外周血淋巴细胞(PBLC)中的表达如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 UC患者34例，男14例，女20例，平均年龄31.4岁，均符合1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制订的溃疡性结肠炎诊断标准. 其中活动期24例，缓解期10例. 20例中重度活动期UC患者应用皮质激素治疗1?mo后16例好转，4例无效或恶化. 正常人对照组20例，男8例，女12例，平均年龄30.6岁，均为健康查体者.
1.2 方法 ①试剂来源：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Apo-1, Bcl-2 mAb(Apo-1-FITC，Bcl-2-FITC)及藻红蛋白(PE)标记的Apo-2.7mAb(Apo-2.7-PE)均由法国国际免疫公司生产，淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产. ②样品处理：晨取肘静脉血2?mL，20?g/?L EDTA抗凝(抗凝剂∶血=1∶9)，悬浮于淋巴细胞分离液上，1500?r/?min离心15min，提取其中的淋巴细胞，加PBS 2?mL漂洗，同速离心弃上清，备用. ③免疫反应：反应前调整细胞数至109/?mL，分取100?μL放入3支试管及3支对照管内，试管内分别加20?μL Apo-1-FITC, Bcl-2-FITC, Apo-2.7-PE. 对照管分别加20?μL IgG-FITC，20?μL IgG-FITC和IgG-PE，室温避光反应30min，上机. ④流式细胞仪检测：流式细胞仪为FACScan型，美国Becton Dickinson生产. 上机前先以标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内，上机后收集10?000个细胞，荧光强度以对数放大，测定光散射数据，结果采用Macintosh 650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析.
, http://www.100md.com
统计学处理 采用两样本均数的t检验.
2 结果
表1显示，UC患者PBLC凋亡较正常人减少(P<0.05)，凋亡抑制基因Bcl-2表达显著增加(P<0.01)，上述变化尤以活动期更为明显(P<0.05或P<0.01)，而凋亡诱导基因Apo-1变化不显著(P>0.05). 应用皮质激素治疗后好转组PBLC凋亡明显增加，Bcl-2表达下调，Apo-1表达上调(P<0.01)，而治疗无效组PBLC凋亡无显著变化，Bcl-2和Apo-1表达也无显著变化(P>0.01)相关分析表明Bcl-2与Apo-2.7呈负相关(r=0.572，P<0.05).
表1 UC患者Apo-1, Apo-2.7，Bcl-2在PBLC上的表达水平
(
±s，%) 组别, http://www.100md.com
n
Apo-1
Apo-2.7
Bcl-2
正常人
20
0.5±0.2
2.4±0.8
2.9±0.6
UC患者
34
0.8±0.5
1.2±0.5a
, http://www.100md.com
16.8±9.2b
缓解期
10
0.6±0.3
1.6±0.6
8.7±3.4
活动期
24
1.1±0.5
0.8±0.4c
22.4±10.1d
激素治疗好转组
, 百拇医药
16
4.9±2.1f
7.8±4.9f
10.2±6.7f
激素治疗无效组
4
1.3±0.5
1.1±0.4
24.3±6.2
aP<0.05，bP<0.01 vs正常人；cP<0.05，dP<0.01 vs 缓解期；fP<0.01 vs无效组.
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3 讨论
Apo-2.7是线粒体膜蛋白，淋巴细胞表达此蛋白可作为细胞凋亡的早期，特异的标记，应用流式细胞仪检测此蛋白可定量反映淋巴细胞凋亡率[8]. 正常人外周血淋巴细胞有低水平Apo-2.7表达，表明部分淋巴细胞在机体的总调控下发生细胞凋亡，以去除衰老、异常细胞及控制细胞数量和体积，维持免疫系统的平衡. UC患者Apo-2.7表达减少，使部分活化的自身反应性淋巴细胞无法通过主动凋亡清除而异常增生，造成炎症反应过强，发生自身免疫，产生结肠粘膜的炎症、溃疡. 应用皮质激素治疗后好转的患者Apo-2.7表达增多，表明皮质激素可诱导活化的自身反应性淋巴细胞发生凋亡，从而抑制自身免疫反应，控制炎症. 而皮质激素治疗无效的患者Apo-2.7表达无明显变化，提示这部分患者活化的自身反应性淋巴细胞对皮质激素诱导的细胞凋亡不敏感或存在反应缺陷，能否称之为激素抵抗型UC患者尚待进一步研究.
Bcl-2基因是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂(18q21.3)[9]，近年发现，Bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因，有人又称之为自身免疫基因[10]. 在本研究中，正常人外周血淋巴细胞有低水平的Bcl-2蛋白表达以维持其存活，UC患者Bcl-2表达明显增多，且与疾病活动性有关，活动期较非活动期升高更为明显，相关分析表明Bcl-2和Apo-2.7表达呈负相关，提示Bcl-2表达增加可抑制活化的自身反应性淋巴细胞凋亡，产生自身免疫反应，加重炎症程度. 应用皮质激素治疗后好转的UC患者Bcl-2表达下调，表明皮质激素可通过抑制Bcl-2表达诱导活化的自身免疫反应性淋巴细胞凋亡，减轻炎症反应.
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Apo-1又称Fas，现命名为CD95分子，属TNFR和神经生长因子受体家族的成员之一，它是由Fas基因编码的具有诱导细胞凋亡能力的细胞表面Ⅰ型膜蛋白[11，12]. 正常人外周血淋巴细胞有一定水平的Apo-1表达对维护免疫系统平衡具有重要作用. UC患者Apo-1表达较正常人有增高趋势，但差异无显著性，表明UC患者凋亡调控紊乱与Apo-1相关性不大，但应用皮质激素治疗后，Apo-1表达明显增加，表明皮质激素可促进淋巴细胞表达Apo-1上调，诱导细胞凋亡，抑制炎症反应.
通讯作者：江学良
参考文献
1 江学良，权启镇，孙自勤，王要军，齐风. 溃疡性结肠炎患者粘附分子表达的变化. 华人消化杂志，1998；6：54-55
2 江学良，权启镇，刘同亭，王要军，孙自勤，任洪波，张维莉，张力. 溃疡性结肠炎患者血小板活化的检测. 新消化病学杂志，1997；5：736
, 百拇医药
3 江学良，权启镇，孙自勤，王要军，齐风. 糖皮质激素对重症溃疡性结肠炎患者粘附分子表达的影响. 中国危重病急救医学，1998；10：366-369
4 Kraus MD， Shahsafaei A, Antin J, Odze RD. Relationship of Bcl-2 expression with apoptosis and proliferation in colonic graft versus host disease. Hum Pathol, 1998;29:869-875
5 Ueyama H, Kiyohara T, Sawada N, Isozaki K, Kitamuar S, Miyagawa J. High Fas ligand expression on lympocytes in lessions of ulcerative colitis. Gut, 1998;43:48-55
, 百拇医药
6 Sakai T, Kimura Y, Ohara KI, Kusugami K, Lynch DH, Yoshikai Y. Fas-mediated cytotoxity by intestinal intraepithelial lymphocyte during acute graft-versus-host desease in mice. Gastroenterology, 1997;113:167-174
7 Strater J, Wellish I, Riedl S, Walczak H, Koretz K, Tandara A, Krammer PH, Moller P. CD95(Apo-1/?Fas) mediated apoptosis in colon epithelial cell: a possible role in ulcerative colitis. Gastroenterology, 1997;113:160-167
, 百拇医药
8 Zhang C, Ao Z, Seth A, Sxhlossman SF. A mitochondrial memrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells. J Immunol, 1996;in press
9 Tsujimoto T, Finger LR, Yunis J. Cloning the chromosome break-point of neoplstic B cells with the t(14;18)chromosome thanslocation. Science, 1984;226:1097-1099
10 Talal N. Clncludin remarks: autogenes and oncogenes. Clin Immunol Imuunopathol, 1994;72:208-209
11 Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995;267:1449-1456
12 Smith CA, Farrah T, Goodwin RG. The TNF receptor superfamily of cellular and viral protein: activation and death. Cell, 1994;76:959-966
收稿日期 1999-04-28 修回日期 1999-07-03, http://www.100md.com