GCDC诱发体外培养大鼠肝细胞凋亡的实验研究
作者：王剑明 邹声泉
单位：同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
关键词：甘氨鹅脱氧胆酸钠；肝细胞；细胞凋亡
中国图书馆分类号 R575中国图书馆分类号 R575
Subject headings glycochenideoxcholate; hepatocytes; apoptosis
在阻塞性黄疸中因胆汁瘀积引起胆盐的升高，进而导致肝损害，但其损害机制尚未阐明. 阻塞性黄疸(阻黄)时胆盐对肝细胞凋亡的影响知之甚少. 我们用DNA含量流式细胞术(FCM)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)研究不同浓度的甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)对体外培养大鼠肝细胞凋亡状态的影响，以探讨阻黄肝损害的病理机制.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ①肝细胞的分离与培养：采用胶原酶原位肝灌注法. 健康♂Wistar大鼠，氯胺酮0.2mg/kg ip，麻醉后固定体位，消毒皮肤后进腹，显露游离门静脉后距肝门2cm处插入18号导管，用D-Hanks液(含0.1g/L EDTA，pH 7.4，37℃)以25mL/min灌入，然后于肝下后腔静脉插入16号导管放出积血积液；门静脉改用0.5g/L IV型胶原酶及0.1g/L DNase I Hanks液持续灌注5min，取下肝脏，置入含4℃ Hanks液的平皿中，剪去肝被膜，加2.5g/L胰蛋白酶继续消化20min，Hanks液终止，100目尼龙网过滤，加RPMI1640 50mL，制成混合肝细胞悬液，置入37℃恒温水浴中孵化10min，过滤，离心，去上清，4℃ hanks液重悬. 用40g/L盼蓝染色判断肝细胞活率，用细胞计数板记数细胞浓度. 细胞培养于合成培养基(含RPMI1640 80mL，新生小牛血清20mL、青霉素100kU/L，链霉素100g/L，胰岛素0.1kU/L，以及hepes 15mmol) 培养条件37℃，50mL/L CO2. ②主要试剂：IV型胶原酶、DNaseⅠ、胰蛋白酶、甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)、碘化丙锭(PI)染色剂为Sigma公司产品；细胞凋亡原位检测试剂盒(TUNEL)为德国宝灵曼公司提供.
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1.2 方法 ①GCDC致肝细胞凋亡的实验：将肝细胞按1×108/L分种于内含小飞片的24孔培养板中，培养36h，用培养液洗涤一次，换新鲜培养液，分别加入终浓度为25，50，100，150，200μmol/L的GCDC后，同时设正常细胞对照组，培养24h后取出小飞片，PBS洗 1次，风干，置40g/L多聚甲醛内室温固定30min后，常规乙醇逐级脱水，4℃保存，行TUNEL检测；同时用2.5g/L胰酶将培养孔内细胞消化下来，制成单细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗两次，用70mL/L冷乙醇固定，4℃保存行FCM检测. ②DNA含量流式细胞术分析(FCM)：取出70%冷乙醇固定的细胞悬液，用pH 7.4的PBS洗涤，离心后去除固定液，加碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)，混匀，4℃，避光30min后，应用流式细胞仪FACStar(美国BD公司)检测. ③用TUNEL法进行细胞凋亡的原位检测：在TdT介导下，使生物素化的dUTP标记至DNA断裂后形成的3’-OH末端，借助生物素与亲合素的特异结合，使过氧化物酶连接至DNA断点，最后加入底物，可在显微镜下观察着色的凋亡细胞. 阳性细胞核着棕黄色(DAB显色).
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统计学处理 所有数据均用算术均数±标准差(
±s)表示，所获数据采用同济医科大学统计教研室提供的SAS统计软件包行多元方差分析，P<0.05为差异有显著性.
2 结果
2.1 GCDC致肝细胞凋亡 DNA含量：GCDC作用的肝细胞在G1峰左侧有一亚二倍体细胞群的峰型(亚G1峰)，提示发生肝细胞凋亡，且随GCDC作用的浓度的增加肝细胞凋亡率增加，P<0.01 ；150μmol/L GCDC作用24h后肝细胞的凋亡率达38%±1%(表1).
表1 GCDC作用24h后对大鼠肝细胞凋亡的影响
(%,±s)
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GCDC(μmol/L)
凋亡率
对照
3.6±0.7
25
16.6±2.5
50
23.2±1.6
100
34.9±2.9
150
38.2±1.5
200
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33.9±2.3
2.2 肝细胞凋亡TUNEL原位检查 TUNEL阳性细胞核着棕黄色(DAB显色)，正常肝细胞可见少数阳性细胞，GCDC作用后可见多量阳性细胞弥漫散在，胞质固缩，与邻周细胞脱离、核染色质浓缩.
3 讨论
在阻塞性黄疸中，过多的胆盐潴留在肝脏内造成对肝细胞的损伤[1，2]. 我们所采用的甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)是胆汁成分中的主要胆盐之一. 在细胞凋亡的检测中，DNA含量流式细胞术分析法(FCM)是基于凋亡细胞内DNA被切割，经处理后可抽提出凋亡细胞中低分子量DNA，由于凋亡细胞与PI的亲染力比G1期细胞低，在FCM DNA直方图中，凋亡细胞表现为G1/G0前的亚二倍体峰，同时可检出细胞的凋亡率. 该方法快速、简便，是目前最常用的凋亡定量检测方法. 而1992年Gavrieli首创的TUNEL法可特异原位显示凋亡，克服FCM只能定量，不能定性的缺点，进一步丰富了凋亡的病理检测.
, 百拇医药
我们通过肝细胞的分离获取肝细胞并进行体外短期培养，排除了其他因素后来研究胆盐本身对肝细胞的作用，并采用目前最常用FCM进行检测，结果表明，胆盐可诱发肝细胞的凋亡，且随胆盐浓度的增加，肝细胞凋亡的比率明显增加；同时，本研究结合TUNEL技术进行细胞凋亡的原位检测，进一步证实了胆盐可诱发肝细胞凋亡，这可能是阻塞性黄疸肝损害的发生机制. 通过研究胆盐诱发肝细胞的凋亡及进一步研究其调控机制，可为发现新的保肝药物及阻黄的治疗开辟新途径.
通讯作者：王剑明
参考文献
1 Allen PD, Bustin SA, Newland AC. The role of apoptosis (programmed cell death)in haemapoiesis and the immune system. Blood Rev, 1993;7:63-70
2 Patel T, Bronk SF, Gores GF. Apoptosis and hepatobiliary disease. Hepatology, 1995;21:1725-1726ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(10):891
收稿日期 1999-04-15 修回日期 1999-07-01, 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
关键词：甘氨鹅脱氧胆酸钠；肝细胞；细胞凋亡
中国图书馆分类号 R575中国图书馆分类号 R575
Subject headings glycochenideoxcholate; hepatocytes; apoptosis
在阻塞性黄疸中因胆汁瘀积引起胆盐的升高，进而导致肝损害，但其损害机制尚未阐明. 阻塞性黄疸(阻黄)时胆盐对肝细胞凋亡的影响知之甚少. 我们用DNA含量流式细胞术(FCM)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)研究不同浓度的甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)对体外培养大鼠肝细胞凋亡状态的影响，以探讨阻黄肝损害的病理机制.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ①肝细胞的分离与培养：采用胶原酶原位肝灌注法. 健康♂Wistar大鼠，氯胺酮0.2mg/kg ip，麻醉后固定体位，消毒皮肤后进腹，显露游离门静脉后距肝门2cm处插入18号导管，用D-Hanks液(含0.1g/L EDTA，pH 7.4，37℃)以25mL/min灌入，然后于肝下后腔静脉插入16号导管放出积血积液；门静脉改用0.5g/L IV型胶原酶及0.1g/L DNase I Hanks液持续灌注5min，取下肝脏，置入含4℃ Hanks液的平皿中，剪去肝被膜，加2.5g/L胰蛋白酶继续消化20min，Hanks液终止，100目尼龙网过滤，加RPMI1640 50mL，制成混合肝细胞悬液，置入37℃恒温水浴中孵化10min，过滤，离心，去上清，4℃ hanks液重悬. 用40g/L盼蓝染色判断肝细胞活率，用细胞计数板记数细胞浓度. 细胞培养于合成培养基(含RPMI1640 80mL，新生小牛血清20mL、青霉素100kU/L，链霉素100g/L，胰岛素0.1kU/L，以及hepes 15mmol) 培养条件37℃，50mL/L CO2. ②主要试剂：IV型胶原酶、DNaseⅠ、胰蛋白酶、甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)、碘化丙锭(PI)染色剂为Sigma公司产品；细胞凋亡原位检测试剂盒(TUNEL)为德国宝灵曼公司提供.
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1.2 方法 ①GCDC致肝细胞凋亡的实验：将肝细胞按1×108/L分种于内含小飞片的24孔培养板中，培养36h，用培养液洗涤一次，换新鲜培养液，分别加入终浓度为25，50，100，150，200μmol/L的GCDC后，同时设正常细胞对照组，培养24h后取出小飞片，PBS洗 1次，风干，置40g/L多聚甲醛内室温固定30min后，常规乙醇逐级脱水，4℃保存，行TUNEL检测；同时用2.5g/L胰酶将培养孔内细胞消化下来，制成单细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗两次，用70mL/L冷乙醇固定，4℃保存行FCM检测. ②DNA含量流式细胞术分析(FCM)：取出70%冷乙醇固定的细胞悬液，用pH 7.4的PBS洗涤，离心后去除固定液，加碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)，混匀，4℃，避光30min后，应用流式细胞仪FACStar(美国BD公司)检测. ③用TUNEL法进行细胞凋亡的原位检测：在TdT介导下，使生物素化的dUTP标记至DNA断裂后形成的3’-OH末端，借助生物素与亲合素的特异结合，使过氧化物酶连接至DNA断点，最后加入底物，可在显微镜下观察着色的凋亡细胞. 阳性细胞核着棕黄色(DAB显色).
, http://www.100md.com
统计学处理 所有数据均用算术均数±标准差(
±s)表示，所获数据采用同济医科大学统计教研室提供的SAS统计软件包行多元方差分析，P<0.05为差异有显著性.2 结果
2.1 GCDC致肝细胞凋亡 DNA含量：GCDC作用的肝细胞在G1峰左侧有一亚二倍体细胞群的峰型(亚G1峰)，提示发生肝细胞凋亡，且随GCDC作用的浓度的增加肝细胞凋亡率增加，P<0.01 ；150μmol/L GCDC作用24h后肝细胞的凋亡率达38%±1%(表1).
表1 GCDC作用24h后对大鼠肝细胞凋亡的影响
(%,
±s), http://www.100md.com
GCDC(μmol/L)
凋亡率
对照
3.6±0.7
25
16.6±2.5
50
23.2±1.6
100
34.9±2.9
150
38.2±1.5
200
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33.9±2.3
2.2 肝细胞凋亡TUNEL原位检查 TUNEL阳性细胞核着棕黄色(DAB显色)，正常肝细胞可见少数阳性细胞，GCDC作用后可见多量阳性细胞弥漫散在，胞质固缩，与邻周细胞脱离、核染色质浓缩.
3 讨论
在阻塞性黄疸中，过多的胆盐潴留在肝脏内造成对肝细胞的损伤[1，2]. 我们所采用的甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)是胆汁成分中的主要胆盐之一. 在细胞凋亡的检测中，DNA含量流式细胞术分析法(FCM)是基于凋亡细胞内DNA被切割，经处理后可抽提出凋亡细胞中低分子量DNA，由于凋亡细胞与PI的亲染力比G1期细胞低，在FCM DNA直方图中，凋亡细胞表现为G1/G0前的亚二倍体峰，同时可检出细胞的凋亡率. 该方法快速、简便，是目前最常用的凋亡定量检测方法. 而1992年Gavrieli首创的TUNEL法可特异原位显示凋亡，克服FCM只能定量，不能定性的缺点，进一步丰富了凋亡的病理检测.
, 百拇医药
我们通过肝细胞的分离获取肝细胞并进行体外短期培养，排除了其他因素后来研究胆盐本身对肝细胞的作用，并采用目前最常用FCM进行检测，结果表明，胆盐可诱发肝细胞的凋亡，且随胆盐浓度的增加，肝细胞凋亡的比率明显增加；同时，本研究结合TUNEL技术进行细胞凋亡的原位检测，进一步证实了胆盐可诱发肝细胞凋亡，这可能是阻塞性黄疸肝损害的发生机制. 通过研究胆盐诱发肝细胞的凋亡及进一步研究其调控机制，可为发现新的保肝药物及阻黄的治疗开辟新途径.
通讯作者：王剑明
参考文献
1 Allen PD, Bustin SA, Newland AC. The role of apoptosis (programmed cell death)in haemapoiesis and the immune system. Blood Rev, 1993;7:63-70
2 Patel T, Bronk SF, Gores GF. Apoptosis and hepatobiliary disease. Hepatology, 1995;21:1725-1726ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(10):891
收稿日期 1999-04-15 修回日期 1999-07-01, 百拇医药