胰腺癌单克隆抗体重链可变区基因的扩增
作者：袁世珍 张厚德△
单位：△现在深圳市南山医院消化内科(518052)
关键词：胰腺肿瘤；抗体，单克隆；基因；聚合酶链式反应
广东医学991006 【摘要】 目的 从分泌抗体的胰腺癌杂交瘤YPC3细胞扩增单抗重链可变区基因。方法 以一步法提取杂交瘤细胞RNA，通过逆转录及聚合酶链式反应，反应产物以琼脂糖凝胶电泳观察。结果 扩增的基因长度为350 bp，对照骨髓瘤细胞SP2/0未见扩增。结论 该基因的成功扩增将为胰腺癌基因工程抗体的制备奠定了基础。
Amplification of the heavy chain variable gene of a monoclonal antibody to pancreatic carcinoma
Yuan Shizhen, Zhang Houde.
, http://www.100md.com
Department of Gastroenterology, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective To amplify the heavy chain variable gene from a hybridoma YPC3 cell line.Methods Total RNA was isolated by a single rapid step of guanidinium extraction. Reverse transcription and polymerase chain reaction were used to amplify the heavy chain variable gene. Biochemical characterization of the gene was showed by gel electrophoresis.Results A strong amplification of a 350 bp DNA segment was found in hybridoma YPC3 while not any amplification in SP2/0 mouse myeloma cells.Conclusion Successful amplification of the heavy chain variable gene makes it possible to generate engineering antibody to pancreatic carcinoma.
, 百拇医药
【Key words】 Pancreatic neoplasm Antibody, monoclonal Gene Polymerase chain reaction
自1975年单克隆抗体技术问世以来，各种抗肿瘤单抗相继制备成功，并进行了特异性肿瘤放射免疫定位显像诊断和免疫导向治疗研究。然而，由于鼠源性单抗的异源性而阻碍了其在临床应用[1]。近年来，蛋白质基因工程技术的飞速发展，运用抗体改型技术降低肿瘤鼠源性单抗对人体的免疫源性和制备小分子抗体已成为可能。本研究从YPC3杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA，经PCR法扩增出胰腺癌单抗的重链可变区基因，为进一步制备胰腺癌基因工程抗体奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料 胰腺癌细胞株Capan-2由美国加州大学医学院引进，骨髓瘤细胞SP2/0由中山医科大学微生物教研室提供。BALB/c裸鼠购自本校实验动物研究中心。PEG、HT购自Sigma，HAT购自Merk。用于扩增抗体重链可变区基因的一对引物VH BACK5′ AGG TGC AGC TGC AGG AGT CAG G3′和VH FOR5′ TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G3′由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。PCR kit购自复旦大学遗传所，cDNA synthesis kit购自Promega公司。
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1.2 主要方法
1.2.1 抗胰腺癌单克隆抗体的制备和筛选 BALB/c纯系小鼠经人胰腺癌细胞株Capan-2裸鼠移植物腹腔免疫后，取其脾细胞与非分泌性骨髓瘤细胞SP 2/0混合，用50%的PEG融合。融合物接种于96孔板，以HAT选择培养基培养。再以Capan-2细胞作为包被抗原，取杂交瘤上清液作ELISA初筛出抗体阳性杂交瘤孔。进一步以免疫组化比较筛选出目的杂交瘤。有限稀释法克隆化目的杂交瘤，按常规方法制备腹水型单抗。
1.2.2 细胞总RNA提取 采用Chomczynski等[2]创立的一步快速RNA提取法提取上述分泌单抗的杂交瘤细胞RNA。
1.2.3 cDNA第一链的合成 取总RNA 5 μL, VH FOR引物20 pmol,dNTP各1 mmol，RNasin 2.5 u, AMV反转录酶15 u, MgCl2 5 mM,Tris-HCl(pH 8.8)10 mmol, KCl 50 mmol, Triton X-100 0.1%。于42℃反应1 h，95℃水浴5 min终止反应，置于-20℃备用。
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1.2.4 PCR扩增反应 PCR反应总体积为50 μL。内含cDNA第一链模板5 μL，10×PCR反应缓冲液5 μL，dNTP 4 μL,25 pmol/L的引物各2 μL， Taq DNA聚合酶1 μL，去离子水补至50 μL。在DNA扩增仪上进行扩增：93℃ 45 s,58℃ 45 s, 72℃ 50 s,30个循环后，取5 μL反应产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后，在紫外透照仪下观察结果和拍照。
2 结果
2.1 分泌胰腺癌单抗杂交瘤细胞株的获得 7次融合中有4次融合成功，ELISA初筛共获得49个抗体阳性孔，进一步行比较筛选，再以有限稀释法克隆出3孔仅对胰腺癌反应而与正常胰腺、淋巴结、肝和肾脏等组织无反应的杂交瘤，最终获得一株在体外连续培养5个月仍能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为YPC3。
2.2 单抗重链可变区基因的扩增 经1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，结果显示从杂交瘤YPC3能扩增出约350 bp的一特异性条带，在文献报道的300～400 bp范围内，说明为重链可变区基因。从对照细胞SP2/0中未能扩增出相应条带。见图1。
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图1 YPC3和SP2/0细胞的PCR产物的凝胶电泳结果
1：SP2/0细胞cDNA模板； 2：YPC3细胞cDNA模板； 3：PCR标记
3 讨论
获得抗体的可变区基因是进一步进行抗体基因工程改造的基础，目前，有两条途径可获得抗体可变区基因，一是从细胞DNA基因组文库或cDNA文库中筛选，另一是应用PCR技术从免疫球蛋白cDNA中扩增出抗体可变区基因[3，4]。前者较为繁琐、所需费用较高，后者虽然较为简便易行，但以PCR扩增未知序列的可变区基因，首要解决的关键问题是特异性引物的设计。众所周知，千百万各种免疫球蛋白的氨基酸序列，乃至其基因的核苷酸序列是各不相同的，而可变区基因的变动又是最大，但在可变区非超变区仍存在一定的保守性序列。Orlandi等[5]于1989年应用电子计算机分析比较已知序列的免疫球蛋白重链和轻链可变区基因核苷酸序列，发现在小鼠抗体可变区基因的两端都存在着较高的保守序列，据此可设计出一对通用引物，能扩增出序列未知的抗体可变区基因。我们应用通用引物从分泌抗胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增出重链可变区基因，大小约350 bp,与国内、外文献报道的抗体重链可变区基因大小一致，说明该方法简便而又可行。
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卫生部临床学科重点项目资助课题；
胰腺癌单抗重链可变区基因的成功扩增，为进一步制备胰腺癌基因工程抗体奠定了基础。
4 参考文献
1 Waldmann TA. Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science, 1991, 252:1657
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156
3 Shearman CW, Kanzy EJ, Lawrie DE, et al. Construction, expression, and biologic activity of murine/human chimeric antibodies with specificity for human a/BT cell receptor. J Immunol, 1991, 146:928
, http://www.100md.com
4 LeBoeuf RD, Galin FS, Hollinger K, et al. Cloning and sequencing of immunoglobulin variable-region genes using degenerate oligodeoxy-rebonucleotides and polymerase chain reaction. Gene, 1989, 82:371
5 Orlandi R, Gussow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 3833, http://www.100md.com
单位：△现在深圳市南山医院消化内科(518052)
关键词：胰腺肿瘤；抗体，单克隆；基因；聚合酶链式反应
广东医学991006 【摘要】 目的 从分泌抗体的胰腺癌杂交瘤YPC3细胞扩增单抗重链可变区基因。方法 以一步法提取杂交瘤细胞RNA，通过逆转录及聚合酶链式反应，反应产物以琼脂糖凝胶电泳观察。结果 扩增的基因长度为350 bp，对照骨髓瘤细胞SP2/0未见扩增。结论 该基因的成功扩增将为胰腺癌基因工程抗体的制备奠定了基础。
Amplification of the heavy chain variable gene of a monoclonal antibody to pancreatic carcinoma
Yuan Shizhen, Zhang Houde.
, http://www.100md.com
Department of Gastroenterology, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective To amplify the heavy chain variable gene from a hybridoma YPC3 cell line.Methods Total RNA was isolated by a single rapid step of guanidinium extraction. Reverse transcription and polymerase chain reaction were used to amplify the heavy chain variable gene. Biochemical characterization of the gene was showed by gel electrophoresis.Results A strong amplification of a 350 bp DNA segment was found in hybridoma YPC3 while not any amplification in SP2/0 mouse myeloma cells.Conclusion Successful amplification of the heavy chain variable gene makes it possible to generate engineering antibody to pancreatic carcinoma.
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【Key words】 Pancreatic neoplasm Antibody, monoclonal Gene Polymerase chain reaction
自1975年单克隆抗体技术问世以来，各种抗肿瘤单抗相继制备成功，并进行了特异性肿瘤放射免疫定位显像诊断和免疫导向治疗研究。然而，由于鼠源性单抗的异源性而阻碍了其在临床应用[1]。近年来，蛋白质基因工程技术的飞速发展，运用抗体改型技术降低肿瘤鼠源性单抗对人体的免疫源性和制备小分子抗体已成为可能。本研究从YPC3杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA，经PCR法扩增出胰腺癌单抗的重链可变区基因，为进一步制备胰腺癌基因工程抗体奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料 胰腺癌细胞株Capan-2由美国加州大学医学院引进，骨髓瘤细胞SP2/0由中山医科大学微生物教研室提供。BALB/c裸鼠购自本校实验动物研究中心。PEG、HT购自Sigma，HAT购自Merk。用于扩增抗体重链可变区基因的一对引物VH BACK5′ AGG TGC AGC TGC AGG AGT CAG G3′和VH FOR5′ TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G3′由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。PCR kit购自复旦大学遗传所，cDNA synthesis kit购自Promega公司。
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1.2 主要方法
1.2.1 抗胰腺癌单克隆抗体的制备和筛选 BALB/c纯系小鼠经人胰腺癌细胞株Capan-2裸鼠移植物腹腔免疫后，取其脾细胞与非分泌性骨髓瘤细胞SP 2/0混合，用50%的PEG融合。融合物接种于96孔板，以HAT选择培养基培养。再以Capan-2细胞作为包被抗原，取杂交瘤上清液作ELISA初筛出抗体阳性杂交瘤孔。进一步以免疫组化比较筛选出目的杂交瘤。有限稀释法克隆化目的杂交瘤，按常规方法制备腹水型单抗。
1.2.2 细胞总RNA提取 采用Chomczynski等[2]创立的一步快速RNA提取法提取上述分泌单抗的杂交瘤细胞RNA。
1.2.3 cDNA第一链的合成 取总RNA 5 μL, VH FOR引物20 pmol,dNTP各1 mmol，RNasin 2.5 u, AMV反转录酶15 u, MgCl2 5 mM,Tris-HCl(pH 8.8)10 mmol, KCl 50 mmol, Triton X-100 0.1%。于42℃反应1 h，95℃水浴5 min终止反应，置于-20℃备用。
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1.2.4 PCR扩增反应 PCR反应总体积为50 μL。内含cDNA第一链模板5 μL，10×PCR反应缓冲液5 μL，dNTP 4 μL,25 pmol/L的引物各2 μL， Taq DNA聚合酶1 μL，去离子水补至50 μL。在DNA扩增仪上进行扩增：93℃ 45 s,58℃ 45 s, 72℃ 50 s,30个循环后，取5 μL反应产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后，在紫外透照仪下观察结果和拍照。
2 结果
2.1 分泌胰腺癌单抗杂交瘤细胞株的获得 7次融合中有4次融合成功，ELISA初筛共获得49个抗体阳性孔，进一步行比较筛选，再以有限稀释法克隆出3孔仅对胰腺癌反应而与正常胰腺、淋巴结、肝和肾脏等组织无反应的杂交瘤，最终获得一株在体外连续培养5个月仍能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为YPC3。
2.2 单抗重链可变区基因的扩增 经1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，结果显示从杂交瘤YPC3能扩增出约350 bp的一特异性条带，在文献报道的300～400 bp范围内，说明为重链可变区基因。从对照细胞SP2/0中未能扩增出相应条带。见图1。
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图1 YPC3和SP2/0细胞的PCR产物的凝胶电泳结果
1：SP2/0细胞cDNA模板； 2：YPC3细胞cDNA模板； 3：PCR标记
3 讨论
获得抗体的可变区基因是进一步进行抗体基因工程改造的基础，目前，有两条途径可获得抗体可变区基因，一是从细胞DNA基因组文库或cDNA文库中筛选，另一是应用PCR技术从免疫球蛋白cDNA中扩增出抗体可变区基因[3，4]。前者较为繁琐、所需费用较高，后者虽然较为简便易行，但以PCR扩增未知序列的可变区基因，首要解决的关键问题是特异性引物的设计。众所周知，千百万各种免疫球蛋白的氨基酸序列，乃至其基因的核苷酸序列是各不相同的，而可变区基因的变动又是最大，但在可变区非超变区仍存在一定的保守性序列。Orlandi等[5]于1989年应用电子计算机分析比较已知序列的免疫球蛋白重链和轻链可变区基因核苷酸序列，发现在小鼠抗体可变区基因的两端都存在着较高的保守序列，据此可设计出一对通用引物，能扩增出序列未知的抗体可变区基因。我们应用通用引物从分泌抗胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增出重链可变区基因，大小约350 bp,与国内、外文献报道的抗体重链可变区基因大小一致，说明该方法简便而又可行。
, 百拇医药
卫生部临床学科重点项目资助课题；
胰腺癌单抗重链可变区基因的成功扩增，为进一步制备胰腺癌基因工程抗体奠定了基础。
4 参考文献
1 Waldmann TA. Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science, 1991, 252:1657
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156
3 Shearman CW, Kanzy EJ, Lawrie DE, et al. Construction, expression, and biologic activity of murine/human chimeric antibodies with specificity for human a/BT cell receptor. J Immunol, 1991, 146:928
, http://www.100md.com
4 LeBoeuf RD, Galin FS, Hollinger K, et al. Cloning and sequencing of immunoglobulin variable-region genes using degenerate oligodeoxy-rebonucleotides and polymerase chain reaction. Gene, 1989, 82:371
5 Orlandi R, Gussow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 3833, http://www.100md.com