急性胰腺炎发病过程中肿瘤坏死因子作用的实验研究
作者：吕洪光 薛东波 王智
单位：吕洪光 薛东波 王智 哈尔滨医科大学附属第一医院普外科，150001
关键词：肿瘤坏死因子；急性胰腺炎；放射免疫学
中国急救医学991010 摘要 目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)在急性胰腺炎(AP)发病过程中的作用。方法 采用放射免疫学法检测TNF-α水平，并分析其与急性胰腺炎病变严重程度(以病理切片确定)的相关性。结果 胰腺炎组B(215±90 pg/ml)、胰腺炎加重组C(241±75 pg/ml)、胰腺炎拮抗组D(175±26.8 pg/ml)的血清TNF-α水平都比对照组A(24.1±8.2 pg/ml)明显增高(P<0.05)。结论 TNF-α在急性胰腺炎的发病过程中起重要的介导作用，并反映急性胰腺炎的病变程度，阻断TNF-α能减轻急性胰腺炎的病理损害作用。
中图分类号 R 576；R 446.6 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)10-
, 百拇医药
Experimental study of the effects of tumor necrosis factor (TNF-α) in acute pancreatitis
LU Hong-guang， XUE Dong-bo， WANG Zhi. General Surgery Department the lst Affiliated Hospital of Harbin Medical University，150001,China
Abstract Objective To explore the effects of tumor necrosis factor (TNF-α)in pathogenesis of acute pancreatitis.Methods Serum TNF-α level was detected by radioimmunologic assay,and the relavence was analysised between pathologic severity of pancrease and serum TNF-α level.Result Serum TNF-α level of group B (pancreatitis group 215±90 pg/ml),group C (pancreatitis enhanced group 241±75 pg/ml),group D (pancreatitis antagonist group 175±26.8 pg/ml),was significant higher than that of group A (control group 24.1±8.2 pg/ml).Conclusion TNF-α may induce the pathogenesis of acute pancreatitis,and serum level of TNF-α response the severity of pancreatitis,anti-TNF treatment can releave the pathologic damage of acute pancreatitis.
, http://www.100md.com
Key words Tumor necrosis factor(TNF)； Acute pancreatitis； Radioimmunologic assay
关于急性胰腺炎的机制目前仍在研究中，随着免疫学的发展，对细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF-α)的研究取得较大进展。目前已有人观察到急性胰腺炎患者血清中TNF-α水平升高。本研究以动物实验的方法，观察TNF-α与急性胰腺炎之间的关系，并研究拮抗TNF-α是否具有减轻胰腺病理损害的作用。
1 资料与方法
1.1 动物与分组
成年雌性Wistar大鼠240只，体重165±25 g，随机分为四组，对照组(A)，胰腺炎组(B)，胰腺炎加重组(C)，胰腺炎拮抗组(D)，每组60只。
1.2 胰腺炎模型制作
, http://www.100md.com
本研究按Satoshi Tani等[1]学者报道采用腹腔内单次注射过量左旋精氨酸(L-arg)致成年大鼠急性胰腺炎，剂量400 mg/100 g。
A组：单次腹腔内注射等量生理盐水。
B组：单次腹腔内注射20%L-arg,剂量 400 mg/100 g。
C组：单次腹腔内注射20%L-arg,剂量 400 mg/100 g后，随即腹腔内注射TNF-α，剂量500 μ/100 g。
D组：腹腔内注射抗TNF-α单抗，剂量20 μg/100 g，再腹腔内注射20%L-arg,剂量 400 mg/100 g。
1.3 TNF-α水平的测定
所有A、B、C、D四组实验小鼠，分别于24 h、48 h、72 h处死，取血2 ml，置于-70℃保存。按TNF-α放免试剂盒(购自北京东亚免疫研究所)的要求进行操作，在自动γ计数仪上测定。
, 百拇医药
1.4 胰腺病理和大体观察
实验鼠处死取血后，取胰腺组织，用10%甲醛固定，蜡块包埋，切片厚40 μm。
1.5 统计学处理
实验数据用SYSTAT软件进行处理，结果以
±s表示。
2 结果
2.1 A、B、C、D四组在24 h、48 h、72 h其死亡数分别为6、4、7只，总死亡数为9.4%。B、C、D三组在24 h、48 h、72 h血清中TNF-α含量变化均与A组有显著性差异P<0.05，见附表及图1。
附表 实验大鼠TNF-α数值变化 时 间
, 百拇医药
A组
血TNF-α(ng/ml)
B组
血TNF-α(ng/ml)
C组
血TNF-α(ng/ml)
D组
血TNF-α(ng/ml)
24 h
23.3±7.9(20)
205±45(18)*
220±70(17)*
, http://www.100md.com
170±25(19)*
48 h
24.1±8.2(20)
215±90(19)*
241±75(17)*
175±26.8(20)*
72 h
24.5±8.1(20)
230±66(18)*
270±42(16)*
, 百拇医药
180±24.3(19)*
()内为存活标本数 *与对照组比P<0.05
图1 A、B、C、D四组的TNF-α在24 h、48 h、72 h的含量变化图
可见①24 hB、C、D三组TNF-α明显升高P<0.05。②48 hB、C、D三组TNF-α明显升高P<0.05。③72 hB、C、D三组TNF-α明显升高P<0.05。与A组相比有显著性差异P<0.05。
2.2 病理结果见图2，图3。
图2 胰腺病理对照(100X)
, 百拇医药
图3 大鼠胰腺炎时病理改变(100X)
2.2.1 大体观察 实验组大鼠胰腺均呈水肿状态
A组：24 h、48 h、72 h大鼠无明显异常病理改变。
B组：24 h胰腺水肿明显；48 h胰周组织皂化斑；72 h部分鼠淡红色血性腹水，肾包膜水肿，肝脏充血。
C组：24 h胰腺瘀血，呈灰褐色；48 h周围皂化斑较多；72 h肝脏明显充血，肾包膜色泽灰白或暗红。
D组：24 h胰腺充血水肿；48 h、72 h12指肠、胃高度扩张。
2.2.2 光镜观察 ①24 h胰腺轻度充血。②48 h胰腺充血，间质炎性细胞浸润，胰腺实质点状、凝固状坏死。③72 h胰腺大片凝固坏死，结构模糊，炎性细胞浸润。
, 百拇医药
3 讨论
TNF-α是一种重要的调节机体免疫功能和代谢过程的多功能细胞因子，除了对肿瘤细胞具有抑制生长和细胞毒作用外，还可影响其他细胞的生长分化[2]。TNF-α的作用与其在组织中的水平有关，低水平的TNF-α在组织修复炎症应答中发挥作用，对机体有利；而大量的TNF-α释放(浓度≥10-8mol/L)可导致机体消耗增加，组织严重损伤，微血管内凝血，心脏抑制及低血压[3]。
肿瘤坏死因子(TNF-α)被认为既可直接诱导血管内皮细胞的通透性增加，也可间接通过白细胞发挥作用[4]。TNF-α可促进炎症区白细胞的积聚和激活，激活的白细胞在TNF-α作用下可释放几种增强毛细血管通透性的细胞介质，这些介质包括血小板活化因子(PAP)，白三烯B4(LTB4)，一氧化氮(NO)，血栓素A2(TXA2)，前列腺素(PG)，氧自由基等。TNF-α可刺激磷脂酶A2的分化，也可直接激活磷脂酶A2。TNF-α对血管内皮的粘附分子如ELAM-1和ICAM-1有向上调节作用，粘附分子向上调节可促进白细胞的粘附和收缩，造成毛细血管渗漏和组织损害。
, 百拇医药
TNF-α拮抗剂为临床治疗急性胰腺炎提供线索。①抗肿瘤坏死因子抗体[5]。②抗肿瘤坏死因子受体抗体。③可溶性肿瘤坏死因子受体(STNFR)[6]。④抑制或减少TNF-α的合成与释放[7]。
本研究结果表明B、C、D三组TNF-α较A组明显升高(P<0.05)。B、C二组比较(P<0.05)说明TNF-α对急性胰腺炎起促进作用，加重胰腺的病理改变。B组、D组比较(P<0.05)说明抗TNF-α在急性胰腺炎发展过程中起拮抗作用，阻断TNF-α能减轻胰腺病理损害。由此证明TNF-α在急性胰腺炎的发病过程中起重要的介导作用。
参考文献
[1]Lerch MM,Adler G.Expreimental animal models of acute pancreatitis[J].Inter J Pancreat,1994,15:159-170.
, 百拇医药
[2]吕洪光，薛东波.急性胰腺炎发病过程中肿瘤坏死因子作用的研究进展[J].中国急救医学，1999，19(6)：383-384.
[3]Wilson PG,Manji M,Neoptolemos JP,et al.Acute pancreatitis as a model of sepsis[J]. J Antimicrob Chemother,1998,41(Suppl A):51-63.
[4]Exley AR,Lecse T,Holliday MP.Endotoxaemia and serum tumour necrosis factor as prognostic marker in severe acute pancreatitis[J].Gut,1992,33:1126-8.
[5]Grewal HP,Din AM,Gaber L,et al.Amelioration of physiologic and biochomical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF polyclonal antibody[J]. Am J Sursery,1994,167:214-219.
, 百拇医药
[6]Dinarello CA,Gelfand JA,Wolff SM.Anticytokine strategies in the treatment of the systemic in flummatory resportse syndrome[J].JAMA, 1993,269:1829-34.
[7]Lazar G,Varga J,Lazar G,et al.The effects of glucocorticoids and a glucocorticoids antgonist(RU 38486) on experimental acute pancreatitis in rats[J].Acta Chir Hung,1997,36(1-4):190-1.
收稿：1999-03-26, http://www.100md.com
单位：吕洪光 薛东波 王智 哈尔滨医科大学附属第一医院普外科，150001
关键词：肿瘤坏死因子；急性胰腺炎；放射免疫学
中国急救医学991010 摘要 目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)在急性胰腺炎(AP)发病过程中的作用。方法 采用放射免疫学法检测TNF-α水平，并分析其与急性胰腺炎病变严重程度(以病理切片确定)的相关性。结果 胰腺炎组B(215±90 pg/ml)、胰腺炎加重组C(241±75 pg/ml)、胰腺炎拮抗组D(175±26.8 pg/ml)的血清TNF-α水平都比对照组A(24.1±8.2 pg/ml)明显增高(P<0.05)。结论 TNF-α在急性胰腺炎的发病过程中起重要的介导作用，并反映急性胰腺炎的病变程度，阻断TNF-α能减轻急性胰腺炎的病理损害作用。
中图分类号 R 576；R 446.6 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)10-
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Experimental study of the effects of tumor necrosis factor (TNF-α) in acute pancreatitis
LU Hong-guang， XUE Dong-bo， WANG Zhi. General Surgery Department the lst Affiliated Hospital of Harbin Medical University，150001,China
Abstract Objective To explore the effects of tumor necrosis factor (TNF-α)in pathogenesis of acute pancreatitis.Methods Serum TNF-α level was detected by radioimmunologic assay,and the relavence was analysised between pathologic severity of pancrease and serum TNF-α level.Result Serum TNF-α level of group B (pancreatitis group 215±90 pg/ml),group C (pancreatitis enhanced group 241±75 pg/ml),group D (pancreatitis antagonist group 175±26.8 pg/ml),was significant higher than that of group A (control group 24.1±8.2 pg/ml).Conclusion TNF-α may induce the pathogenesis of acute pancreatitis,and serum level of TNF-α response the severity of pancreatitis,anti-TNF treatment can releave the pathologic damage of acute pancreatitis.
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Key words Tumor necrosis factor(TNF)； Acute pancreatitis； Radioimmunologic assay
关于急性胰腺炎的机制目前仍在研究中，随着免疫学的发展，对细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF-α)的研究取得较大进展。目前已有人观察到急性胰腺炎患者血清中TNF-α水平升高。本研究以动物实验的方法，观察TNF-α与急性胰腺炎之间的关系，并研究拮抗TNF-α是否具有减轻胰腺病理损害的作用。
1 资料与方法
1.1 动物与分组
成年雌性Wistar大鼠240只，体重165±25 g，随机分为四组，对照组(A)，胰腺炎组(B)，胰腺炎加重组(C)，胰腺炎拮抗组(D)，每组60只。
1.2 胰腺炎模型制作
, http://www.100md.com
本研究按Satoshi Tani等[1]学者报道采用腹腔内单次注射过量左旋精氨酸(L-arg)致成年大鼠急性胰腺炎，剂量400 mg/100 g。
A组：单次腹腔内注射等量生理盐水。
B组：单次腹腔内注射20%L-arg,剂量 400 mg/100 g。
C组：单次腹腔内注射20%L-arg,剂量 400 mg/100 g后，随即腹腔内注射TNF-α，剂量500 μ/100 g。
D组：腹腔内注射抗TNF-α单抗，剂量20 μg/100 g，再腹腔内注射20%L-arg,剂量 400 mg/100 g。
1.3 TNF-α水平的测定
所有A、B、C、D四组实验小鼠，分别于24 h、48 h、72 h处死，取血2 ml，置于-70℃保存。按TNF-α放免试剂盒(购自北京东亚免疫研究所)的要求进行操作，在自动γ计数仪上测定。
, 百拇医药
1.4 胰腺病理和大体观察
实验鼠处死取血后，取胰腺组织，用10%甲醛固定，蜡块包埋，切片厚40 μm。
1.5 统计学处理
实验数据用SYSTAT软件进行处理，结果以
±s表示。2 结果
2.1 A、B、C、D四组在24 h、48 h、72 h其死亡数分别为6、4、7只，总死亡数为9.4%。B、C、D三组在24 h、48 h、72 h血清中TNF-α含量变化均与A组有显著性差异P<0.05，见附表及图1。
附表 实验大鼠TNF-α数值变化 时 间
, 百拇医药
A组
血TNF-α(ng/ml)
B组
血TNF-α(ng/ml)
C组
血TNF-α(ng/ml)
D组
血TNF-α(ng/ml)
24 h
23.3±7.9(20)
205±45(18)*
220±70(17)*
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170±25(19)*
48 h
24.1±8.2(20)
215±90(19)*
241±75(17)*
175±26.8(20)*
72 h
24.5±8.1(20)
230±66(18)*
270±42(16)*
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180±24.3(19)*
()内为存活标本数 *与对照组比P<0.05
图1 A、B、C、D四组的TNF-α在24 h、48 h、72 h的含量变化图
可见①24 hB、C、D三组TNF-α明显升高P<0.05。②48 hB、C、D三组TNF-α明显升高P<0.05。③72 hB、C、D三组TNF-α明显升高P<0.05。与A组相比有显著性差异P<0.05。
2.2 病理结果见图2，图3。
图2 胰腺病理对照(100X)
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图3 大鼠胰腺炎时病理改变(100X)
2.2.1 大体观察 实验组大鼠胰腺均呈水肿状态
A组：24 h、48 h、72 h大鼠无明显异常病理改变。
B组：24 h胰腺水肿明显；48 h胰周组织皂化斑；72 h部分鼠淡红色血性腹水，肾包膜水肿，肝脏充血。
C组：24 h胰腺瘀血，呈灰褐色；48 h周围皂化斑较多；72 h肝脏明显充血，肾包膜色泽灰白或暗红。
D组：24 h胰腺充血水肿；48 h、72 h12指肠、胃高度扩张。
2.2.2 光镜观察 ①24 h胰腺轻度充血。②48 h胰腺充血，间质炎性细胞浸润，胰腺实质点状、凝固状坏死。③72 h胰腺大片凝固坏死，结构模糊，炎性细胞浸润。
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3 讨论
TNF-α是一种重要的调节机体免疫功能和代谢过程的多功能细胞因子，除了对肿瘤细胞具有抑制生长和细胞毒作用外，还可影响其他细胞的生长分化[2]。TNF-α的作用与其在组织中的水平有关，低水平的TNF-α在组织修复炎症应答中发挥作用，对机体有利；而大量的TNF-α释放(浓度≥10-8mol/L)可导致机体消耗增加，组织严重损伤，微血管内凝血，心脏抑制及低血压[3]。
肿瘤坏死因子(TNF-α)被认为既可直接诱导血管内皮细胞的通透性增加，也可间接通过白细胞发挥作用[4]。TNF-α可促进炎症区白细胞的积聚和激活，激活的白细胞在TNF-α作用下可释放几种增强毛细血管通透性的细胞介质，这些介质包括血小板活化因子(PAP)，白三烯B4(LTB4)，一氧化氮(NO)，血栓素A2(TXA2)，前列腺素(PG)，氧自由基等。TNF-α可刺激磷脂酶A2的分化，也可直接激活磷脂酶A2。TNF-α对血管内皮的粘附分子如ELAM-1和ICAM-1有向上调节作用，粘附分子向上调节可促进白细胞的粘附和收缩，造成毛细血管渗漏和组织损害。
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TNF-α拮抗剂为临床治疗急性胰腺炎提供线索。①抗肿瘤坏死因子抗体[5]。②抗肿瘤坏死因子受体抗体。③可溶性肿瘤坏死因子受体(STNFR)[6]。④抑制或减少TNF-α的合成与释放[7]。
本研究结果表明B、C、D三组TNF-α较A组明显升高(P<0.05)。B、C二组比较(P<0.05)说明TNF-α对急性胰腺炎起促进作用，加重胰腺的病理改变。B组、D组比较(P<0.05)说明抗TNF-α在急性胰腺炎发展过程中起拮抗作用，阻断TNF-α能减轻胰腺病理损害。由此证明TNF-α在急性胰腺炎的发病过程中起重要的介导作用。
参考文献
[1]Lerch MM,Adler G.Expreimental animal models of acute pancreatitis[J].Inter J Pancreat,1994,15:159-170.
, 百拇医药
[2]吕洪光，薛东波.急性胰腺炎发病过程中肿瘤坏死因子作用的研究进展[J].中国急救医学，1999，19(6)：383-384.
[3]Wilson PG,Manji M,Neoptolemos JP,et al.Acute pancreatitis as a model of sepsis[J]. J Antimicrob Chemother,1998,41(Suppl A):51-63.
[4]Exley AR,Lecse T,Holliday MP.Endotoxaemia and serum tumour necrosis factor as prognostic marker in severe acute pancreatitis[J].Gut,1992,33:1126-8.
[5]Grewal HP,Din AM,Gaber L,et al.Amelioration of physiologic and biochomical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF polyclonal antibody[J]. Am J Sursery,1994,167:214-219.
, 百拇医药
[6]Dinarello CA,Gelfand JA,Wolff SM.Anticytokine strategies in the treatment of the systemic in flummatory resportse syndrome[J].JAMA, 1993,269:1829-34.
[7]Lazar G,Varga J,Lazar G,et al.The effects of glucocorticoids and a glucocorticoids antgonist(RU 38486) on experimental acute pancreatitis in rats[J].Acta Chir Hung,1997,36(1-4):190-1.
收稿：1999-03-26, http://www.100md.com