ARDS患者肺组织Bax和Bcl-2表达的变化及意义
作者：宋勇 毛宝龄 王建春 钱桂生 陈正堂 徐剑铖 夏锡荣
单位：宋勇 夏锡荣 南京军医南京总医院呼吸内科，210002；毛宝龄 王建春 钱桂生 陈正堂 徐剑铖 第三军医大学新桥医院解放军呼吸病研究所
关键词：急性呼吸窘迫综合征；Bcl-2；Bax；细胞凋亡；肺
中国急救医学991003 摘要 目的 探讨Bax和Bcl-2表达的变化在ARDS发病中的作用，试图为进一步阐明ARDS的发病机制和在细胞凋亡水平防治本病提供理论依据。方法 ARDS组9例，对照组5例，采用TUNEL法以及免疫组化技术观察ARDS患者肺组织细胞凋亡及Bax和Bcl-2表达的变化。结果 ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡率较对照组明显增加，且主要表现为肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡增加；Bcl-2表达ARDS组和对照组无显著差异，Bax在ARDS急性期患者肺组织表达明显上调，并且Bax表达的增加与肺组织细胞凋亡增加呈平行关系。结论 肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡改变和Bax/Bcl-2表达的变化可能参与临床ARDS急性期的发病。
, 百拇医药
中图分类号 R 442.8；Q 255 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)10-585-02
significance of apoptosis and Bcl-2，Bax expression in lung tissue in patients with ARDS
SONG Yong, MAO Bao-ling, WANG Jian-chun, et al. Department of Respiratory Medicine, Nan jing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002, China
Abstract Objective To evaluate the effects of apoptosis and expression of apoptotic related genes on acute respiratory distress syndrome (ARDS). Method By using TUNEL、Histopathology and Immunocytochemistry techniques, apoptosis and Bcl-2、Bax protein expression were studied in patients with ARDS in acute stage compared with that in control subjects. Results Apotosis ratio and Bax protein expression was significantly higher in lung tissues in acute stage patiients with ARDS. Conclusions During the acute stage of ARDS, apoptosis of alveolar epithelial cells and pulmonary vascular endothelial cells, and increase of Bax expression may contribute to the pathogenesis of this disease.
, 百拇医药
Key words Acute respiratory distress syndrome； Bcl-2； Bax； Apoptosis；Lung
细胞凋亡已成为许多炎症性疾病研究的新热点。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)作为严重的急性肺损伤(ALI)，是以弥漫性肺泡-毛细血管膜损伤导致的肺水肿和微肺不张为特征[1]。细胞凋亡在ARDS发病过程中的作用如何是今年来受到关注的课题；但迄今尚缺乏这方面的系统研究和全面认识。我们通过观察ARDS患者肺组织Bax和Bcl-2表达的变化，以期进一步探讨细胞凋亡在ARDS发病中的作用及基因调控机制，试图为进一步阐明ARDS的发病机制和在细胞凋亡水平防治本病提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料 (1)ARDS组 9例，其中男6例，女3例，年龄32.3±6.8岁，均符合ARDS诊断标准，且均为急性期死亡患者。肺组织病理切片均来自尸检肺组织蜡块。病因分别为脓毒症4例、创伤2例、SLE 1例、出血性坏死性肠炎1例和急性粟粒性肺结核1例。(2)对照组 肺组织标本取自5例肺癌患者，肺切除后远离癌肿的正常肺组织，其中男4例，女1例，年龄57.3±9.6岁。
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1.2 实验材料
(1)细胞凋亡原位检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)德国Boehringer Mannheim (B.M)公司。
(2)免疫组化染色SP试剂盒，北京中山生物技术有限公司。
(3)兔抗人Bax多克隆抗体(N-20，sc-493)，兔抗人Bcl-2多克隆抗体(N-19，sc-492)，美国Santa Cruz公司(Santa Cruz Biotechnology, Inc)。
1.3 方法
(1)病理观察 尸检肺组织蜡块，切片、常规HE染色后，观察病理改变。
(2)细胞凋亡的原位检测按B.M公司试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)提供方法稍加改进进行。计算方法：计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数。凋亡指数以：凋亡细胞/100个细胞表示，按凋亡细胞占细胞总数的百分率将其分为五级：0：<2%；1：3%～9%；2：10%～19%；3：20%～39%；4：>40%。
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(3)Bcl-2、Bax免疫组化染色步骤，参照试剂盒推荐方法进行。免疫组化对照试验：用正常兔血清或0.01M PBS代替一抗进行ICC染色。结果判断：将免疫组化的结果分为5级；0：为阴性；+：微弱；++：弱阳性；+++：中等阳性；++++：强阳性。
2 结果
2.1 ARDS急性期肺组织细胞凋亡的改变
由表1可以看出，ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡明显增加，凋亡细胞主要见于肺泡上皮、肺血管内皮细胞及部分炎性细胞；病理损害愈严重，细胞凋亡率越高；而对照组肺组织细胞凋亡现象罕见。
表1 ARDS急性期肺组织细胞凋亡的改变 分 组
例 数
细胞凋亡分级
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ARDS组
9
2(2～3)
对照组
5
0(0～1)
2.2 ARDS患者肺组织Bcl-2表达的变化
免疫组化染色结果显示(表2)，ARDS急性期患者肺组织细胞，Bcl-2表达主要见于支气管上皮细胞及淋巴细胞上，ARDS患者肺组织Bcl-2表达与对照组相比无明显差异。表2 ARDS患者肺组织Bcl-2表达的变化 分 组
例 数
支气管上皮
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淋巴细胞
ARDS组
9
+(+～++)
++(+～++)
对照组
5
+(+～++)
++(+～++)
2.3 ARDS患者肺组织Bax表达的变化
结果显示，ARDS急性期患者肺组织Bax表达较对照组明显上调；阳性信号主要分布于支气管、肺泡上皮细胞，间质细胞及炎症细胞上。表3 ARDS患者肺组织Bax表达的变化 分 组
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例 数
肺泡上皮
间质细胞
ARDS组
9
+++(++～+++)
+++(++～+++)
对照组
5
(0～+)
+(0～+)
3 讨论
ARDS时，肺泡-毛细血管膜的广泛损伤所导致的肺水肿和微肺不张是本病发病的病理基础和中心环节。既往认为ARDS时肺泡上皮和肺血管内皮细胞的死亡方式是坏死。随着细胞凋亡在炎症性疾病领域研究的不断深入，人们已开始注意到ARDS患者肺组织细胞可以以细胞凋亡方式出现，并可能在发病中起一定的作用[2，3]。但多数研究都是在体外和动物模型中进行，在ARDS患者肺组织研究和观察细胞凋亡的作用和机制还比较少见。本研究通过对9例ARDS急性期患者的尸检肺组织细胞凋亡进行观察；结果发现，ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡率较对照组明显增加，且主要表现为肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡增加，说明靶细胞凋亡可出现于ARDS病程急性期，提示肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡可能参与ARDS急性期的发病。
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Bcl-2家族蛋白在调节细胞凋亡过程中起重要作用，Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，而Bax作为Bcl-2的同源体，其作用是抑制Bcl-2作用，促进细胞死亡。近年研究还提示，Bcl-2与Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，而且还与Bax/Bcl-2的比率有关，当比率增大，细胞趋于死亡[4]。Guinee等研究发现弥漫性肺泡损伤(DAD)时肺组织BAX表达上调[5]。本研究发现ARDS急性期患者肺组织细胞Bcl-2表达信号较弱，主要见于支气管上皮细胞及淋巴细胞上，与对照组相比无明显差异；而ARDS急性期患者肺组织Bax表达较对照组明显上调；阳性信号主要分布于支气管、肺泡上皮细胞，间质细胞及炎症细胞上。提示Bax表达的变化可能参与ARDS的发病机制。Bax表达增加导致细胞凋亡可能通过以下几种机制实现：(1)Bax与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2作用，还可能抑制Bcl-2家族中如bcl-xL等其它抑制凋亡分子的作用；(2)Bax/Bax同源二聚体的形成；(3)Bax本身具有促进细胞凋亡的作用。TUNEL染色显示ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡以肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞以及部分炎性细胞为著，而在这些细胞，促进细胞凋亡的Bax表达明显上升反映细胞凋亡的发生与Bax表达变化一致性。Krajewski[6]采用TUNEL与免疫细胞化学双染观察到TUNEL染色较强的细胞Bax含量也较高，反映出Bax与细胞凋亡的关系。但Bcl-2、Bax并非此种病理过程中细胞死亡的唯一通路。已有研究证明，Fas/FasL系统、TNFα、以及p53基因在全身失控性炎症反应过程中，也可能调控细胞凋亡、参与其靶细胞受损过程[7～9]，说明ARDS时，肺组织细胞凋亡的机制复杂、影响因素多。对ARDS时细胞凋亡的深入研究不仅有助于从分子水平揭示ARDS时细胞凋亡的基因调控机制，促进对本病发病机制的进一步认识，而且可能为从细胞凋亡通路入手防治ARDS提供新的思路和手段。(本课题在第三军医大学解放军呼吸病研究所完成)。
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参考文献
[1]Hanley ME, Repine JE. Pathogenetic aspects of the adult respiratory distress syndrome[J]. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine, 1994,15:260-270.
[2]Bingisser R, Stey C, Weller M, et al. Apoptosis in human alveolar macrophage is induced by endotoxin is modulated by cytokines[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996, 15:64-70.
[3]Bardales Rh, Xie SS, Schaefer RF, et al. Apoptosis is a major pathway responsible for the resolution of type Ⅱ pneumocytes in acute lung injury[J]. Am J Pathol, 1996, 149(3):845-852.
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[4]Oltvai ZN, Milliman CL, Kormeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a onserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death[J]. Cell, 1993, 74(4)604-609.
[5]Guinee D, Brambilla M, Fleming M, et a. The potential role of Bax and Bcl-2 expression n diffuse alveolar damage[J]. Am J Pathol, 1997,151:999-1007.
[6]Krajewski S, Mai JK, Krajewski M, et al. Upregulatoin of Bax protein levels in neurons following cerebral ischemia[J]. J Neurosci, 1995;15(10):6359-6364.
, 百拇医药
[7]Nomoto Y, Kuwano K, hagimoto N, et al. Apoptosis and Fas/Fas ligand mRNA expression in acute immune complex alveolitis in mice[J]. Eur Respir J, 1997,10:2351-2359.
[8]Hiramatsu M, Hotchkiss RS, Karl IE, et al. Cecal ligation and puncture (CLP) induces apoptosis in thymus, spleen lung, and gut by and endotoxin and TNF-independent pathway[J]. Shock, 1997,7:247-253.
[9]Cuinee D, Fleming M, Hayashi T, et al. Association of P53 and WAF1 expression with apoptosis in diffuse alveolar damage[J]. Am J Pathol, 1996,149:531-538.
收稿：1999-06-25, 百拇医药
单位：宋勇 夏锡荣 南京军医南京总医院呼吸内科，210002；毛宝龄 王建春 钱桂生 陈正堂 徐剑铖 第三军医大学新桥医院解放军呼吸病研究所
关键词：急性呼吸窘迫综合征；Bcl-2；Bax；细胞凋亡；肺
中国急救医学991003 摘要 目的 探讨Bax和Bcl-2表达的变化在ARDS发病中的作用，试图为进一步阐明ARDS的发病机制和在细胞凋亡水平防治本病提供理论依据。方法 ARDS组9例，对照组5例，采用TUNEL法以及免疫组化技术观察ARDS患者肺组织细胞凋亡及Bax和Bcl-2表达的变化。结果 ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡率较对照组明显增加，且主要表现为肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡增加；Bcl-2表达ARDS组和对照组无显著差异，Bax在ARDS急性期患者肺组织表达明显上调，并且Bax表达的增加与肺组织细胞凋亡增加呈平行关系。结论 肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡改变和Bax/Bcl-2表达的变化可能参与临床ARDS急性期的发病。
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中图分类号 R 442.8；Q 255 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)10-585-02
significance of apoptosis and Bcl-2，Bax expression in lung tissue in patients with ARDS
SONG Yong, MAO Bao-ling, WANG Jian-chun, et al. Department of Respiratory Medicine, Nan jing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002, China
Abstract Objective To evaluate the effects of apoptosis and expression of apoptotic related genes on acute respiratory distress syndrome (ARDS). Method By using TUNEL、Histopathology and Immunocytochemistry techniques, apoptosis and Bcl-2、Bax protein expression were studied in patients with ARDS in acute stage compared with that in control subjects. Results Apotosis ratio and Bax protein expression was significantly higher in lung tissues in acute stage patiients with ARDS. Conclusions During the acute stage of ARDS, apoptosis of alveolar epithelial cells and pulmonary vascular endothelial cells, and increase of Bax expression may contribute to the pathogenesis of this disease.
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Key words Acute respiratory distress syndrome； Bcl-2； Bax； Apoptosis；Lung
细胞凋亡已成为许多炎症性疾病研究的新热点。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)作为严重的急性肺损伤(ALI)，是以弥漫性肺泡-毛细血管膜损伤导致的肺水肿和微肺不张为特征[1]。细胞凋亡在ARDS发病过程中的作用如何是今年来受到关注的课题；但迄今尚缺乏这方面的系统研究和全面认识。我们通过观察ARDS患者肺组织Bax和Bcl-2表达的变化，以期进一步探讨细胞凋亡在ARDS发病中的作用及基因调控机制，试图为进一步阐明ARDS的发病机制和在细胞凋亡水平防治本病提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料 (1)ARDS组 9例，其中男6例，女3例，年龄32.3±6.8岁，均符合ARDS诊断标准，且均为急性期死亡患者。肺组织病理切片均来自尸检肺组织蜡块。病因分别为脓毒症4例、创伤2例、SLE 1例、出血性坏死性肠炎1例和急性粟粒性肺结核1例。(2)对照组 肺组织标本取自5例肺癌患者，肺切除后远离癌肿的正常肺组织，其中男4例，女1例，年龄57.3±9.6岁。
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1.2 实验材料
(1)细胞凋亡原位检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)德国Boehringer Mannheim (B.M)公司。
(2)免疫组化染色SP试剂盒，北京中山生物技术有限公司。
(3)兔抗人Bax多克隆抗体(N-20，sc-493)，兔抗人Bcl-2多克隆抗体(N-19，sc-492)，美国Santa Cruz公司(Santa Cruz Biotechnology, Inc)。
1.3 方法
(1)病理观察 尸检肺组织蜡块，切片、常规HE染色后，观察病理改变。
(2)细胞凋亡的原位检测按B.M公司试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)提供方法稍加改进进行。计算方法：计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数。凋亡指数以：凋亡细胞/100个细胞表示，按凋亡细胞占细胞总数的百分率将其分为五级：0：<2%；1：3%～9%；2：10%～19%；3：20%～39%；4：>40%。
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(3)Bcl-2、Bax免疫组化染色步骤，参照试剂盒推荐方法进行。免疫组化对照试验：用正常兔血清或0.01M PBS代替一抗进行ICC染色。结果判断：将免疫组化的结果分为5级；0：为阴性；+：微弱；++：弱阳性；+++：中等阳性；++++：强阳性。
2 结果
2.1 ARDS急性期肺组织细胞凋亡的改变
由表1可以看出，ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡明显增加，凋亡细胞主要见于肺泡上皮、肺血管内皮细胞及部分炎性细胞；病理损害愈严重，细胞凋亡率越高；而对照组肺组织细胞凋亡现象罕见。
表1 ARDS急性期肺组织细胞凋亡的改变 分 组
例 数
细胞凋亡分级
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ARDS组
9
2(2～3)
对照组
5
0(0～1)
2.2 ARDS患者肺组织Bcl-2表达的变化
免疫组化染色结果显示(表2)，ARDS急性期患者肺组织细胞，Bcl-2表达主要见于支气管上皮细胞及淋巴细胞上，ARDS患者肺组织Bcl-2表达与对照组相比无明显差异。表2 ARDS患者肺组织Bcl-2表达的变化 分 组
例 数
支气管上皮
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淋巴细胞
ARDS组
9
+(+～++)
++(+～++)
对照组
5
+(+～++)
++(+～++)
2.3 ARDS患者肺组织Bax表达的变化
结果显示，ARDS急性期患者肺组织Bax表达较对照组明显上调；阳性信号主要分布于支气管、肺泡上皮细胞，间质细胞及炎症细胞上。表3 ARDS患者肺组织Bax表达的变化 分 组
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例 数
肺泡上皮
间质细胞
ARDS组
9
+++(++～+++)
+++(++～+++)
对照组
5
(0～+)
+(0～+)
3 讨论
ARDS时，肺泡-毛细血管膜的广泛损伤所导致的肺水肿和微肺不张是本病发病的病理基础和中心环节。既往认为ARDS时肺泡上皮和肺血管内皮细胞的死亡方式是坏死。随着细胞凋亡在炎症性疾病领域研究的不断深入，人们已开始注意到ARDS患者肺组织细胞可以以细胞凋亡方式出现，并可能在发病中起一定的作用[2，3]。但多数研究都是在体外和动物模型中进行，在ARDS患者肺组织研究和观察细胞凋亡的作用和机制还比较少见。本研究通过对9例ARDS急性期患者的尸检肺组织细胞凋亡进行观察；结果发现，ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡率较对照组明显增加，且主要表现为肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡增加，说明靶细胞凋亡可出现于ARDS病程急性期，提示肺泡上皮和肺血管内皮细胞凋亡可能参与ARDS急性期的发病。
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Bcl-2家族蛋白在调节细胞凋亡过程中起重要作用，Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，而Bax作为Bcl-2的同源体，其作用是抑制Bcl-2作用，促进细胞死亡。近年研究还提示，Bcl-2与Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，而且还与Bax/Bcl-2的比率有关，当比率增大，细胞趋于死亡[4]。Guinee等研究发现弥漫性肺泡损伤(DAD)时肺组织BAX表达上调[5]。本研究发现ARDS急性期患者肺组织细胞Bcl-2表达信号较弱，主要见于支气管上皮细胞及淋巴细胞上，与对照组相比无明显差异；而ARDS急性期患者肺组织Bax表达较对照组明显上调；阳性信号主要分布于支气管、肺泡上皮细胞，间质细胞及炎症细胞上。提示Bax表达的变化可能参与ARDS的发病机制。Bax表达增加导致细胞凋亡可能通过以下几种机制实现：(1)Bax与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2作用，还可能抑制Bcl-2家族中如bcl-xL等其它抑制凋亡分子的作用；(2)Bax/Bax同源二聚体的形成；(3)Bax本身具有促进细胞凋亡的作用。TUNEL染色显示ARDS急性期患者肺组织细胞凋亡以肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞以及部分炎性细胞为著，而在这些细胞，促进细胞凋亡的Bax表达明显上升反映细胞凋亡的发生与Bax表达变化一致性。Krajewski[6]采用TUNEL与免疫细胞化学双染观察到TUNEL染色较强的细胞Bax含量也较高，反映出Bax与细胞凋亡的关系。但Bcl-2、Bax并非此种病理过程中细胞死亡的唯一通路。已有研究证明，Fas/FasL系统、TNFα、以及p53基因在全身失控性炎症反应过程中，也可能调控细胞凋亡、参与其靶细胞受损过程[7～9]，说明ARDS时，肺组织细胞凋亡的机制复杂、影响因素多。对ARDS时细胞凋亡的深入研究不仅有助于从分子水平揭示ARDS时细胞凋亡的基因调控机制，促进对本病发病机制的进一步认识，而且可能为从细胞凋亡通路入手防治ARDS提供新的思路和手段。(本课题在第三军医大学解放军呼吸病研究所完成)。
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参考文献
[1]Hanley ME, Repine JE. Pathogenetic aspects of the adult respiratory distress syndrome[J]. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine, 1994,15:260-270.
[2]Bingisser R, Stey C, Weller M, et al. Apoptosis in human alveolar macrophage is induced by endotoxin is modulated by cytokines[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996, 15:64-70.
[3]Bardales Rh, Xie SS, Schaefer RF, et al. Apoptosis is a major pathway responsible for the resolution of type Ⅱ pneumocytes in acute lung injury[J]. Am J Pathol, 1996, 149(3):845-852.
, http://www.100md.com
[4]Oltvai ZN, Milliman CL, Kormeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a onserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death[J]. Cell, 1993, 74(4)604-609.
[5]Guinee D, Brambilla M, Fleming M, et a. The potential role of Bax and Bcl-2 expression n diffuse alveolar damage[J]. Am J Pathol, 1997,151:999-1007.
[6]Krajewski S, Mai JK, Krajewski M, et al. Upregulatoin of Bax protein levels in neurons following cerebral ischemia[J]. J Neurosci, 1995;15(10):6359-6364.
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[7]Nomoto Y, Kuwano K, hagimoto N, et al. Apoptosis and Fas/Fas ligand mRNA expression in acute immune complex alveolitis in mice[J]. Eur Respir J, 1997,10:2351-2359.
[8]Hiramatsu M, Hotchkiss RS, Karl IE, et al. Cecal ligation and puncture (CLP) induces apoptosis in thymus, spleen lung, and gut by and endotoxin and TNF-independent pathway[J]. Shock, 1997,7:247-253.
[9]Cuinee D, Fleming M, Hayashi T, et al. Association of P53 and WAF1 expression with apoptosis in diffuse alveolar damage[J]. Am J Pathol, 1996,149:531-538.
收稿：1999-06-25, 百拇医药