实验性急性心肌梗塞心肌细胞凋亡的研究
作者：马中富 马虹 叶任高 罗斌 朱全胜
单位：马中富 中山医科大学附一院急诊科，广州 510080；马虹 心内科 叶任高 肾内科 罗斌 法医教研室 朱全胜 病理教研室
关键词：细胞凋亡；急性心肌梗塞；兔
中国急救医学991001 摘要 目的 为探讨细胞凋亡在急性心肌梗塞时心肌细胞中的意义。方法 用末端原位标记(TUNEL)法、DNA电泳和电镜三种方法检测兔急性心梗模型中梗塞区心肌细胞的凋亡。结果 TUNEL法发现：兔急性心梗模型中梗塞区心肌细胞凋亡千分率在冠脉结扎前(0h)和结扎后1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h的改变如下：0h组(31.00±14.00‰)和12 h组(68.00±31.72‰)<1 h组(142.33±53.52‰)<2 h组(370.83±66.01‰和8 h组(321.17±86.43‰)<3 h组(586.83±55.02‰)<4 h组(836.17±43.73‰)(P均<0.05)，即急性心梗心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后1 h时开始逐渐增多，到4 h时达高峰，其后逐渐下降，到12 h时已逐渐降至正常。DNA梯形电泳显示在兔冠脉结扎后3 h、4 h、6 h时梗塞区的心肌细胞均出现相差约180～200 bp的DNA阶梯(Ladder)，而其它各时间点的心肌细胞未见有相差约180～200 bp的DNA条带。电镜观察显示在兔冠脉结扎后梗塞区内的心肌细胞核膜完整、染色质浓集、电子密度增加的凋亡特征，有的则出现核膜破裂、染色质溶解成碎屑的坏死现象。结论 兔冠脉在结扎3～6 h时梗塞的心肌细胞凋亡特征最明显，细胞凋亡在急性心梗心肌细胞死亡中起重要作用。
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中图分类号 R 542.22；Q 255 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)-577-04
Study of myocyte apoptosis in sudden death with acute myocardial infarction
MA Zhong-fu, MA Hong, YE Ren-gao, et al.
First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China
Abstract Objective To explore the significances of myocyte apoptosis in acute myocardial infarction(AMI). Methods Myocyte apoptosis in AMI rabbit model was studied by TdT-Mediated dUTP Nick End Labling(TUNEL), DNA laddering on agarose gel electrophoresis and electron microscope. Results In the AMI rabbit model, TUNEL methlod showed that the permillage of apoptotic myocytes in infarct area at 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h after coronary artery occlusion and before coronary artery occlusion(Oh) were: Oh group (31.00±14.00‰) and 12 h group (68.00±31.72‰)<1 h group (142.33±53.52‰)<2 h group (370.83±66.01‰) and 8 h group(321.17±86.43‰)<3 h group (586.83±55.02‰)<4 h group (836.17±43.73‰)(P<0.05), The number of apoptotic myocytes was increased gradually after 1 h occlusion of coronary artery, reaching to the top at the 4th hour, then decreased slowly to normal at the 12th hour. DNA laddering on agarose gel electrophoresis demonstrated that the small molecule DNA fragment (180～200 bp) in myocytes of infarct area was observed at 3 h, 4 h, 6 h after the coronary artery occlusion, but not found at any other times. Electron microscopy showed that characteristics of myocyte apoptosis episodes, including intact nuclear membrane, condensed chromatin and increased electron denes. The others showed broken membrane, chromatin dissolved into pieces, lysed and empited nuclear-characteristics of necrosis. Conclusions These morphologic changes suggest that the apoptotic characteristics of myocytes in the infarct areas are most obvious during 3～6 h after coronary artery occlusion, apoptosis is the important form of myocyte death in AMI.
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Key words Apoptosis； Acute myocardial infarction； Rabbit
细胞凋亡现象早在1951年Glucksmann就已观察到，但直到1972年Kerr等[1]才提出这一概念。随着细胞凋亡研究的深入，人们已发现许多心血管疾病的发生发展均与细胞凋亡有关[2]。传统的观念认为急性心梗时心肌细胞的死亡形式是坏死，可最近研究证实，鼠、兔和人类心肌细胞在经历长时间的缺血或缺血再灌注之后，出现明显的凋亡特征[2～5]。本课题应用夹兔冠脉的急性心梗模型梗塞区的心肌细胞进行研究，以进一步探讨急性心梗时心肌细胞的凋亡现象。
1 资料与方法
1.1 研究对象 取新西兰兔48只，雌雄不分，平均体重2.03±0.51 kg(1.70～2.53 kg)，3%戊巴比妥(1 ml/kg)腹腔内麻醉后、固定于手术台上，常规消毒、铺巾、剪毛、切开颈部皮肤、无菌下行气管切开，插入3号气管插管，固定后接电动呼吸机，常规切开胸骨、心包、暴露出心脏，于左冠状动脉前降支起始下2 mm处结扎，同时结扎第一对角支和右冠状动脉，正常对照组则不结扎(n=6)，检查无出血，逐层关闭胸腔，放一引流条，分别于结扎后1小时(n=6)、2小时(n=6)、3小时(n=6)、4小时(n=6)、6小时(n=6)、8小时(n=6)、12小时(n=6)处死兔，打开胸腔，切取心脏，放于无菌的生理盐水碗中，立即取下1 mm3的梗塞组织4～5块，置于2.5%戊二醛中固定以送电镜，再取一半梗塞组织置于10%的甲醛液中固定，以做免疫组化及HE染色，另一半立即置-70℃冰箱下冷藏用做分子生物学实验。
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1.2 方法
1.2.1 苏木素-伊红(HE)染色 10%甲醛液中固定的组织于48～72小时内行石蜡包埋、切片4～5 μm厚，脱蜡后常规HE染色，见急性心肌细胞梗塞灶内及周围白细胞浸润和正常的心肌组织，如图1。
图1 正常的心肌细胞，HE×100(左)
图1 梗塞灶内心肌纤维肌浆溶解，横纹消失，HE×200(右)
1.2.2 急性心梗心肌细胞凋亡原位末端标记检测(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling，TUNEL)法In Site Cell Death Kit, AP(购自德国Bochringer Mannheim)，按药盒说明书操作。①固定、包埋、切片；②脱蜡；③消化膜蛋白及核蛋白；④加反应混合物；⑤加入抗荧光抗体；⑥加入底物(底物混合液：45 μl NBT+35 μl X-Phosphate，溶于10 ml缓冲液中，pH8.1，现配现用)显色10分钟。⑦复染封片。
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1.2.3 心肌细胞DNA电泳 取梗塞心肌块约1 g，用重蒸酚-氯仿法抽提DNA，用70%的乙醇冲洗后，真空抽干，干燥后加入0.1～0.2 ml TE液溶解DNA，于2%的琼脂糖凝胶电泳，在10 v/cm电压下电泳，观察其条带。
1.2.4 凋亡的心肌细胞电镜检测 取2.5%戊二醛前固定的标本，1%锇酸进行后固定，环氧树脂渗透后包埋，60℃高温聚合，用LKB超薄切片(厚度600～900A°)，用200目铜网捞片，用铀铅染液染色，H-60透射电镜观察并拍片。
1.3 统计方法 数值用x±s表示，数值用SPSS 6.0软件计算，结果之间的比较用单因素方差分析(One-way ANOVA Analysis)中的Student-Newman-Keuls Test, 两两比较用Q检验；两指标间相关性用简单相关及直线回归，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
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2.1 TUNEL法检测急性心梗心肌细胞凋亡的结果
本研究用TUNEL法分别对兔冠脉结扎前后不同时间点的心肌细胞凋亡进行了检测，凋亡的心肌细胞由于存在染色质DNA的断裂，在末端核苷酸转移酶的作用下，荧光素标记的核苷酸连接到断裂的DNA 3′-羟基末端，若在荧光显微镜下，可观察到细胞核内发出绿色的荧光，当加入抗荧光素抗体孵育后，再用X-Phosphorate和NBT显色时，凋亡的细胞核呈现出紫兰色，见图2。在每张玻片上，分别随机选择10个区域，每个区域计数100个细胞，统计出凋亡的细胞数，然后加在一起，即为每千个心肌细胞中的凋亡细胞数，结果见表1。从表1中可知，急性心梗心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后3 h、4 h、6 h组明显高于其它各时间点及冠脉未结扎组(P均<0.05)，而结扎后4 h、6 h组心肌细胞凋亡数明显高于3 h组(P均<0.05)，4 h组的心肌细胞凋亡数又明显高于6 h组(P<0.05)，2 h和8 h组的心肌细胞凋亡数明显高于1 h组(P均<0.05)，结扎后1 h组的凋亡心肌细胞又比结扎后12 h组和未结扎组高(P均<0.05)。提示急性心梗心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后1 h时开始逐渐增多，到4 h时达最高峰，其后逐渐下降，到12 h时已逐渐降至正常，即Oh、12 h<1 h<2 h、8 h<3 h<6 h<4 h(P均<0.05)。
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图2 凋亡的心肌细胞核被标记，染色成紫蓝色，TUNEL法
表1 TUNEL法检测冠脉结扎后不同时间点和正常对照凋亡的心肌细胞千分率(x±s) 小时数(h)
例 数
凋亡的心肌细胞千分率(‰)
范 围
0
6
31.00±14.00
15～50
1
6
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42.33±53.52*
77～209
2
6
70.83±66.01*△
244～430
3
6
86.83±55.02*△□
501～655
4
6
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36.17±43.73*△□○▲
789～901
6
6
58.00±58.56*△□○
569～731
8
6
21.17±86.43*△
189～407
12
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68.00±31.72
33～109
方差分析示F=171.9187，P=0.0000 注：0小时指未结扎冠脉的正常对照组，Q检验示：*与Oh和12 h组比较，P<0.05 △与1 h组比较，P<0.05 □与2 h和8 h组比较，P<0.05 ○与3 h组比较，P<0.05 ▲与6 h组比较，P<0.05。
2.2 急性心梗心肌细胞DNA片段电泳的分析 凋亡细胞核小体连接区在核酸内切酶的作用下断裂产生相差约180～200 bp片段，在电泳图上可形成梯形条带。冠脉结扎后不同时间点的心肌细胞DNA电泳显示，在冠脉结扎后3 h、4 h和6 h均出现相差约180～200 bp的DNA阶梯。而正常对照组和冠脉结扎后1 h、2 h、8 h、12 h的心肌细胞均未见到有相差约180～200 bp的DNA条带，见图3。
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图3 急性心梗猝死者梗塞区心肌细胞内DNA电泳
2.3 凋亡的心肌细胞电镜观察结果 在冠脉结扎后心肌缺血的早期即1～3 h阶段，与未结扎冠脉的心肌细胞(即正常心肌细胞，见图4)相比，可见到缺血的心肌细胞膜完整，胞浆稍有浓缩，胞核体积缩小，核出现固缩，染色质开始边聚，核膜完整，整个细胞的电子密度增加。但由于组织块固定较差，为了清洗组织块上的血迹在生理盐水中放置时间过长，胞浆有些自溶现象，见图5。冠脉结扎后第4 h、6 h时，心肌细胞染色质更加凝结成致密的块状，往核膜下聚集、边聚，但核膜仍然完整，电子密度增加，结构模精不清，具有凋亡核的特征，见图6。冠脉结扎后第8～12 h时，心肌细胞则出现肿胀，坏死，胞浆内容物溶解、空泡变、核膜破裂、染色质溶解成碎屑、胞核明显空泡变、整个细胞崩解破碎，见图7。(图1～7见插Ⅳ)。
图4 正常的心肌细胞EM×6782
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图5 急性心梗猝死者梗塞区，早期凋亡的心肌细胞，见核固缩，染色质浓缩，凝聚于核膜下核膜完整，EM×6250
图6 凋亡晚期的心肌细胞核，见核更加固缩，电子密度增加，染色质凝聚，胞浆内出现空泡，EM×6244
图7 继发性坏死的心肌细胞：凋亡晚期的心肌细胞核见染色质浓缩，凝聚于核膜下，核出现空泡，EM×6922
3 讨论
以往的观念认为急性心肌梗塞时，心肌细胞死亡是坏死，可是近来的研究表明，鼠、兔和人类的心肌细胞在经历长时间的缺血缺氧或缺血再灌注后，出现明显的凋亡特征[2～5]。Takemura等[3]在兔的急性心梗和再灌注的模型中发现：心肌细胞缺血30分钟后再灌注2小时、4小时和24小时，均可出现TUNEL阳性的心肌细胞，DNA电泳可出现特异性的相差约180～200 bp DNA片段；但作者没有发现有电镜下的心肌细胞凋亡现象。Cheng等[4]在急性心梗鼠的模型中发现，心肌细胞凋亡数，从冠脉结扎后3～12小时起逐渐增加，到1～2小时达最高，到第7天逐渐降低，到14天、1个月时维持在一个稳定的水平；与此同时，DNA电泳发现DNA阶梯出现在冠脉结扎后1天的鼠心肌细胞中，且以梗塞区及邻近区更明显。Kajstura等[5]研究认为，细胞凋亡是AMI时6小时内心肌损伤的主要死亡形式，而细胞坏死是随后发生的现象。
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本研究在结扎兔冠脉的急性心梗模型中发现，梗塞区心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后1小时即开始升高，到4小时达高峰，维持1～2小时后逐渐下降，到12小时已降至正常；而DNA电泳发现在兔冠脉结扎后3小时、4小时和6小时均出现明显的DNA阶梯。以上结果与TUNEL法观察到的结果一致。同时电镜下亦同步发现：在冠脉结扎后2～3小时内即可见到心肌细胞核体积缩小、出现固缩、染色质开始边聚、核膜完整、整个细胞的电子密度增加的早期凋亡现象，结扎后4～6小时时，心肌细胞染色质成碎片，更加凝结成致密的块状，往核膜下聚集电子密度更加增加，结构模糊不清，但核膜完整，胞浆有水肿。到结扎后8～12小时心肌细胞出现核膜破裂，染色质溶解成碎屑，核明显空泡变，整个细胞破碎、崩解。这些变化与TUNEL法检测到的结果及与上述作者观察到的结果相似，提示兔冠脉结扎后细胞凋亡在急性心梗心肌细胞的损伤中起着重要的作用。
大量研究表明，细胞凋亡亦可由能引起细胞坏死的因素引起[1，2]，心肌细胞在急性缺血、缺氧后，氧自由基及氧化剂产生增加、NO合成下降、致使细胞内钙增加，胞内致密颗粒排空、激活胞内酶，而启动细胞凋亡的发生[1～6]。急性心肌缺血导致细胞凋亡还有下述理论：引起心肌细胞内磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺产生增加，激活核内酶，致使染色质被切片成180～200 bp的片段[7]；引起心肌细胞内神经酰胺含量增加，通过激活神经酰胺激活的蛋白激酶、原癌基因Vav、蛋白磷酸酶、蛋白激酶C及其同工酶、核因子-κB等来启动细胞凋亡[8]；通过诱发心肌细胞核内原癌基因c-fos和c-jun的表达，促使热休克蛋白70(HSP 70)基因表达，而导致DNA的断裂，诱发心肌细胞调亡[8]；通过诱发机体内细胞因子如TNF、IL-1，3，4，10、生长因子β1(TGF-β1)、纤维细胞生长因子、甲状腺素、Ⅱ型胶原的分泌增加，而促使心肌细胞的核染色质发生特异性断裂，促使心肌细胞凋亡[10]。
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TUNEL法1992年被Gavrieli等[11]提出并应用于检测凋亡细胞，虽然它不能区分凋亡特异性的DNA降解和坏死非特异性的DNA降解，但它的确能帮助识别细胞死亡及在组织中的分布。目前认为它主要用于原位检测核内染色质的断裂和双链DNA被生物素标记后，特异性地用于检测凋亡的细胞。且DNA的裂解出现在形态学改变之前，故TUNEL法现已广泛用于检测细胞凋亡[1，4～6，11]。本文在结扎冠脉后兔生心梗模型的心肌细胞中，用TUNEL法检测到大量的阳性细胞，提示急性缺血的心肌细胞的确存在DNA特异性裂解，加上DNA梯形电泳及电镜检查结果，说明急性缺血的心肌细胞存在明显凋亡现象。
凋亡的心肌细胞核中染色质DNA的裂解主要归因于唯一的核酸内切酶的作用，它可特异性地将染色质DNA切割成相差约180～200 bp的片段或它的倍数片段，用琼脂糖凝胶电泳可检测到细胞核的抽提物，典型者表现为“DNA梯形或带级”构型，也是目前应用广泛且特异性检测细胞凋亡的方法之一[1，2，4～6，11]。本文结果显示，兔急性心梗模型中梗塞区的心肌细胞可不同程度地见到特异性DNA梯形条带，进一步说明急性心梗时心肌细胞存在凋亡。
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本研究中电子显微镜下同样观察到了心肌细胞不同程度的核体积缩小、染色体固缩、边聚、电子密度增加、核膜完整的凋亡特征，但未能见到细胞凋亡的典型电镜下改变—凋亡小体，可能原因如下：在急性心梗的早期凋亡小体仍未能在心肌细胞中形成；在缺血的后期梗塞灶激活了炎症细胞，引起多形核白细胞或吞噬细胞粘附和吞噬，在清除坏死组织的同时也清除了有凋亡小体的细胞；在急性心梗时心肌细胞凋亡仅部分激活，不足以形成凋亡小体的；另外电镜检测时组织块小，未能切到有凋亡小体的心肌细胞。
综上所述，在急性心梗模型的心肌细胞死亡中凋亡与坏死两者同时存在，缺血期6 h内以心肌凋亡为主，而8 h后以心肌坏死为主。
基金来源:卫生部基金赞助(1996-1-116)
作者简介:马中富，男，副主任医师，博士，硕士导师
参考文献
, 百拇医药
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[3]Takemura G, Ohno M, Fujiwara H. Ischemic heart disease and apoptosis[J]. Rinsho Byori, 1997, 45(7): 606-13.
[4]Cheng W, Kajstura J, Nitahara JA, et al. Programmed myocyte cell death affects the viable myocardium after infarction in rats[J]. Exp Cell Res, 1996, 226(2): 316-27.
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[11]Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation[J]. J Cell Biol, 1992, 119: 493-501.
收稿：1999-09-27, 百拇医药
单位：马中富 中山医科大学附一院急诊科，广州 510080；马虹 心内科 叶任高 肾内科 罗斌 法医教研室 朱全胜 病理教研室
关键词：细胞凋亡；急性心肌梗塞；兔
中国急救医学991001 摘要 目的 为探讨细胞凋亡在急性心肌梗塞时心肌细胞中的意义。方法 用末端原位标记(TUNEL)法、DNA电泳和电镜三种方法检测兔急性心梗模型中梗塞区心肌细胞的凋亡。结果 TUNEL法发现：兔急性心梗模型中梗塞区心肌细胞凋亡千分率在冠脉结扎前(0h)和结扎后1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h的改变如下：0h组(31.00±14.00‰)和12 h组(68.00±31.72‰)<1 h组(142.33±53.52‰)<2 h组(370.83±66.01‰和8 h组(321.17±86.43‰)<3 h组(586.83±55.02‰)<4 h组(836.17±43.73‰)(P均<0.05)，即急性心梗心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后1 h时开始逐渐增多，到4 h时达高峰，其后逐渐下降，到12 h时已逐渐降至正常。DNA梯形电泳显示在兔冠脉结扎后3 h、4 h、6 h时梗塞区的心肌细胞均出现相差约180～200 bp的DNA阶梯(Ladder)，而其它各时间点的心肌细胞未见有相差约180～200 bp的DNA条带。电镜观察显示在兔冠脉结扎后梗塞区内的心肌细胞核膜完整、染色质浓集、电子密度增加的凋亡特征，有的则出现核膜破裂、染色质溶解成碎屑的坏死现象。结论 兔冠脉在结扎3～6 h时梗塞的心肌细胞凋亡特征最明显，细胞凋亡在急性心梗心肌细胞死亡中起重要作用。
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中图分类号 R 542.22；Q 255 文献标识码 A 文章编号 1002-1949(1999)-577-04
Study of myocyte apoptosis in sudden death with acute myocardial infarction
MA Zhong-fu, MA Hong, YE Ren-gao, et al.
First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China
Abstract Objective To explore the significances of myocyte apoptosis in acute myocardial infarction(AMI). Methods Myocyte apoptosis in AMI rabbit model was studied by TdT-Mediated dUTP Nick End Labling(TUNEL), DNA laddering on agarose gel electrophoresis and electron microscope. Results In the AMI rabbit model, TUNEL methlod showed that the permillage of apoptotic myocytes in infarct area at 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h after coronary artery occlusion and before coronary artery occlusion(Oh) were: Oh group (31.00±14.00‰) and 12 h group (68.00±31.72‰)<1 h group (142.33±53.52‰)<2 h group (370.83±66.01‰) and 8 h group(321.17±86.43‰)<3 h group (586.83±55.02‰)<4 h group (836.17±43.73‰)(P<0.05), The number of apoptotic myocytes was increased gradually after 1 h occlusion of coronary artery, reaching to the top at the 4th hour, then decreased slowly to normal at the 12th hour. DNA laddering on agarose gel electrophoresis demonstrated that the small molecule DNA fragment (180～200 bp) in myocytes of infarct area was observed at 3 h, 4 h, 6 h after the coronary artery occlusion, but not found at any other times. Electron microscopy showed that characteristics of myocyte apoptosis episodes, including intact nuclear membrane, condensed chromatin and increased electron denes. The others showed broken membrane, chromatin dissolved into pieces, lysed and empited nuclear-characteristics of necrosis. Conclusions These morphologic changes suggest that the apoptotic characteristics of myocytes in the infarct areas are most obvious during 3～6 h after coronary artery occlusion, apoptosis is the important form of myocyte death in AMI.
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Key words Apoptosis； Acute myocardial infarction； Rabbit
细胞凋亡现象早在1951年Glucksmann就已观察到，但直到1972年Kerr等[1]才提出这一概念。随着细胞凋亡研究的深入，人们已发现许多心血管疾病的发生发展均与细胞凋亡有关[2]。传统的观念认为急性心梗时心肌细胞的死亡形式是坏死，可最近研究证实，鼠、兔和人类心肌细胞在经历长时间的缺血或缺血再灌注之后，出现明显的凋亡特征[2～5]。本课题应用夹兔冠脉的急性心梗模型梗塞区的心肌细胞进行研究，以进一步探讨急性心梗时心肌细胞的凋亡现象。
1 资料与方法
1.1 研究对象 取新西兰兔48只，雌雄不分，平均体重2.03±0.51 kg(1.70～2.53 kg)，3%戊巴比妥(1 ml/kg)腹腔内麻醉后、固定于手术台上，常规消毒、铺巾、剪毛、切开颈部皮肤、无菌下行气管切开，插入3号气管插管，固定后接电动呼吸机，常规切开胸骨、心包、暴露出心脏，于左冠状动脉前降支起始下2 mm处结扎，同时结扎第一对角支和右冠状动脉，正常对照组则不结扎(n=6)，检查无出血，逐层关闭胸腔，放一引流条，分别于结扎后1小时(n=6)、2小时(n=6)、3小时(n=6)、4小时(n=6)、6小时(n=6)、8小时(n=6)、12小时(n=6)处死兔，打开胸腔，切取心脏，放于无菌的生理盐水碗中，立即取下1 mm3的梗塞组织4～5块，置于2.5%戊二醛中固定以送电镜，再取一半梗塞组织置于10%的甲醛液中固定，以做免疫组化及HE染色，另一半立即置-70℃冰箱下冷藏用做分子生物学实验。
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1.2 方法
1.2.1 苏木素-伊红(HE)染色 10%甲醛液中固定的组织于48～72小时内行石蜡包埋、切片4～5 μm厚，脱蜡后常规HE染色，见急性心肌细胞梗塞灶内及周围白细胞浸润和正常的心肌组织，如图1。
图1 正常的心肌细胞，HE×100(左)
图1 梗塞灶内心肌纤维肌浆溶解，横纹消失，HE×200(右)
1.2.2 急性心梗心肌细胞凋亡原位末端标记检测(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling，TUNEL)法In Site Cell Death Kit, AP(购自德国Bochringer Mannheim)，按药盒说明书操作。①固定、包埋、切片；②脱蜡；③消化膜蛋白及核蛋白；④加反应混合物；⑤加入抗荧光抗体；⑥加入底物(底物混合液：45 μl NBT+35 μl X-Phosphate，溶于10 ml缓冲液中，pH8.1，现配现用)显色10分钟。⑦复染封片。
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1.2.3 心肌细胞DNA电泳 取梗塞心肌块约1 g，用重蒸酚-氯仿法抽提DNA，用70%的乙醇冲洗后，真空抽干，干燥后加入0.1～0.2 ml TE液溶解DNA，于2%的琼脂糖凝胶电泳，在10 v/cm电压下电泳，观察其条带。
1.2.4 凋亡的心肌细胞电镜检测 取2.5%戊二醛前固定的标本，1%锇酸进行后固定，环氧树脂渗透后包埋，60℃高温聚合，用LKB超薄切片(厚度600～900A°)，用200目铜网捞片，用铀铅染液染色，H-60透射电镜观察并拍片。
1.3 统计方法 数值用x±s表示，数值用SPSS 6.0软件计算，结果之间的比较用单因素方差分析(One-way ANOVA Analysis)中的Student-Newman-Keuls Test, 两两比较用Q检验；两指标间相关性用简单相关及直线回归，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
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2.1 TUNEL法检测急性心梗心肌细胞凋亡的结果
本研究用TUNEL法分别对兔冠脉结扎前后不同时间点的心肌细胞凋亡进行了检测，凋亡的心肌细胞由于存在染色质DNA的断裂，在末端核苷酸转移酶的作用下，荧光素标记的核苷酸连接到断裂的DNA 3′-羟基末端，若在荧光显微镜下，可观察到细胞核内发出绿色的荧光，当加入抗荧光素抗体孵育后，再用X-Phosphorate和NBT显色时，凋亡的细胞核呈现出紫兰色，见图2。在每张玻片上，分别随机选择10个区域，每个区域计数100个细胞，统计出凋亡的细胞数，然后加在一起，即为每千个心肌细胞中的凋亡细胞数，结果见表1。从表1中可知，急性心梗心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后3 h、4 h、6 h组明显高于其它各时间点及冠脉未结扎组(P均<0.05)，而结扎后4 h、6 h组心肌细胞凋亡数明显高于3 h组(P均<0.05)，4 h组的心肌细胞凋亡数又明显高于6 h组(P<0.05)，2 h和8 h组的心肌细胞凋亡数明显高于1 h组(P均<0.05)，结扎后1 h组的凋亡心肌细胞又比结扎后12 h组和未结扎组高(P均<0.05)。提示急性心梗心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后1 h时开始逐渐增多，到4 h时达最高峰，其后逐渐下降，到12 h时已逐渐降至正常，即Oh、12 h<1 h<2 h、8 h<3 h<6 h<4 h(P均<0.05)。
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图2 凋亡的心肌细胞核被标记，染色成紫蓝色，TUNEL法
表1 TUNEL法检测冠脉结扎后不同时间点和正常对照凋亡的心肌细胞千分率(x±s) 小时数(h)
例 数
凋亡的心肌细胞千分率(‰)
范 围
0
6
31.00±14.00
15～50
1
6
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42.33±53.52*
77～209
2
6
70.83±66.01*△
244～430
3
6
86.83±55.02*△□
501～655
4
6
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36.17±43.73*△□○▲
789～901
6
6
58.00±58.56*△□○
569～731
8
6
21.17±86.43*△
189～407
12
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68.00±31.72
33～109
方差分析示F=171.9187，P=0.0000 注：0小时指未结扎冠脉的正常对照组，Q检验示：*与Oh和12 h组比较，P<0.05 △与1 h组比较，P<0.05 □与2 h和8 h组比较，P<0.05 ○与3 h组比较，P<0.05 ▲与6 h组比较，P<0.05。
2.2 急性心梗心肌细胞DNA片段电泳的分析 凋亡细胞核小体连接区在核酸内切酶的作用下断裂产生相差约180～200 bp片段，在电泳图上可形成梯形条带。冠脉结扎后不同时间点的心肌细胞DNA电泳显示，在冠脉结扎后3 h、4 h和6 h均出现相差约180～200 bp的DNA阶梯。而正常对照组和冠脉结扎后1 h、2 h、8 h、12 h的心肌细胞均未见到有相差约180～200 bp的DNA条带，见图3。
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图3 急性心梗猝死者梗塞区心肌细胞内DNA电泳
2.3 凋亡的心肌细胞电镜观察结果 在冠脉结扎后心肌缺血的早期即1～3 h阶段，与未结扎冠脉的心肌细胞(即正常心肌细胞，见图4)相比，可见到缺血的心肌细胞膜完整，胞浆稍有浓缩，胞核体积缩小，核出现固缩，染色质开始边聚，核膜完整，整个细胞的电子密度增加。但由于组织块固定较差，为了清洗组织块上的血迹在生理盐水中放置时间过长，胞浆有些自溶现象，见图5。冠脉结扎后第4 h、6 h时，心肌细胞染色质更加凝结成致密的块状，往核膜下聚集、边聚，但核膜仍然完整，电子密度增加，结构模精不清，具有凋亡核的特征，见图6。冠脉结扎后第8～12 h时，心肌细胞则出现肿胀，坏死，胞浆内容物溶解、空泡变、核膜破裂、染色质溶解成碎屑、胞核明显空泡变、整个细胞崩解破碎，见图7。(图1～7见插Ⅳ)。
图4 正常的心肌细胞EM×6782
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图5 急性心梗猝死者梗塞区，早期凋亡的心肌细胞，见核固缩，染色质浓缩，凝聚于核膜下核膜完整，EM×6250
图6 凋亡晚期的心肌细胞核，见核更加固缩，电子密度增加，染色质凝聚，胞浆内出现空泡，EM×6244
图7 继发性坏死的心肌细胞：凋亡晚期的心肌细胞核见染色质浓缩，凝聚于核膜下，核出现空泡，EM×6922
3 讨论
以往的观念认为急性心肌梗塞时，心肌细胞死亡是坏死，可是近来的研究表明，鼠、兔和人类的心肌细胞在经历长时间的缺血缺氧或缺血再灌注后，出现明显的凋亡特征[2～5]。Takemura等[3]在兔的急性心梗和再灌注的模型中发现：心肌细胞缺血30分钟后再灌注2小时、4小时和24小时，均可出现TUNEL阳性的心肌细胞，DNA电泳可出现特异性的相差约180～200 bp DNA片段；但作者没有发现有电镜下的心肌细胞凋亡现象。Cheng等[4]在急性心梗鼠的模型中发现，心肌细胞凋亡数，从冠脉结扎后3～12小时起逐渐增加，到1～2小时达最高，到第7天逐渐降低，到14天、1个月时维持在一个稳定的水平；与此同时，DNA电泳发现DNA阶梯出现在冠脉结扎后1天的鼠心肌细胞中，且以梗塞区及邻近区更明显。Kajstura等[5]研究认为，细胞凋亡是AMI时6小时内心肌损伤的主要死亡形式，而细胞坏死是随后发生的现象。
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本研究在结扎兔冠脉的急性心梗模型中发现，梗塞区心肌细胞凋亡数在冠脉结扎后1小时即开始升高，到4小时达高峰，维持1～2小时后逐渐下降，到12小时已降至正常；而DNA电泳发现在兔冠脉结扎后3小时、4小时和6小时均出现明显的DNA阶梯。以上结果与TUNEL法观察到的结果一致。同时电镜下亦同步发现：在冠脉结扎后2～3小时内即可见到心肌细胞核体积缩小、出现固缩、染色质开始边聚、核膜完整、整个细胞的电子密度增加的早期凋亡现象，结扎后4～6小时时，心肌细胞染色质成碎片，更加凝结成致密的块状，往核膜下聚集电子密度更加增加，结构模糊不清，但核膜完整，胞浆有水肿。到结扎后8～12小时心肌细胞出现核膜破裂，染色质溶解成碎屑，核明显空泡变，整个细胞破碎、崩解。这些变化与TUNEL法检测到的结果及与上述作者观察到的结果相似，提示兔冠脉结扎后细胞凋亡在急性心梗心肌细胞的损伤中起着重要的作用。
大量研究表明，细胞凋亡亦可由能引起细胞坏死的因素引起[1，2]，心肌细胞在急性缺血、缺氧后，氧自由基及氧化剂产生增加、NO合成下降、致使细胞内钙增加，胞内致密颗粒排空、激活胞内酶，而启动细胞凋亡的发生[1～6]。急性心肌缺血导致细胞凋亡还有下述理论：引起心肌细胞内磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺产生增加，激活核内酶，致使染色质被切片成180～200 bp的片段[7]；引起心肌细胞内神经酰胺含量增加，通过激活神经酰胺激活的蛋白激酶、原癌基因Vav、蛋白磷酸酶、蛋白激酶C及其同工酶、核因子-κB等来启动细胞凋亡[8]；通过诱发心肌细胞核内原癌基因c-fos和c-jun的表达，促使热休克蛋白70(HSP 70)基因表达，而导致DNA的断裂，诱发心肌细胞调亡[8]；通过诱发机体内细胞因子如TNF、IL-1，3，4，10、生长因子β1(TGF-β1)、纤维细胞生长因子、甲状腺素、Ⅱ型胶原的分泌增加，而促使心肌细胞的核染色质发生特异性断裂，促使心肌细胞凋亡[10]。
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TUNEL法1992年被Gavrieli等[11]提出并应用于检测凋亡细胞，虽然它不能区分凋亡特异性的DNA降解和坏死非特异性的DNA降解，但它的确能帮助识别细胞死亡及在组织中的分布。目前认为它主要用于原位检测核内染色质的断裂和双链DNA被生物素标记后，特异性地用于检测凋亡的细胞。且DNA的裂解出现在形态学改变之前，故TUNEL法现已广泛用于检测细胞凋亡[1，4～6，11]。本文在结扎冠脉后兔生心梗模型的心肌细胞中，用TUNEL法检测到大量的阳性细胞，提示急性缺血的心肌细胞的确存在DNA特异性裂解，加上DNA梯形电泳及电镜检查结果，说明急性缺血的心肌细胞存在明显凋亡现象。
凋亡的心肌细胞核中染色质DNA的裂解主要归因于唯一的核酸内切酶的作用，它可特异性地将染色质DNA切割成相差约180～200 bp的片段或它的倍数片段，用琼脂糖凝胶电泳可检测到细胞核的抽提物，典型者表现为“DNA梯形或带级”构型，也是目前应用广泛且特异性检测细胞凋亡的方法之一[1，2，4～6，11]。本文结果显示，兔急性心梗模型中梗塞区的心肌细胞可不同程度地见到特异性DNA梯形条带，进一步说明急性心梗时心肌细胞存在凋亡。
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本研究中电子显微镜下同样观察到了心肌细胞不同程度的核体积缩小、染色体固缩、边聚、电子密度增加、核膜完整的凋亡特征，但未能见到细胞凋亡的典型电镜下改变—凋亡小体，可能原因如下：在急性心梗的早期凋亡小体仍未能在心肌细胞中形成；在缺血的后期梗塞灶激活了炎症细胞，引起多形核白细胞或吞噬细胞粘附和吞噬，在清除坏死组织的同时也清除了有凋亡小体的细胞；在急性心梗时心肌细胞凋亡仅部分激活，不足以形成凋亡小体的；另外电镜检测时组织块小，未能切到有凋亡小体的心肌细胞。
综上所述，在急性心梗模型的心肌细胞死亡中凋亡与坏死两者同时存在，缺血期6 h内以心肌凋亡为主，而8 h后以心肌坏死为主。
基金来源:卫生部基金赞助(1996-1-116)
作者简介:马中富，男，副主任医师，博士，硕士导师
参考文献
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[2]Hetts SW. To die or not todie: An overview of apoptosis and its role in disease[J]. JAMA, 1998, 279(4): 300-07.
[3]Takemura G, Ohno M, Fujiwara H. Ischemic heart disease and apoptosis[J]. Rinsho Byori, 1997, 45(7): 606-13.
[4]Cheng W, Kajstura J, Nitahara JA, et al. Programmed myocyte cell death affects the viable myocardium after infarction in rats[J]. Exp Cell Res, 1996, 226(2): 316-27.
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收稿：1999-09-27, 百拇医药