Ramos 免疫组织化学技术检测冰冻组织良恶性病变的诊断价值
作者：马大烈 顾广玉 刘昀 吴丽莉 李荣健 张顺民
单位：第二军医大学长海医院病理科，上海，200433
关键词：Ramos法；微波；冰冻超微组织切片术
第二军医大学学报991129 摘要 目的： 探讨Ramos免疫组织化学技术在冰冻快速病理诊断中的应用价值。方法: 应用Ramos免疫组织化学技术对100例冰冻活检组织进行免疫组化标记。结果：Ramos法在冰冻活检组织中有较好的抗原定位及较强的阳性信号，整个检测过程可在10 min内完成。结论：Ramos免疫组织化学技术可应用于冰冻活检诊断，并可能成为其重要的辅助手段。
中图分类号 R 446.8 文献标识码：A
Diagnostic significance of Ramos immunohistochemistry technique for benign or malignant lesions of frozen tissue
, http://www.100md.com
Ma Dalie,Gu Guangyu, Liu Yun,Wu Lili,Li Rongjian,Zhang Shunmin (Department of Pathology,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To explore the application of Ramos immunostaining in intraoperative frozen diagnosis. Methods: 100 cases intraoperative frozen tissues were detected by Ramos immunostaining method. Results: The detection was completed within 10 min, with good localization of antigen and strong positive signal. Conclusion: Ramos immunohistochemistry technique can be used in intra operative frozen diagnosis,it may be an important supplementary means.
, 百拇医药
KEY WORDS Ramos method; microwave; cryoultramicrotomy
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(11): 910～911]
冰冻快速活检，为临床提供快速而准确的诊断，确定手术方案，对疾病的诊断和预后非常重要。冰冻活检诊断要求在短时间内完成，并因组织细胞形态与石蜡切片不同，检查方法单一，常给诊断带来一定困难，所以，冰冻活检诊断一直是病理工作中的难点之一。为此，我们将Ramos(rapid microwave one step method)免疫组织化学技术应用于冰冻活检诊断中，并探讨其可行性。
1 材料和方法
1.1 试剂 酶标记特异性抗体CK，EMA，Vimentin，Desmin，SMA，S-100，LCA，PCNA，HMB45和DAB试剂盒均为Dako公司产品，SP试剂盒由美国Zymed公司生产。
, 百拇医药
1.2 组织标本 选择本科常规冰冻活检组织标本，其种类见表1。
1.3 医用微波仪 ZD-Ⅲ医用微波仪，输出功率600 W，分10档次，设精确微波辐射控制系统，由上海中达医学应用研究所生产。
1.4 操作方法 (1)冰冻组织切片快速脱水，二甲苯浸泡1 min，快速水化至PBS液，每张切片分别滴加50 μl HRP标记特异性抗体，然后将切片置微波湿盒内，并在湿盒内放入250 ml微波吸收介质。采用微波中功率(350 W)，辐射60 s，保留3 min待继续反应，PBS洗涤2 min。微波DAB显色，每张切片滴加100 μL DAB-H2O2，置微波中低功率(约280 W)辐射45 s。PBS洗涤，自来水充分洗涤，苏木素复染，吹干，中性树胶封片和镜检。(2) 对照实验选用标准S-P法，特异性抗体稀释度见表1。主要步骤为非特异性阻断10 min， 每张切片依次分别滴加50 μl的特异性抗体，生物素化第二抗体和SP复合物，分别在 37℃孵育60 min，45 min和45 min，DAB-H2O2显色10 min。其余方法和步骤与Ramos法相同。
, 百拇医药
2 结 果
乳腺癌、胃肠腺癌、甲状腺癌及淋巴结转移性癌的Ramos法及标准S-P法标记结果见表1。Ramos法对各种抗原的阳性检出率与S-P法基本相同。两种方法均有较好的抗原定位(图1～4，见封四),其中EMA，LCA主要定位于胞膜，PCNA及P53定位于细胞核，其余标记则为胞浆阳性。
图1 胃低分化腺癌CEA阳性(Ramos×200)
Fig 1 CEA was positive in poorly differentiated adenocarcinoma of stomach(Ramos×200)
图2 乳腺癌EMA阳性(Ramos×200)
, 百拇医药
Fig 2 EMA was positive in carcinoma of breast(Ramos×200)
图3 甲状腺乳头状癌TG阳性(Ramos×200)
Fig 3 TG was positive in papillary carcinoma of thyroid gland(Ramos×200)
图4 淋巴结转移性癌PCK阳性(Ramos×400)
Fig 4 PCK was positive in metastatic carcinoma of lymph nodes(Ramos×400)
, 百拇医药
表1 Ramos法及标准S-P法对各种抗原的检测结果
Tab 1 Detection of antigens with Ramos and S-P method Tumor
n
Antigens
Positive rate(%)
Dilution of
antibodies
Ramos
S-P
Carcinoma of
, http://www.100md.com
63
CEA
88.8
88.8
100
breast
EMA
79.4
79.4
100
CA15-3
82.5
84.1
, http://www.100md.com
100
S-100
6.3
6.3
400
SMA
39.7
39.7
100
ER
49.2
49.2
50
, 百拇医药
PR
41.2
42.9
50
Gastroenteric
11
CA19-9
81.8
81.8
100
adenocarcinoma
CA242
63.6
, http://www.100md.com
63.6
50
EMA
72.7
72.7
100
LCK
90.9
90.9
100
PCNA
100.0
100.0
, 百拇医药
100
P53
54.5
45.5
100
CEA
90.9
90.9
100
Carcinoma of
17
TG
94.1
, 百拇医药
94.1
50
thyroid gland
HCT
23.5
23.5
100
EMA
76.5
76.5
100
ESA
82.3
, 百拇医药
82.3
100
Metastatic
9
PCK
88.9
88.9
100
carcinoma
CA15-3
66.7
66.7
100
, 百拇医药
of lymph nodes
CA19-9
77.8
77.8
100
CEA
55.6
55.6
100
CA242
66.7
66.7
100
, 百拇医药
CA125
33.3
33.3
100
LCA
0
0
100
S-100
0
0
400
3 讨 论
, 百拇医药
近年来，免疫组织化学技术在肿瘤病理研究和诊断中的应用愈来愈广泛，但主要应用于常规石蜡切片的检测，而将免疫组化方法应用于冰冻切片快速诊断国内外均罕见报道。
冰冻切片技术在临床肿瘤病理快速诊断和鉴别诊断中发挥着极为重要的作用，但由于存在着组织结构破坏，细胞挤压变形严重和对比染色不清楚等缺点，有时只靠光镜观察很难对冰冻切片做出快速、准确的诊断，寻找一种快速有效的辅助手段具有重要的实际意义。
Ramos法是将高频电磁波(微波)热效应，化学效应和生物效应引入免疫组化技术，与Epos方法相结合而建立的一种快速免疫组化标记新技术，所采用酶标记特异性第一抗体是将辣根过氧化物酶标记在一个具有惰性的多聚物上，然后再与特异性抗体结合形成一个巨大复合物[1，2]。此法不仅特异性好，而且也是目前国内外最快的方法，我们已往的研究亦证实Ramos不仅快速，而且具有特异性强，非特异性背景染色轻，无边缘反应等特征[3]。
, 百拇医药
本研究对100例冰冻活检标本进行了Ramos免疫组织化学研究，并与标准S-P法进行对比，结果发现，多种标记反应阳性率基本相同，免疫标记时间可在10 min内完成，标记结果对低分化乳腺癌及淋巴结转移癌的诊断具有重要的辅助作用，在临床肿瘤病理快速诊断中应用Ramos免疫组织化学检测方法检测特异性抗原，将可大大缩短检测时间并提高冰冻活检的确诊率。
作者简介：马大烈，男，1953年6月生，副教授，硕士生导师
参考文献
1 Chilosi M,Lestani M,Pedron S,et al.A rapid immunostaining method for frozen sections[J]. Biotech Histochem,1994,69(4):235
2 Tsutsumi Y,Serizawa A,Kawai K.Enhanced polymer one step staining (Epos) for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Ki-67 antigen: application to intraoperative frozen diagnosis[J].Pathol Int, 1995,45(2):108
3 马大烈，郑青渝，黄 玲,等. Ramos 免疫组织化学新技术的特异性研究[J]. 临床与实验病理学杂志， 1997，13(4)：377
(1999-06-19收稿，1999-09-11修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院病理科，上海，200433
关键词：Ramos法；微波；冰冻超微组织切片术
第二军医大学学报991129 摘要 目的： 探讨Ramos免疫组织化学技术在冰冻快速病理诊断中的应用价值。方法: 应用Ramos免疫组织化学技术对100例冰冻活检组织进行免疫组化标记。结果：Ramos法在冰冻活检组织中有较好的抗原定位及较强的阳性信号，整个检测过程可在10 min内完成。结论：Ramos免疫组织化学技术可应用于冰冻活检诊断，并可能成为其重要的辅助手段。
中图分类号 R 446.8 文献标识码：A
Diagnostic significance of Ramos immunohistochemistry technique for benign or malignant lesions of frozen tissue
, http://www.100md.com
Ma Dalie,Gu Guangyu, Liu Yun,Wu Lili,Li Rongjian,Zhang Shunmin (Department of Pathology,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To explore the application of Ramos immunostaining in intraoperative frozen diagnosis. Methods: 100 cases intraoperative frozen tissues were detected by Ramos immunostaining method. Results: The detection was completed within 10 min, with good localization of antigen and strong positive signal. Conclusion: Ramos immunohistochemistry technique can be used in intra operative frozen diagnosis,it may be an important supplementary means.
, 百拇医药
KEY WORDS Ramos method; microwave; cryoultramicrotomy
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(11): 910～911]
冰冻快速活检，为临床提供快速而准确的诊断，确定手术方案，对疾病的诊断和预后非常重要。冰冻活检诊断要求在短时间内完成，并因组织细胞形态与石蜡切片不同，检查方法单一，常给诊断带来一定困难，所以，冰冻活检诊断一直是病理工作中的难点之一。为此，我们将Ramos(rapid microwave one step method)免疫组织化学技术应用于冰冻活检诊断中，并探讨其可行性。
1 材料和方法
1.1 试剂 酶标记特异性抗体CK，EMA，Vimentin，Desmin，SMA，S-100，LCA，PCNA，HMB45和DAB试剂盒均为Dako公司产品，SP试剂盒由美国Zymed公司生产。
, 百拇医药
1.2 组织标本 选择本科常规冰冻活检组织标本，其种类见表1。
1.3 医用微波仪 ZD-Ⅲ医用微波仪，输出功率600 W，分10档次，设精确微波辐射控制系统，由上海中达医学应用研究所生产。
1.4 操作方法 (1)冰冻组织切片快速脱水，二甲苯浸泡1 min，快速水化至PBS液，每张切片分别滴加50 μl HRP标记特异性抗体，然后将切片置微波湿盒内，并在湿盒内放入250 ml微波吸收介质。采用微波中功率(350 W)，辐射60 s，保留3 min待继续反应，PBS洗涤2 min。微波DAB显色，每张切片滴加100 μL DAB-H2O2，置微波中低功率(约280 W)辐射45 s。PBS洗涤，自来水充分洗涤，苏木素复染，吹干，中性树胶封片和镜检。(2) 对照实验选用标准S-P法，特异性抗体稀释度见表1。主要步骤为非特异性阻断10 min， 每张切片依次分别滴加50 μl的特异性抗体，生物素化第二抗体和SP复合物，分别在 37℃孵育60 min，45 min和45 min，DAB-H2O2显色10 min。其余方法和步骤与Ramos法相同。
, 百拇医药
2 结 果
乳腺癌、胃肠腺癌、甲状腺癌及淋巴结转移性癌的Ramos法及标准S-P法标记结果见表1。Ramos法对各种抗原的阳性检出率与S-P法基本相同。两种方法均有较好的抗原定位(图1～4，见封四),其中EMA，LCA主要定位于胞膜，PCNA及P53定位于细胞核，其余标记则为胞浆阳性。
图1 胃低分化腺癌CEA阳性(Ramos×200)
Fig 1 CEA was positive in poorly differentiated adenocarcinoma of stomach(Ramos×200)
图2 乳腺癌EMA阳性(Ramos×200)
, 百拇医药
Fig 2 EMA was positive in carcinoma of breast(Ramos×200)
图3 甲状腺乳头状癌TG阳性(Ramos×200)
Fig 3 TG was positive in papillary carcinoma of thyroid gland(Ramos×200)
图4 淋巴结转移性癌PCK阳性(Ramos×400)
Fig 4 PCK was positive in metastatic carcinoma of lymph nodes(Ramos×400)
, 百拇医药
表1 Ramos法及标准S-P法对各种抗原的检测结果
Tab 1 Detection of antigens with Ramos and S-P method Tumor
n
Antigens
Positive rate(%)
Dilution of
antibodies
Ramos
S-P
Carcinoma of
, http://www.100md.com
63
CEA
88.8
88.8
100
breast
EMA
79.4
79.4
100
CA15-3
82.5
84.1
, http://www.100md.com
100
S-100
6.3
6.3
400
SMA
39.7
39.7
100
ER
49.2
49.2
50
, 百拇医药
PR
41.2
42.9
50
Gastroenteric
11
CA19-9
81.8
81.8
100
adenocarcinoma
CA242
63.6
, http://www.100md.com
63.6
50
EMA
72.7
72.7
100
LCK
90.9
90.9
100
PCNA
100.0
100.0
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100
P53
54.5
45.5
100
CEA
90.9
90.9
100
Carcinoma of
17
TG
94.1
, 百拇医药
94.1
50
thyroid gland
HCT
23.5
23.5
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EMA
76.5
76.5
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ESA
82.3
, 百拇医药
82.3
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Metastatic
9
PCK
88.9
88.9
100
carcinoma
CA15-3
66.7
66.7
100
, 百拇医药
of lymph nodes
CA19-9
77.8
77.8
100
CEA
55.6
55.6
100
CA242
66.7
66.7
100
, 百拇医药
CA125
33.3
33.3
100
LCA
0
0
100
S-100
0
0
400
3 讨 论
, 百拇医药
近年来，免疫组织化学技术在肿瘤病理研究和诊断中的应用愈来愈广泛，但主要应用于常规石蜡切片的检测，而将免疫组化方法应用于冰冻切片快速诊断国内外均罕见报道。
冰冻切片技术在临床肿瘤病理快速诊断和鉴别诊断中发挥着极为重要的作用，但由于存在着组织结构破坏，细胞挤压变形严重和对比染色不清楚等缺点，有时只靠光镜观察很难对冰冻切片做出快速、准确的诊断，寻找一种快速有效的辅助手段具有重要的实际意义。
Ramos法是将高频电磁波(微波)热效应，化学效应和生物效应引入免疫组化技术，与Epos方法相结合而建立的一种快速免疫组化标记新技术，所采用酶标记特异性第一抗体是将辣根过氧化物酶标记在一个具有惰性的多聚物上，然后再与特异性抗体结合形成一个巨大复合物[1，2]。此法不仅特异性好，而且也是目前国内外最快的方法，我们已往的研究亦证实Ramos不仅快速，而且具有特异性强，非特异性背景染色轻，无边缘反应等特征[3]。
, 百拇医药
本研究对100例冰冻活检标本进行了Ramos免疫组织化学研究，并与标准S-P法进行对比，结果发现，多种标记反应阳性率基本相同，免疫标记时间可在10 min内完成，标记结果对低分化乳腺癌及淋巴结转移癌的诊断具有重要的辅助作用，在临床肿瘤病理快速诊断中应用Ramos免疫组织化学检测方法检测特异性抗原，将可大大缩短检测时间并提高冰冻活检的确诊率。
作者简介：马大烈，男，1953年6月生，副教授，硕士生导师
参考文献
1 Chilosi M,Lestani M,Pedron S,et al.A rapid immunostaining method for frozen sections[J]. Biotech Histochem,1994,69(4):235
2 Tsutsumi Y,Serizawa A,Kawai K.Enhanced polymer one step staining (Epos) for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Ki-67 antigen: application to intraoperative frozen diagnosis[J].Pathol Int, 1995,45(2):108
3 马大烈，郑青渝，黄 玲,等. Ramos 免疫组织化学新技术的特异性研究[J]. 临床与实验病理学杂志， 1997，13(4)：377
(1999-06-19收稿，1999-09-11修回), 百拇医药