壶腹癌中 P16蛋白及PCNA表达的临床意义
作者：邵成浩 刘瑞 唐岩 胡先贵 曹贵松
单位：第二军医大学长海医院普通外科，上海，200433
关键词：壶腹肿瘤；基因；p16；抗原；增殖细胞核
第二军医大学学报991124 摘要 目的：探讨壶腹癌中抑癌基因P16蛋白与增殖细胞核抗原(PCNA)表达的相关性及其与肿瘤临床病理特征的关系。方法：采用免疫组织化学ABC法检测45例壶腹癌及11例癌旁正常胰腺组织中P16蛋白及PCNA的表达，并与临床病理学进行对比分析。结果：P16蛋白在壶腹癌和癌旁正常胰腺组织中的阳性表达率有显著性差异(P<0.05)；P16蛋白表达阳性率在肿瘤分化程度低、有胰头侵犯、淋巴结转移、临床分期高者显著降低；PCNA蛋白阳性表达在有淋巴结转移者明显升高，与是否侵犯胰头及肿瘤大小无关；P16与PCNA的表达呈明显的负相关。结论：P16与PCNA的表达异常与壶腹癌的发生、发展密切相关，联合检测P16蛋白和PCNA可作为判断肿瘤恶性程度的参考指标。
中图分类号 R 735.31 文献标识码：A
Expression of P16 protein and PCNA in ampullary carcinoma and clinical implication
Shao Chenghao， Liu Rui，Tang Yan, Hu Xiangui, Cao Guisong (Department of General Surgery， Changhai Hospital， Second Military Medical University， Shanghai， 200433)
ABSTRACT Objective：To study the expression of P16 protein and PCNA in ampullary carcinoma and its relation with its pathological features. Method: P16 and PCNA expression was immunohistochemically detected in 45 cases of ampullary carcinoma cases and 11 cases of normal pancreatic tissues adjacent to neoplastic lesions. The data were analyzed in connection with clinical findings. Results： The positive rate of P16 protein was higher in nonneoplastic tissues than in tumor tissues (P<0.05)，the positive expression of P16 protein was correlated with low tumor differentiation degree，invasion to pancreas，lymph node metastasis and the TNM higher stages. The positive expression rate of PCNA in tumor tissues was significantly higher in patients with lymph node metastasis(P<0.05) and was not correlated with invasion and tumor size. Conclusion：The abnormal expression of P16 and PCNA are closely correlated with the occurrence ，development and malignancy of ampullary carcinoma.P16 and PCNA may serve as markers in the evaluation of the malignancy of ampullary carcinoma.
KEY WORDS ampullary neoplasm；genes, p16；antigens, proliferating cell nuclear
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(11): 895～897]
p16基因是一个参与调控细胞周期的抑癌基因，当发生突变或缺失后可促使细胞无限制地生长，对肿瘤的发生、发展有着重要的作用。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是一种仅出现在增殖状态细胞核内的酸性蛋白质，是反映肿瘤细胞DNA合成情况和增殖活性的重要指标，可用于判断肿瘤细胞的增殖状况。我们应用免疫组织化学ABC法，检测P16蛋白及PCNA在壶腹癌及癌旁正常胰腺组织中的表达，结合临床资料，评价其在壶腹癌中表达的意义。
1 材料和方法
1.1 研究对象 本组45例，男31例，女14例，年龄36～78岁，平均(54±9)岁，为本院普通外科1996年1月至1999年1月间收治患者，均行胰十二指肠切除术，术后病理证实为壶腹癌。病理组织学类型：管状腺癌33例、乳头状腺癌12例。肿瘤分化程度：高分化11例、中分化20例、低分化14例。淋巴结转移：阳性25例、阴性20例。已穿透十二指肠浆膜、侵犯胰头24例。肿瘤直径2 cm以上25例，小于或等于2 cm 20例，按UICC的TNM分期，Ⅰ期17例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例。
1.2 试剂 PCNA (PC10)单克隆抗体为美国Sigma公司产品，兔抗人P16抑癌基因多克隆抗体和ABC试剂盒均为武汉博士德公司产品。
1.3 方法 (1) 肿瘤标本经10%甲醛固定、取材、石蜡包埋保存。每例蜡块连续切片3张，厚5 μm，备染，另取距肿瘤2 cm处正常胰腺组织作对照。其中一张作苏木精-伊红(HE)染色，另两张脱蜡后免疫组织化学ABC染色，按试剂盒说明书进行。以已知胃癌阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。作ABC染色前，均对抗原用常规方法进行微波修复处理。(2) 结果判断： P16蛋白定位于胞浆内，染成浅黄色或棕黄色颗粒状为阳性；PCNA阳性表达定位于细胞核，呈颗粒状或弥散散在；PCNA表达占肿瘤细胞的25%以下为“阴性”，大于25%记为“阳性”。
1.4 统计学处理 采用χ2检验、等级相关分析。
2 结 果
2.1 P16蛋白及PCNA在壶腹癌及癌旁正常胰腺组织中的表达 P16蛋白在壶腹癌中的阳性表达率为40.0%(18/45)，为胞浆表达，阳性细胞以局灶状分布为主；在癌旁正常胰腺组织中的阳性表达率为81.8%(9/11)，两组阳性表达具有显著性差异(P<0.05)。PCNA在壶腹癌及癌旁正常胰腺组织中阳性表达率分别为64.4%(29/45)及54.5%(6/11)，为胞核着色，壶腹癌组织中阳性肿瘤细胞呈片状分布，核多为不规则形，正常胰腺组织呈散在分布，两组间阳性表达无显著性差异。
2.2 壶腹癌P16蛋白及PCNA表达与临床病理特征的关系 P16蛋白在壶腹癌中阳性表达率为40.0%(18/45)；PCNA阳性表达率为64.4%(29/45)。P16蛋白阳性表达随肿瘤细胞分化程度的降低而降低，在高分化、中分化、低分化中的阳性表达率分别为63.7%，45.5%及14.2%，高分化与中分化、低分化比较有显著性差异(P<0.05)；PCNA表达阳性率随肿瘤细胞分化程度降低而升高，在高分化、中分化、低分化中分别为45.5%，65%及78.6%，但各级间无显著性差异。在有胰头侵犯、淋巴结转移、肿瘤直径>2 cm者，P16表达显著下降(P<0.05)，PCNA的表达阳性率在有淋巴结转移者明显上升(P<0.05)，与有无胰头侵犯、肿瘤直径大小无关。
2.3 壶腹癌P16蛋白及PCNA表达与临床分期的关系 P16蛋白表达随壶腹癌临床分期升高而降低，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中的阳性表达率依次为58.8%，38.5%及20.0%，低分期组(Ⅰ、Ⅱ期)与高分期组(Ⅲ期)比较阳性表达率有显著性差异(P<0.05)；PCNA在各期表达无明显规律，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期阳性率分别为52.9%，69.2%，及73.3 %。
2.4 壶腹癌P16蛋白表达与PCNA表达间相互关系 18例P16表达阳性患者中，8例PCNA表达阳性，10例阴性；27例 P16表达阴性患者中，21例PCNA表达阳性，6例阴性。统计结果表明，P16蛋白表达与PCNA表达呈明显负相关(r=-0.57，P<0.05)。
3 讨 论
p16抑癌基因定位于人9号染色体短臂2区1带(9P21)，其染色体组有3个外显子，表达产物为P16蛋白，P16蛋白通过抑制细胞周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4，CDK4)活性参与并调节细胞从G0期进入G1期，若没有P16蛋白的抑制作用，细胞会异常增生，发生癌变[1，2]。我们的研究提示，P16在壶腹癌中的阳性表达率随细胞分化程度降低、肿瘤分期的升高而下降，癌旁正常胰腺组织中的阳性表达率显著高于癌组织中的表达率，提示p16基因在壶腹癌的发生发展中起重要作用；P16在分化程度低、有淋巴结转移、胰头侵犯、肿瘤直径超过2 cm者表达明显降低，说明P16表达缺失与壶腹癌恶性程度、转移有关，提示p16基因检测可作为判断壶腹癌恶性程度的标志[3]。
PCNA是一种核蛋白，能与DNA多聚酶σ结合，与DNA复制有关，其阳性程度可直接反映DNA复制的活跃程度，可作为研究细胞增殖状态的一项指标[4，5]。本研究结果显示，PCNA的阳性表达率随肿瘤的分化程度降低而上升，在有淋巴结转移者明显升高，提示PCNA可作为肿瘤细胞恶性增殖的指标。P16的表达与PCNA呈显著的负相关，其机制尚不完全清楚，可能是p16基因失活，导致其与细胞周期素竞争抑制CDK4活性作用消失的结果。我们认为，联合检测P16和PCNA对判断壶腹癌的恶性程度有指导意义。
作者简介：邵成浩，男，1971年1月生，博士生
参考文献
1 Serrano M， Hannon GJ， Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J]. Nature，1993，366(6456):704
2 Marx J. A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor.Science，1994，264(5167):1846
3 Tung WS， Shenvlin DW， Bartsch D， et al. Infrequent CDKN2 mutation in human differentiated thyroid cancer[J]. Mol Carcinog， 1996，15(1):5
4 Hall PA， Levison DA， Woods AL， et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence deregulated expression in some neoplasms[J]. J Pathol，1990，162(4):285
5 史宪杰，李开宗，窦科峰，等. 增殖细胞核抗原在肝硬化、肝细胞不典型增生和肝细胞癌中的表达及意义[J]. 中华实验外科杂志，1998,15(5):412
(1999-07-12收稿，1999-09-27修回)