一种改良的糖醛酸含量测定方法
作者：林颖 黄琳娟 田庚元
单位：中国科学院上海有机化学研究所(200023)
关键词：硫酸-咔唑法；糖醛酸；多糖
中草药991107摘 要 用硫酸-咔唑法测定天然多糖化合物中糖醛酸含量时，发现中性糖对测定结果有影响，并提出相应的改进方法，即测定中性糖的吸收度，从样品的吸收度值减去中性糖的吸收度值，即为糖醛酸的吸收度值。
An Improved Method for the Quantitative
Determination of Uronic Acid
Lin Ying Huang Linjuan Tian Gengyuan
, 百拇医药
(Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032)
Abstract The quantitative determination of uronic acid in natural polysaccharides by the traditional sulfuric acid-carbazole colorimetry, was found to be interfered by the presence of neutral sugars. Accordingly, an improved method was developed by determining the absorbance of the neutral sugar and substract this value from the absorbance of the sample to obtain the corrected value of uronic acid.
, 百拇医药
Key words sulfuric acid-carbazole colorimetry uronic acid polysaccharides
糖醛酸含量的测定方法目前常用的仍是硫酸-咔唑法〔1〕，但在实际工作中，特别是在测定天然产物中糖醛酸含量时，发现测得的结果往往与实际情况不符，因此探索正确测定天然化合物中糖醛酸含量的方法是很重要的。在文献中，虽然有关于影响糖醛酸测定结果的论述〔2，3〕，但未见有中性糖存在对其影响的实验报道及方法上的改进。我们用实验证明中性糖的存在对糖醛酸的测定结果有较大的影响，并提出了一种消除中性糖影响的方法，现报道如下。
1 材料与仪器
0.1% 咔唑试液(50 mg咔唑溶于50 mL 95%乙醇)，葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)均为化学纯，枸杞多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2，LbP3由本课题组提供。722分光光度计。
, http://www.100md.com
2 方法与结果
2.1 常用的硫酸-咔唑法
2.1.1 标准曲线绘制：精确称取干燥的单糖标准样品10 mg，定容于25 mL容量瓶中。然后准确量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL单糖标准溶液于带塞试管中，各管加水至1 mL。在冰水浴中向各管加入6 mL浓硫酸，摇匀后，改在85 ℃水浴中保持20 min，取出后冷至室温，各管加0.2 mL咔唑液，在室温下保持2 h，测定吸收度(530 nm)，以浓度对吸收度作标准曲线。
2.1.2 测定各单糖在530 nm处的检测响应：分别准确吸取各种单糖溶液(10 mg/25 mL)0.4 mL，补水至1 mL用2.1.1项下方法测得其吸收值，结果如表1。
表1 咔唑法测定时各单糖在530 nm处的吸收值 Gal
, http://www.100md.com
Glc
Man
Xyl
Ara
Rha
Fru
GalA
GlcA
0.0493
0.1018
0.0503
0.0840
0.0251
, http://www.100md.com
0.0140
0.1245
0.2603
0.2498
上述结果表明，用咔唑法测定时，天然多糖化合物中常见的各种中性单糖在530 nm处也均有程度不同的吸收。
2.2 各单糖浓度与咔唑法测定时在530 nm处吸收值的线性关系：以常用咔唑法(参考2.1.1)测定各单糖吸收标准曲线(其中GalA和GlcA标准溶液的配制为精确称取干燥的糖醛酸10 mg溶于100 mL容量瓶)，其线性回归方程及相关系数如下。
Glc Y=0.4631X+0.004939(r=0.9996)
Gal Y=0.2358X+0.004567(r=0.9993)
, 百拇医药
Man Y=0.1587X+0.002963(r=0.9998)
Xyl Y=0.2559X+0.000884(r=0.9997)
Fru Y=0.1727X+0.001872(r=0.9960)
Rha 吸收值基本保持不变
GalA Y=0.5857X+0.005917(r=0.9998)
GlcA Y=0.4264X+0.000601(r=0.9999)
上述结果可知，各中性单糖在0.04～0.32 mg/mL范围内、GalA和GlcA在0.01～0.08 mg/mL范围内各单糖浓度与咔唑法检测吸收值呈线性。
, 百拇医药
2.3 定量考察各中性单糖对咔唑法测定糖醛酸含量的影响
2.3.1 分别准确量取GalA和GlcA(10 mg/100 mL)0.4 mL，各加入0.0，0.4，0.6 mL各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。
2.3.2 分别准确量取各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)0.0，0.4，0.6 mL，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。得数据如表2。表2 各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察结果 A530
加入标准中性糖体积(mL)
A530
加入标准中性糖体积(mL)
0.0
, http://www.100md.com
0.4
0.6
0.0
0.4
0.6
GalA+Glc
0.2738
0.3732
0.3920
GlcA+Glc
0.2438
0.3506
0.4043
, http://www.100md.com
Glc
0.0000
0.1017
0.1377
Glc
0.0000
0.1183
0.1741
(GalA+Glc)Glc
0.2738
0.2715
0.2543
, http://www.100md.com
(GlcA+Glc)Glc
0.2438
0.2323
0.2302
GalA+Gal
0.2549
0.3059
0.3495
GlcA+Ga1
0.2603
0.3143
0.3406
, 百拇医药
Gal
0.0000
0.0513
.0914
Gal
0.0000
0.0473
0.1051
(GalA+Gal)Gal
0.2549
0.2546
0.2584
, 百拇医药 (GlcA+Gal)Gal
0.2603
0.2670
0.2355
GalA+Man
0.2636
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GlcA+Man
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0.3101
, 百拇医药
Man
0.0000
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Man
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0.0533
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(GalA+Man)Man
0.2636
0.2636
0.2548
, 百拇医药
(GlcA+Man)Man
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GalA+Xyl
0.2692
0.3455
0.3837
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0.2600
0.3432
0.3710
, http://www.100md.com
Xyl
0.0000
0.0759
0.1275
Xyl
0.0000
0.084
0.1072
(GalA+Xyl)Xyl
0.2692
0.6296
0.2562
, http://www.100md.com (GlcA+Xyl)Xyl
0.2600
0.2592
0.2638
GalA+Rha
0.2218
0.2400
0.2223
GlcA+Rha
0.2204
0.2370
0.2215
, 百拇医药
Rha
0.0000
0.0090
0.0170
Rha
0.0000
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(GalA+Rha)Rha
0.2218
0.2310
0.2063
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(GlcA+Rha)Rha
0.2204
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GalA+Fru
0.2444
0.3721
0.4432
GlcA+Fru
0.2204
0.3585
0.4335
, 百拇医药
Fru
0.0000
0.1345
0.2191
Fru
0.0000
0.1103
0.2097
(GalA+Fru)Fru
0.2444
0.2376
0.2241
, http://www.100md.com
(GlcA+Fru)Fru
0.2204
0.2482
0.2338
GalA+Ara
0.2551
0.2678
0.3125
GlcA+Ara
0.2360
0.2619
0.28885
, http://www.100md.com
Ara
0.0000
0.0072
0.0539
Ara
0.0000
0.0254
0.0558
(GalA+Ara)Ara
0.2551
0.2606
0.2586
, 百拇医药
(GlcA+Ara)Ara
0.2360
0.2365
0.2327
上述实验结果表明样品的吸收值随中性糖的含量增加而增大(Rha除外)，而样品吸收值与中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值基本一致。
2.4 改进的硫酸-咔唑法：根据2.3的实验结果，我们提出一种改进的硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量的方法，即样品的吸收值减去中性糖的吸收值为样品的吸收值。
2.4.1 标准溶液的配制
溶液1.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.2 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
, 百拇医药
溶液2.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.4 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
溶液3.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.6 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
中性单糖溶液.量取0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
2.4.2 方法改进前后糖醛酸测定结果的比较：上述中性单糖溶液按咔唑法测定在530 nm处的吸收值为0.0442。
表3所列结果表明，改进的咔唑法所测得的标准溶液中糖醛酸吸收值与实际测定值基本一致，因此这种改进的硫酸-咔唑法在测定各种样品中糖醛酸的含量时，排除了样品中中性糖对测定的影响，因而要比常用的硫酸-咔唑法准确。表3 不同方法的糖醛酸测定结果
, 百拇医药
溶液1
溶液2
溶液3
咔唑法测定值
0.1497
0.2482
0.3628
改良咔唑法测定值
0.1055
0.2040
0.3186
糖醛酸实际值
0.1092
, 百拇医药
0.2058
0.3207
注：改进的咔唑法测定值为常用咔唑法测定值与标准配制溶液中中性单糖吸收值(0.0442)之差。
2.5 改进的咔唑法测定糖醛酸实例：从枸杞子中分离得到的多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2和LbP3中的糖醛酸含量测定，具体操作如下：
2.5.1 样品中中性糖吸收值的测定：要求得样品中中性糖对检测的吸收干扰值，首先必须知道其中中性糖的含量和组成比。根据蒽酮-硫酸法〔4〕可测得中性糖的含量。组成比的测定需先将样品全水解〔5〕，然后再用HPLC或GC测得样品中各中性单糖的组成比。以此称取各种相应标准中性单糖配成混合液，然后取1 mL溶液于带塞试管中，然后按2.1.1所述的标准曲线制备操作，测得其吸收值。
, http://www.100md.com
2.5.2 样品的吸收值测定：按咔唑法(方法同2.1.1)，测得样品吸收值(注：样品中中性糖浓度应在其线性范围内)。
2.5.3 样品中糖醛酸含量的测定：样品中糖醛酸的吸收值为样品吸收值与中性糖吸收值之差，再根据对应标准的回归方程，计算出该样品中糖醛酸含量。实验结果如表4所示。
表4 常用的与改进的咔唑法测定糖醛酸含量结果的比较
糖醛酸含量(%)
多糖样品
常用咔唑法
改进咔唑法
LbGP3
5.3
, http://www.100md.com
3.4
LbGP4
10.4
6.4
LbP1
8.8
5.9
LbP2
8.1
6.7
LbP3
8.7
5.7
, 百拇医药
从表4结果可以看出常用咔唑法测定糖醛酸的含量其值偏高。
3 讨论
在咔唑法所规定的测定波长下，中性戊糖和中性己糖均有吸收，影响糖醛酸含量测定的准确性。为此我们对7种不同的中性糖分别进行了考察，测得其浓度与吸收值的线性范围。实验结果表明Xyl，Man，Glc，Gal，Fru分别找到了各自的线性范围，Rha随着浓度的改变其吸收值基本保持不变，Ara较难判断。各种单糖线性范围的测得，不仅证实了中性糖的存在对咔唑法测定糖醛酸的结果产生干扰，而且为提出一种比常用咔唑法准确性高的糖醛酸测定方法提供了实验依据。
用咔唑法测定各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察实验表明，糖醛酸和各中性单糖在其各自的线性范围内取样，样品的吸收值与中性糖吸收值之差与不含中性糖的糖醛酸实际测得吸收值基本一致。
参考文献
, 百拇医药
1 张惟杰主编.复合多糖生化研究技术(第一版).上海：上海科学技术出版社，1987：6
2 李好枝，等.中草药，1995，26(7)：347
3 Bitter T, et al. Anal Biochem, 1962,4:330
4 Dubis M, et al. Anal Chem, 1956,28:350
5 黄琳娟，等.药学学报，1998，33(7)：512
收稿日期：1999-03-02, 百拇医药
单位：中国科学院上海有机化学研究所(200023)
关键词：硫酸-咔唑法；糖醛酸；多糖
中草药991107摘 要 用硫酸-咔唑法测定天然多糖化合物中糖醛酸含量时，发现中性糖对测定结果有影响，并提出相应的改进方法，即测定中性糖的吸收度，从样品的吸收度值减去中性糖的吸收度值，即为糖醛酸的吸收度值。
An Improved Method for the Quantitative
Determination of Uronic Acid
Lin Ying Huang Linjuan Tian Gengyuan
, 百拇医药
(Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032)
Abstract The quantitative determination of uronic acid in natural polysaccharides by the traditional sulfuric acid-carbazole colorimetry, was found to be interfered by the presence of neutral sugars. Accordingly, an improved method was developed by determining the absorbance of the neutral sugar and substract this value from the absorbance of the sample to obtain the corrected value of uronic acid.
, 百拇医药
Key words sulfuric acid-carbazole colorimetry uronic acid polysaccharides
糖醛酸含量的测定方法目前常用的仍是硫酸-咔唑法〔1〕，但在实际工作中，特别是在测定天然产物中糖醛酸含量时，发现测得的结果往往与实际情况不符，因此探索正确测定天然化合物中糖醛酸含量的方法是很重要的。在文献中，虽然有关于影响糖醛酸测定结果的论述〔2，3〕，但未见有中性糖存在对其影响的实验报道及方法上的改进。我们用实验证明中性糖的存在对糖醛酸的测定结果有较大的影响，并提出了一种消除中性糖影响的方法，现报道如下。
1 材料与仪器
0.1% 咔唑试液(50 mg咔唑溶于50 mL 95%乙醇)，葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)均为化学纯，枸杞多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2，LbP3由本课题组提供。722分光光度计。
, http://www.100md.com
2 方法与结果
2.1 常用的硫酸-咔唑法
2.1.1 标准曲线绘制：精确称取干燥的单糖标准样品10 mg，定容于25 mL容量瓶中。然后准确量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL单糖标准溶液于带塞试管中，各管加水至1 mL。在冰水浴中向各管加入6 mL浓硫酸，摇匀后，改在85 ℃水浴中保持20 min，取出后冷至室温，各管加0.2 mL咔唑液，在室温下保持2 h，测定吸收度(530 nm)，以浓度对吸收度作标准曲线。
2.1.2 测定各单糖在530 nm处的检测响应：分别准确吸取各种单糖溶液(10 mg/25 mL)0.4 mL，补水至1 mL用2.1.1项下方法测得其吸收值，结果如表1。
表1 咔唑法测定时各单糖在530 nm处的吸收值 Gal
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Glc
Man
Xyl
Ara
Rha
Fru
GalA
GlcA
0.0493
0.1018
0.0503
0.0840
0.0251
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0.0140
0.1245
0.2603
0.2498
上述结果表明，用咔唑法测定时，天然多糖化合物中常见的各种中性单糖在530 nm处也均有程度不同的吸收。
2.2 各单糖浓度与咔唑法测定时在530 nm处吸收值的线性关系：以常用咔唑法(参考2.1.1)测定各单糖吸收标准曲线(其中GalA和GlcA标准溶液的配制为精确称取干燥的糖醛酸10 mg溶于100 mL容量瓶)，其线性回归方程及相关系数如下。
Glc Y=0.4631X+0.004939(r=0.9996)
Gal Y=0.2358X+0.004567(r=0.9993)
, 百拇医药
Man Y=0.1587X+0.002963(r=0.9998)
Xyl Y=0.2559X+0.000884(r=0.9997)
Fru Y=0.1727X+0.001872(r=0.9960)
Rha 吸收值基本保持不变
GalA Y=0.5857X+0.005917(r=0.9998)
GlcA Y=0.4264X+0.000601(r=0.9999)
上述结果可知，各中性单糖在0.04～0.32 mg/mL范围内、GalA和GlcA在0.01～0.08 mg/mL范围内各单糖浓度与咔唑法检测吸收值呈线性。
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2.3 定量考察各中性单糖对咔唑法测定糖醛酸含量的影响
2.3.1 分别准确量取GalA和GlcA(10 mg/100 mL)0.4 mL，各加入0.0，0.4，0.6 mL各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。
2.3.2 分别准确量取各中性单糖溶液(10 mg/25 mL)0.0，0.4，0.6 mL，分别补水至1 mL，按咔唑法测其吸收值。得数据如表2。表2 各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察结果 A530
加入标准中性糖体积(mL)
A530
加入标准中性糖体积(mL)
0.0
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0.4
0.6
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0.4
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Gal
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Man
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, 百拇医药
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0.2327
上述实验结果表明样品的吸收值随中性糖的含量增加而增大(Rha除外)，而样品吸收值与中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值基本一致。
2.4 改进的硫酸-咔唑法：根据2.3的实验结果，我们提出一种改进的硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量的方法，即样品的吸收值减去中性糖的吸收值为样品的吸收值。
2.4.1 标准溶液的配制
溶液1.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.2 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
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溶液2.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.4 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
溶液3.准确量取GalA(10 mg/100 mL)0.6 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
中性单糖溶液.量取0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，补水至1 mL。
2.4.2 方法改进前后糖醛酸测定结果的比较：上述中性单糖溶液按咔唑法测定在530 nm处的吸收值为0.0442。
表3所列结果表明，改进的咔唑法所测得的标准溶液中糖醛酸吸收值与实际测定值基本一致，因此这种改进的硫酸-咔唑法在测定各种样品中糖醛酸的含量时，排除了样品中中性糖对测定的影响，因而要比常用的硫酸-咔唑法准确。表3 不同方法的糖醛酸测定结果
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溶液1
溶液2
溶液3
咔唑法测定值
0.1497
0.2482
0.3628
改良咔唑法测定值
0.1055
0.2040
0.3186
糖醛酸实际值
0.1092
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0.2058
0.3207
注：改进的咔唑法测定值为常用咔唑法测定值与标准配制溶液中中性单糖吸收值(0.0442)之差。
2.5 改进的咔唑法测定糖醛酸实例：从枸杞子中分离得到的多糖样品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2和LbP3中的糖醛酸含量测定，具体操作如下：
2.5.1 样品中中性糖吸收值的测定：要求得样品中中性糖对检测的吸收干扰值，首先必须知道其中中性糖的含量和组成比。根据蒽酮-硫酸法〔4〕可测得中性糖的含量。组成比的测定需先将样品全水解〔5〕，然后再用HPLC或GC测得样品中各中性单糖的组成比。以此称取各种相应标准中性单糖配成混合液，然后取1 mL溶液于带塞试管中，然后按2.1.1所述的标准曲线制备操作，测得其吸收值。
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2.5.2 样品的吸收值测定：按咔唑法(方法同2.1.1)，测得样品吸收值(注：样品中中性糖浓度应在其线性范围内)。
2.5.3 样品中糖醛酸含量的测定：样品中糖醛酸的吸收值为样品吸收值与中性糖吸收值之差，再根据对应标准的回归方程，计算出该样品中糖醛酸含量。实验结果如表4所示。
表4 常用的与改进的咔唑法测定糖醛酸含量结果的比较
糖醛酸含量(%)
多糖样品
常用咔唑法
改进咔唑法
LbGP3
5.3
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3.4
LbGP4
10.4
6.4
LbP1
8.8
5.9
LbP2
8.1
6.7
LbP3
8.7
5.7
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从表4结果可以看出常用咔唑法测定糖醛酸的含量其值偏高。
3 讨论
在咔唑法所规定的测定波长下，中性戊糖和中性己糖均有吸收，影响糖醛酸含量测定的准确性。为此我们对7种不同的中性糖分别进行了考察，测得其浓度与吸收值的线性范围。实验结果表明Xyl，Man，Glc，Gal，Fru分别找到了各自的线性范围，Rha随着浓度的改变其吸收值基本保持不变，Ara较难判断。各种单糖线性范围的测得，不仅证实了中性糖的存在对咔唑法测定糖醛酸的结果产生干扰，而且为提出一种比常用咔唑法准确性高的糖醛酸测定方法提供了实验依据。
用咔唑法测定各种中性单糖对糖醛酸影响的定量考察实验表明，糖醛酸和各中性单糖在其各自的线性范围内取样，样品的吸收值与中性糖吸收值之差与不含中性糖的糖醛酸实际测得吸收值基本一致。
参考文献
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1 张惟杰主编.复合多糖生化研究技术(第一版).上海：上海科学技术出版社，1987：6
2 李好枝，等.中草药，1995，26(7)：347
3 Bitter T, et al. Anal Biochem, 1962,4:330
4 Dubis M, et al. Anal Chem, 1956,28:350
5 黄琳娟，等.药学学报，1998，33(7)：512
收稿日期：1999-03-02, 百拇医药