抑癌基因Rb及p16在非小细胞肺癌中表达的相关性研究
作者：李伟峰 赵 彤 邹霞英 朱梅刚
单位：李伟峰 邹霞英(广州军区广州总医院呼吸内科(510010))；赵彤 朱梅刚(第一军医大学病理教研室(510515))
关键词：p16基因；Rb基因；免疫组织化学；图像分析
广东医学991109 【摘要】 目的 检测Rb及p16基因产物在非小细胞肺癌中的表达特征。方法 采用免疫组化和图象定量相关分析技术比较了Rb与p16的表达情况及相互关系。结果 11例Rb表达阴性的肿瘤，p16蛋白表达皆为强阳性，而30例Rb表达阳性程度较高(++)～(+++)的标本中，23例显示p16表达阴性或低水平表达，图像定量相关分析显示Rb失活与p16表达之间存在负相关关系。结论 提示NSCLC发生发展的分子遗传机制可能涉及p16及Rb基因在内的细胞周期G1期负反馈调节通路异常。
, http://www.100md.com Expression of Rb and p16 in non-small cell lung cancer
Li Weifeng, Zhao Tong, Zou Xiaying, et al.
Department of Respiratory Disease, Guangzhou General Hospital of Command of PLA, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To investigate the expression of Rb and p16 genes and their correlation in non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Immunohistochemistry and computerized image analysis were used to detected Rb protein in 52 primary NSCLC specimens, which was correlated to p16 expression.Results 23 of 30 Rb positive cancers had no or low p16 expression, while 11 Rb-negative cancers showed high levels of p16 protein. Thus, there was a reciprocity between Rb inactivation and p16 expression in NSCLC.Conclusion Abnormality in the negative feedback regulatory pathway of p16 and Rb genes might be involved in the molecular pathogenesis of NSCLC.
, 百拇医药
【Key words】 p16 gene Rb gene Immunohistochemistry Quantitative analysis
Rb与p16是近几年来人们熟悉的抑癌基因，两者都作用于细胞周期G1期。研究表明，细胞周期的许多调节因子参与了人类恶性肿瘤的形成，尤其是与G1期相关的各种调节因子，如CDKs抑制因子p16与抑癌基因产物p53,Rb等[1，2]，引起了人们的广泛注意。已有文献报道[3，4]，在肿瘤细胞系中，Rb与p16基因表达产物之间有一种显著的反向相关关系。本文同步采用免疫组化与图像定量分析技术对非小细胞肺癌中Rb,p16基因表达及其有否相关调节作用进行探讨。
1 材料与方法
1.1 标本 52例原发非小细胞肺癌的石蜡包埋组织标本取自南方医院病理科。按WHO标准分类，鳞癌23例，腺癌20例，大细胞癌9例。其中19例带淋巴结转移灶，蜡块制成5 μm切片，载玻片预涂多聚赖氨酸，切片置于恒温烤箱60℃烤片2 h，室温无尘保存。
, http://www.100md.com
1.2 抗体 兔抗人Rb(C-15)，p16(N-10)多克隆抗体为美国Santa Cruz生物技术公司产品。抗体稀释度为Rb(1∶50)，p16(1∶30)。LSAB试剂盒购自福州迈新公司。
1.3 免疫组化染色及结果判断 采用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液微波抗原修复LSAB方法，DAB显色。阳性对照和阴性对照的设置：用我科已知阳性染色的乳腺癌切片为每次实验的阳性对照，用PBS代替一抗设为阴性对照。结果判断：采用双盲法，以细胞核、细胞浆或细胞膜呈清晰棕黄色为阳性，根据阳性细胞比例分为：“-”无明显阳性细胞，“+”阳性细胞数小于25%，“++”阳性细胞数25%～50%，“+++”阳性细胞数>50%。
1.4 图像定量相关分析 采用Quantimet 520+图像分析仪(德国)。先用40倍物镜观察，每例切片随机测10个视场，获得阳性细胞百分率P/A(%)；再在同一区域图像中用20倍物镜测量100～200个阳性细胞的平均光密度值(AOD)，将阳性细胞百分率P/A乘以阳性细胞平均光密度值AOD，得出阳性水平指数(positive level index， PLI)，使用PLI值进行直线相关统计分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Rb,p16免疫染色结果 正常支气管粘膜上皮和肺泡上皮可见Rb及p16较高水平的表达，定位于细胞浆内，肿瘤间质未见阳性表达。52例NSCLC石蜡标本中，pRb的阳性率为78.8%(41/52)，定位于肿瘤细胞胞浆中。p16蛋白主要定位于肿瘤细胞的胞浆中，阳性产物呈弥漫或散在棕黄色分布，在非小细胞肺癌中表达的总阳性率为84.6%(44/52)。将pRb免疫染色结果与p16染色结果对比分析，11例pRb表达阴性的肿瘤，其p16表达皆为强阳性，而30/52例pRb表达较强的肿瘤中，其p16蛋白表达有23例为低水平表达或阴性，8例p16表达缺失的肺癌中，pRb表达全部强阳性。
2.2 Rb,p16表达图像定量相关分析 随机选取p16,pRb双重阳性病例5例。其中pRb和p16阳性细胞百分率与平均光密度值见表1。PLI=阳性细胞百分率(P/A)×阳性细胞平均光密度值(AOD)。对表中pRb与p16的两组PLI数据进行直线相关统计处理，得出相关系数r=0.944，P<0.01，具有显著负相关性。
, 百拇医药
表1 p16阳性和pRb双重阳性表达的PLI值 p16阳性
pRb阳性
P/A(%)
AOD
PLI
P/A(%)
AOD
PLI
87.87
0.435 4
0.382 6
49.73
, http://www.100md.com
0.601 0
0.298 9
33.22
1.794 7
0.596 2
67.62
0.129 4
0.087 5
43.73
1.674 6
0.732 3
23.63
, http://www.100md.com
0.396 1
0.093 6
100
0.976 6
0.976 6
15.30
0.942 2
0.144 2
21.76
0.422 8
0.092 0
97.98
, http://www.100md.com
1.363 1
1.335 6
3 讨论
本实验结果表明，在原发性非小细胞肺癌中，Rb与p16基因的表达之间存在着明显的负相关关系。Rb基因定位于人类染色体13q14上，正常Rb基因组DNA长约200 kb，含27个外显子，编码一组相对分子质量(旧称分子量)为200 000的DNA结合蛋白[5]。正常细胞周期中，pRb作为CDK4/cyclin D1复合物的主要底物，受其磷酸化失活调控，在G1期中，pRb以去磷酸化活性形式存在，并作用于EIF及ATF2等转录因子，发挥其负调控细胞生长作用。p16基因近来被认为是一个与多种肿瘤发生有关的新的肿瘤抑制基因。在人类，该基因主要通过其蛋白产物与细胞周期蛋白依赖性激酶4或6(CDK4或CDK6)竞争结合，直接阻止后二者与细胞周期蛋白1(cyclin D1)形成复合物，从而导致该复合物活性丧失，使细胞周期停滞在G1/S期，因而抑制细胞增殖，呈现抑癌基因作用[6]。Otterson等[3]通过肺癌肿瘤细胞系的研究发现野生型Rb与p16蛋白的存在之间有一种显著的反向相关关系，即p16蛋白缺失常常只发生在保留野生型Rb的细胞内，一旦pRb基因产物表达缺乏时，则p16蛋白的检测水平往往是正常的。与肿瘤细胞系相比，我们采用原发性肿瘤组织切片标本，结合组织形态与图像定量分析技术，能更准确可靠地反映体内p16基因与Rb基因表达的相关关系。
, http://www.100md.com
本文结果中，8例p16表达阴性者pRb皆高表达，而11例pRb缺失者则p16为强阳性，图像定量相关分析统计结果也获得了pRb,p16双重阳性标本中两者的负相关性结果，证实了p16与pRb表达之间的负相关关系。同时，这一结果也可能证实了pRb与p16之间包含着一个CDKS，Cyclins及转录因子等介导的细胞周期负反馈调节环路[1]。在非小细胞肺癌发生中，这个调节环路意味着Rb与p16二者中任何一个表达缺失导致的调节环路中断都足以使G1期细胞失调性增殖，单独高表达的p16蛋白或磷酸化Rb蛋白都无法发挥其阻止细胞增殖周期由G1期进入S期的负调控作用。
参考文献
1 Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and p16 INK4 expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res, 1995, 55:505
, http://www.100md.com
2 Unger T, Nau M, Segal S, et al. p53: a transdominant regulator of transcription whose function is ablated by mutations occuring in human cancer. EMBO J, 1992, 11:1383
3 Otterson GA, Kratzke RA, Coxon A, et al. Absence of p16 INK4 protein is restricted to the subset of lung cancer lines that retains wildtype Rb. Oncogene, 1994, 9(11):3375
4 Mieke Schutte, Ralphh Hruban, Joseph Geradts, et al. Abrogation of the Rb/p16 tumor-suppressive pathway in virtully all pancreatic carcinoma. Cancer Res, 1997, 57:3126
5 Harbour JW, Lai SL, Whang PJ, et al. Abnormalities in structure and expression of human retinoblastoma gene in SCLC. Science, 1988, 24(2):353
6 Kelley MJ, Nakagawa K, Steinberg SM, et al. Differential inactivation of CDKN2 and Rb protein in non-small cell lung cancer cell lines. J Natl Cancer Inst, 1995, 87(10):756, 百拇医药
单位：李伟峰 邹霞英(广州军区广州总医院呼吸内科(510010))；赵彤 朱梅刚(第一军医大学病理教研室(510515))
关键词：p16基因；Rb基因；免疫组织化学；图像分析
广东医学991109 【摘要】 目的 检测Rb及p16基因产物在非小细胞肺癌中的表达特征。方法 采用免疫组化和图象定量相关分析技术比较了Rb与p16的表达情况及相互关系。结果 11例Rb表达阴性的肿瘤，p16蛋白表达皆为强阳性，而30例Rb表达阳性程度较高(++)～(+++)的标本中，23例显示p16表达阴性或低水平表达，图像定量相关分析显示Rb失活与p16表达之间存在负相关关系。结论 提示NSCLC发生发展的分子遗传机制可能涉及p16及Rb基因在内的细胞周期G1期负反馈调节通路异常。
, http://www.100md.com Expression of Rb and p16 in non-small cell lung cancer
Li Weifeng, Zhao Tong, Zou Xiaying, et al.
Department of Respiratory Disease, Guangzhou General Hospital of Command of PLA, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To investigate the expression of Rb and p16 genes and their correlation in non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Immunohistochemistry and computerized image analysis were used to detected Rb protein in 52 primary NSCLC specimens, which was correlated to p16 expression.Results 23 of 30 Rb positive cancers had no or low p16 expression, while 11 Rb-negative cancers showed high levels of p16 protein. Thus, there was a reciprocity between Rb inactivation and p16 expression in NSCLC.Conclusion Abnormality in the negative feedback regulatory pathway of p16 and Rb genes might be involved in the molecular pathogenesis of NSCLC.
, 百拇医药
【Key words】 p16 gene Rb gene Immunohistochemistry Quantitative analysis
Rb与p16是近几年来人们熟悉的抑癌基因，两者都作用于细胞周期G1期。研究表明，细胞周期的许多调节因子参与了人类恶性肿瘤的形成，尤其是与G1期相关的各种调节因子，如CDKs抑制因子p16与抑癌基因产物p53,Rb等[1，2]，引起了人们的广泛注意。已有文献报道[3，4]，在肿瘤细胞系中，Rb与p16基因表达产物之间有一种显著的反向相关关系。本文同步采用免疫组化与图像定量分析技术对非小细胞肺癌中Rb,p16基因表达及其有否相关调节作用进行探讨。
1 材料与方法
1.1 标本 52例原发非小细胞肺癌的石蜡包埋组织标本取自南方医院病理科。按WHO标准分类，鳞癌23例，腺癌20例，大细胞癌9例。其中19例带淋巴结转移灶，蜡块制成5 μm切片，载玻片预涂多聚赖氨酸，切片置于恒温烤箱60℃烤片2 h，室温无尘保存。
, http://www.100md.com
1.2 抗体 兔抗人Rb(C-15)，p16(N-10)多克隆抗体为美国Santa Cruz生物技术公司产品。抗体稀释度为Rb(1∶50)，p16(1∶30)。LSAB试剂盒购自福州迈新公司。
1.3 免疫组化染色及结果判断 采用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液微波抗原修复LSAB方法，DAB显色。阳性对照和阴性对照的设置：用我科已知阳性染色的乳腺癌切片为每次实验的阳性对照，用PBS代替一抗设为阴性对照。结果判断：采用双盲法，以细胞核、细胞浆或细胞膜呈清晰棕黄色为阳性，根据阳性细胞比例分为：“-”无明显阳性细胞，“+”阳性细胞数小于25%，“++”阳性细胞数25%～50%，“+++”阳性细胞数>50%。
1.4 图像定量相关分析 采用Quantimet 520+图像分析仪(德国)。先用40倍物镜观察，每例切片随机测10个视场，获得阳性细胞百分率P/A(%)；再在同一区域图像中用20倍物镜测量100～200个阳性细胞的平均光密度值(AOD)，将阳性细胞百分率P/A乘以阳性细胞平均光密度值AOD，得出阳性水平指数(positive level index， PLI)，使用PLI值进行直线相关统计分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Rb,p16免疫染色结果 正常支气管粘膜上皮和肺泡上皮可见Rb及p16较高水平的表达，定位于细胞浆内，肿瘤间质未见阳性表达。52例NSCLC石蜡标本中，pRb的阳性率为78.8%(41/52)，定位于肿瘤细胞胞浆中。p16蛋白主要定位于肿瘤细胞的胞浆中，阳性产物呈弥漫或散在棕黄色分布，在非小细胞肺癌中表达的总阳性率为84.6%(44/52)。将pRb免疫染色结果与p16染色结果对比分析，11例pRb表达阴性的肿瘤，其p16表达皆为强阳性，而30/52例pRb表达较强的肿瘤中，其p16蛋白表达有23例为低水平表达或阴性，8例p16表达缺失的肺癌中，pRb表达全部强阳性。
2.2 Rb,p16表达图像定量相关分析 随机选取p16,pRb双重阳性病例5例。其中pRb和p16阳性细胞百分率与平均光密度值见表1。PLI=阳性细胞百分率(P/A)×阳性细胞平均光密度值(AOD)。对表中pRb与p16的两组PLI数据进行直线相关统计处理，得出相关系数r=0.944，P<0.01，具有显著负相关性。
, 百拇医药
表1 p16阳性和pRb双重阳性表达的PLI值 p16阳性
pRb阳性
P/A(%)
AOD
PLI
P/A(%)
AOD
PLI
87.87
0.435 4
0.382 6
49.73
, http://www.100md.com
0.601 0
0.298 9
33.22
1.794 7
0.596 2
67.62
0.129 4
0.087 5
43.73
1.674 6
0.732 3
23.63
, http://www.100md.com
0.396 1
0.093 6
100
0.976 6
0.976 6
15.30
0.942 2
0.144 2
21.76
0.422 8
0.092 0
97.98
, http://www.100md.com
1.363 1
1.335 6
3 讨论
本实验结果表明，在原发性非小细胞肺癌中，Rb与p16基因的表达之间存在着明显的负相关关系。Rb基因定位于人类染色体13q14上，正常Rb基因组DNA长约200 kb，含27个外显子，编码一组相对分子质量(旧称分子量)为200 000的DNA结合蛋白[5]。正常细胞周期中，pRb作为CDK4/cyclin D1复合物的主要底物，受其磷酸化失活调控，在G1期中，pRb以去磷酸化活性形式存在，并作用于EIF及ATF2等转录因子，发挥其负调控细胞生长作用。p16基因近来被认为是一个与多种肿瘤发生有关的新的肿瘤抑制基因。在人类，该基因主要通过其蛋白产物与细胞周期蛋白依赖性激酶4或6(CDK4或CDK6)竞争结合，直接阻止后二者与细胞周期蛋白1(cyclin D1)形成复合物，从而导致该复合物活性丧失，使细胞周期停滞在G1/S期，因而抑制细胞增殖，呈现抑癌基因作用[6]。Otterson等[3]通过肺癌肿瘤细胞系的研究发现野生型Rb与p16蛋白的存在之间有一种显著的反向相关关系，即p16蛋白缺失常常只发生在保留野生型Rb的细胞内，一旦pRb基因产物表达缺乏时，则p16蛋白的检测水平往往是正常的。与肿瘤细胞系相比，我们采用原发性肿瘤组织切片标本，结合组织形态与图像定量分析技术，能更准确可靠地反映体内p16基因与Rb基因表达的相关关系。
, http://www.100md.com
本文结果中，8例p16表达阴性者pRb皆高表达，而11例pRb缺失者则p16为强阳性，图像定量相关分析统计结果也获得了pRb,p16双重阳性标本中两者的负相关性结果，证实了p16与pRb表达之间的负相关关系。同时，这一结果也可能证实了pRb与p16之间包含着一个CDKS，Cyclins及转录因子等介导的细胞周期负反馈调节环路[1]。在非小细胞肺癌发生中，这个调节环路意味着Rb与p16二者中任何一个表达缺失导致的调节环路中断都足以使G1期细胞失调性增殖，单独高表达的p16蛋白或磷酸化Rb蛋白都无法发挥其阻止细胞增殖周期由G1期进入S期的负调控作用。
参考文献
1 Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and p16 INK4 expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res, 1995, 55:505
, http://www.100md.com
2 Unger T, Nau M, Segal S, et al. p53: a transdominant regulator of transcription whose function is ablated by mutations occuring in human cancer. EMBO J, 1992, 11:1383
3 Otterson GA, Kratzke RA, Coxon A, et al. Absence of p16 INK4 protein is restricted to the subset of lung cancer lines that retains wildtype Rb. Oncogene, 1994, 9(11):3375
4 Mieke Schutte, Ralphh Hruban, Joseph Geradts, et al. Abrogation of the Rb/p16 tumor-suppressive pathway in virtully all pancreatic carcinoma. Cancer Res, 1997, 57:3126
5 Harbour JW, Lai SL, Whang PJ, et al. Abnormalities in structure and expression of human retinoblastoma gene in SCLC. Science, 1988, 24(2):353
6 Kelley MJ, Nakagawa K, Steinberg SM, et al. Differential inactivation of CDKN2 and Rb protein in non-small cell lung cancer cell lines. J Natl Cancer Inst, 1995, 87(10):756, 百拇医药