大鼠胰腺缺血/再灌注损伤的实验研究
作者：吕洪光 邢 军 王 智 薛东波 邢 勇
单位：吕洪光 邢 军 王 智 薛东波 哈尔滨医科大学附属第一医院普外一科，150001；邢 勇 黑河市第一人民医院外科
关键词：胰腺；缺血/再灌注；细胞凋亡；氧自由基；钙超载；异搏定
摘要摘要：目的 观察大鼠胰腺缺血/再灌注损伤对胰腺组织氧自由基(MDA)、胰腺组织钙、胰腺细胞凋亡等的变化及异搏定对缺血/再灌注损伤胰腺的保护作用。方法 采用钳闭大鼠腹腔干、肠系膜上动脉制备胰腺缺血/再灌注损伤模型。取Wistar大鼠63只，随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注异搏定保护组。结果 缺血/再灌注异搏定保护组大鼠胰腺组织MDA、组织钙、胰腺细胞凋亡明显较缺血/再灌注组低，病理改变轻。缺血/再灌注组胰腺细胞凋亡与MDA、组织钙存在相关性。结论 异搏定降低胰腺组织MDA和组织钙含量，抑制细胞凋亡，保护缺血/再灌注损伤的胰腺；胰腺缺血/再灌注损伤中存在细胞凋亡机制的参与；细胞凋亡存在MDA和组织钙超载的参与。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q-331；R 576
文献标识码：A
文章编号：1002-1949(1999)11-0644-02
Experimental study of ischemic reperfusion injury in pancrease of rats
LU Hong-guang,XING Jun,WANG Zhi,et al.
Genery Surgery Department,The 1st Affilited Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China
Abstract Objective In order to detect MDA,calcium,apoptosis in pancrease with ischemic-reperfusion injury,and observe the effect of verapamil in preventing ischemic-reperfusion injury.Methods Ischemic-reperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and the celica artery of 63 rats.Results Verapamil can decrease the level of MDA,calcium and apoptosis.There are correlative relation beween apoptosis and MDA,calcium.Conclusions Apoptosis is one of the main mechanisms during ischemic-reperfusion progress.MDA and calcium overload can promote apoptosis.
, http://www.100md.com
Key words Ischemic-reperfusion injury； Apoptosis； Oxygen free radical； Calcium overload； Verapamil
1 资料与方法
1.1 动物分组与模型制备
Wistar大鼠63只，体重200±25 g，雄雌不拘。随机分为假手术组、缺血/再灌注组和异搏定保护组。术前12 h禁食不禁水，0.5%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹正中切开，找到腹腔干和肠系膜上动脉；假手术组不用血管铗钳闭腹腔干和肠系膜上动脉；缺血/再灌注组和异搏定保护组用血管铗钳闭腹腔干和肠系膜上动脉，分别钳闭15 min、30 min、60 min，再灌注6 h。异搏定保护组于再灌注前5 min，大鼠尾静脉注射异搏定溶液0.1 mg/100 g，容积0.25 ml/100 mg。活杀，取胰腺胰体组织后，去离子水漂洗三次。每只大鼠胰腺组织分二部分：一部分-70℃深低温保存，做MDA和Ca++测定；一部分当日配多聚甲醛液固定24 h，PBS液漂洗半小时，70%酒精保存，做病理分析、细胞凋亡及相关基因的测定。
, http://www.100md.com
1.2 指标测定
荧光法测定丙二醛(MDA)；原子吸收光法测定组织钙；组织病理光镜检测；TUNEL法细胞凋亡检测；免疫组化法检测C-myc、Bcl-2基因的表达(S-P法)。
1.3 所有数据以
±s表示，采用SAS软件多元方差分析(χ2检验)，MDA、组织钙、TUNEL阳性细胞百分比的相关性检验。
2 结果
2.1 光镜观察
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①假手术组：血管周围和腺泡细胞结构正常，酶原颗粒嗜蓝染，较丰富，核较清楚。
②缺血/再灌注组：缺血15 min者，间质轻度水肿，少量出血，血管周围少量炎细胞浸润，中性粒细胞为主，有少量淋巴细胞；缺血30 min者，间质出血较明显，小静脉内微血栓形成(纤维素、血小板为主)，多处间质血管出血，未出血处可见水肿，局限性腺泡溶解、坏死，中性粒细胞浸润；缺血60 min者间质出血明显，较彻底坏死区，溶解性坏死，核及细胞结构消炎，炎细胞浸润，少量钙盐沉着，酶原颗粒大量减少或消失。
③异搏定保护组：缺血15min者，间质水肿轻微，炎性细胞浸润轻微，少量；缺血30 min者，间质少量出血，水肿轻微，部分腺泡细胞胞浆酶原颗粒减少；缺血60 min者，局限性坏死，面积小且局限，少量出血，中等量炎细胞浸润。
2.2 丙二醛、组织钙、细胞凋亡的检测结果
, 百拇医药
表1 缺血15 min组织MDA、Ca++、细胞凋亡检测结果
组 别
MDA(nmol/g湿重)
组织钙(μg/g干重)
细胞凋亡(%)
假手术组
9.014±2.024
88.857±17.468
3.000±1.633
缺血/再灌注组
20.131±1.223*
, http://www.100md.com
215.428±24.839*
28.286±3.251*
异搏定组
17.981±2.132*△
142.857±19.039*△△
19.571±2.991*△△
*：与假手术组相比P<0.01 △：与缺血/再灌注组相比P<0.05 △△：与缺血/再灌注组相比P<0.01表2 缺血30 min组织MDA、Ca++、细胞凋亡检测结果
组 别
, http://www.100md.com
MDA(nmol/g湿重)
组织钙(μg/g干重)
细胞凋亡(%)
假手术组
9.097±2.089
102.429±17.952
2.714±1.976
缺血/再灌注组
34.994±2.685*
470.571±31.973*
44.857±3.132*
, 百拇医药
异搏定组
25.259±3.335*△
411.143±55.846*△
33.571±6.133*△△
*：与假手术组相比P<0.01 △：与缺血/再灌注组相比P<0.05 △△：与缺血/再灌注组相比P<0.01表3 缺血60 min组织MDA、Ca++、细胞凋亡检测结果
组 别
MDA(nmol/g湿重)
组织钙(μg/g干重)
细胞凋亡(%)
, 百拇医药
假手术组
9.981±3.275
124.871±50.829
3.428±2.370
缺血/再灌注组
41.274±3.792*
585.000±39.188*
46.571±4.503*
异搏定组
37.124±2.686*△△
, 百拇医药
607.143±62.060*△
46.142±3.024*△
*：与假手术组相比P<0.01 △：与缺血/再灌注组相比P<0.05 △△：与缺血/再灌注组相比P<0.05表4 缺血/再灌注组缺血各时段组织MDA、组织钙、细胞凋亡百分数相关分析
缺血时段
MDA与Ca++
MDA与凋亡百分数
Ca++与凋亡百分数
r
P
, http://www.100md.com
r
P
r
P
缺血15 min
0.7746
<0.01
0.6927
<0.05
0.8485
<0.05
缺血30 min
0.6496
, http://www.100md.com
<0.01
0.6578
<0.01
0.7499
<0.01
缺血60 min
0.6574
>0.05
0.6494
>0.05
0.5232
>0.05
, 百拇医药 假手术组和异搏定保护组在缺血各时段三者没有相关；缺血/再灌注组在缺血15 min和30 min时，三者存在正相关，在缺血60 min时三者不存在相关。
2.3 凋亡相关基因Bcl-2和C-myc的表达
假手术组基因未见Bcl-2和C-myc的表达。凋亡抑制基因Bcl-2的表达在异搏定保护组15 min、30 min缺血时较缺血/再灌注组同缺血时段增加，缺血30 min时Bcl-2表达明显。两组在60 min缺血时段Bcl-2的表达基本相同。
凋亡双向调节基因C-myc的表达在异搏定保护组15 min、30 min、60 min缺血时段较缺血/再灌注组同缺血时段增加，以30 min缺血时段增加明显。
3 讨论
, 百拇医药
在Medline中阐明缺血/再灌注过程中存在着细胞凋亡现象可能是胰腺炎的发病机理[1]。目前国内外对缺血/再灌注的研究：①再灌注过程中的无复流现象；②再灌注过程中远处组织和器官的损伤；③中性白细胞在缺血/再灌注损伤中的作用；④内皮因子在缺血/再灌注损伤中的作用(如PGI2、TXA2、白三烯β4、内皮素、NO、内皮组织松驰因子，血小板活化因子、补体、细胞因子等)。
本实验显示：缺血/再灌注损伤时除有氧自由基(MDA)和组织钙超载的参与，又有细胞凋亡机制的参与；异搏定具有细胞保护的作用，其最佳应用时期是在胰腺缺血30 min之内，并在再灌注前静脉注射；胰腺缺血/再灌注模型中可见氧自由基(MDA)、组织钙、细胞凋亡三者之间存在相关性，说明三者之间存在有统计联系的因果关系。它们三者相互促进、相互作用，在缺血/再灌注损伤的发生、发展中互为因果，共同导致细胞的不可逆损伤；凋亡相关基因Bcl-2的表达在异搏定保护组升高，说明异搏定可以减缓细胞凋亡。Bcl-2是细胞凋亡的抑制基因，虽然它不影响细胞的增殖活性，但它的过度表达可以抑制细胞的凋亡[2]，这种作用与细胞存在的周期无关[3]；凋亡相关基因 C-myc表达在异搏定保护组升高，说明凋亡双向调节基因C-myc在本实验中起到抑制细胞凋亡的作用。
, http://www.100md.com
缺血/再灌注中产生的大量氧自由基引发脂质过氧化，使膜受体、膜蛋白酶和离子通道的脂质微循环改变，引起它们的功能障碍，Na--K+-ATP酶、Ca++-ATP酶失活，细胞钙内流增加超载，钙超载又促进氧自由基生成，两者互为因果、互相作用。Ca++在胞质和线粒体中大量蓄积[4～6]。细胞钙超载又使胞核内核酸酶、钙调素(CaM)、蛋白激酶等激活而发挥生物学效应，促进细胞凋亡的发生。
参考文献
[1]Fujimoto K,Hosotani R,Wada M,et al.Ischemia-reperfusion injury on the pancreas in rats:identification of acirar cell apoptosis[J].J Surg Res 1997，71(2):127-136.
, 百拇医药
[2]Maulik N,et al.Oxidative stress developed during the reperfusion of ischemic myocardium induces apoptosis[J].Free Radic Biol Med,1998，24(5):869.
[3]Eujimoto K,et al.Role of neutrophils in cerulein-induced pancreatitis in rats:possible involvement of apoptosis[J].Digestion,1997, 58(5):421.
[4]Van Doijen B，et al.Prostanoid imbalance in experimental acute necrotizing pancreatitis in rats[J].Scard J Gastroenterol, 1988，23(2):193.
, 百拇医药
[5]Lake-Bakaar G,et al.Calcium channel blockade protects against the development of diet induced pancreatitis in mice[J].Castroenterology, 1989，96:A282.
[6]Cheung JY,et al.Calcium and ischemic injury[J].New Eng1 J Med, 1986，314(26):1670.
收稿：1999-02-19
修回：1999-06-07, 百拇医药
单位：吕洪光 邢 军 王 智 薛东波 哈尔滨医科大学附属第一医院普外一科，150001；邢 勇 黑河市第一人民医院外科
关键词：胰腺；缺血/再灌注；细胞凋亡；氧自由基；钙超载；异搏定
摘要摘要：目的 观察大鼠胰腺缺血/再灌注损伤对胰腺组织氧自由基(MDA)、胰腺组织钙、胰腺细胞凋亡等的变化及异搏定对缺血/再灌注损伤胰腺的保护作用。方法 采用钳闭大鼠腹腔干、肠系膜上动脉制备胰腺缺血/再灌注损伤模型。取Wistar大鼠63只，随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注异搏定保护组。结果 缺血/再灌注异搏定保护组大鼠胰腺组织MDA、组织钙、胰腺细胞凋亡明显较缺血/再灌注组低，病理改变轻。缺血/再灌注组胰腺细胞凋亡与MDA、组织钙存在相关性。结论 异搏定降低胰腺组织MDA和组织钙含量，抑制细胞凋亡，保护缺血/再灌注损伤的胰腺；胰腺缺血/再灌注损伤中存在细胞凋亡机制的参与；细胞凋亡存在MDA和组织钙超载的参与。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q-331；R 576
文献标识码：A
文章编号：1002-1949(1999)11-0644-02
Experimental study of ischemic reperfusion injury in pancrease of rats
LU Hong-guang,XING Jun,WANG Zhi,et al.
Genery Surgery Department,The 1st Affilited Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China
Abstract Objective In order to detect MDA,calcium,apoptosis in pancrease with ischemic-reperfusion injury,and observe the effect of verapamil in preventing ischemic-reperfusion injury.Methods Ischemic-reperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and the celica artery of 63 rats.Results Verapamil can decrease the level of MDA,calcium and apoptosis.There are correlative relation beween apoptosis and MDA,calcium.Conclusions Apoptosis is one of the main mechanisms during ischemic-reperfusion progress.MDA and calcium overload can promote apoptosis.
, http://www.100md.com
Key words Ischemic-reperfusion injury； Apoptosis； Oxygen free radical； Calcium overload； Verapamil
1 资料与方法
1.1 动物分组与模型制备
Wistar大鼠63只，体重200±25 g，雄雌不拘。随机分为假手术组、缺血/再灌注组和异搏定保护组。术前12 h禁食不禁水，0.5%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹正中切开，找到腹腔干和肠系膜上动脉；假手术组不用血管铗钳闭腹腔干和肠系膜上动脉；缺血/再灌注组和异搏定保护组用血管铗钳闭腹腔干和肠系膜上动脉，分别钳闭15 min、30 min、60 min，再灌注6 h。异搏定保护组于再灌注前5 min，大鼠尾静脉注射异搏定溶液0.1 mg/100 g，容积0.25 ml/100 mg。活杀，取胰腺胰体组织后，去离子水漂洗三次。每只大鼠胰腺组织分二部分：一部分-70℃深低温保存，做MDA和Ca++测定；一部分当日配多聚甲醛液固定24 h，PBS液漂洗半小时，70%酒精保存，做病理分析、细胞凋亡及相关基因的测定。
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1.2 指标测定
荧光法测定丙二醛(MDA)；原子吸收光法测定组织钙；组织病理光镜检测；TUNEL法细胞凋亡检测；免疫组化法检测C-myc、Bcl-2基因的表达(S-P法)。
1.3 所有数据以
±s表示，采用SAS软件多元方差分析(χ2检验)，MDA、组织钙、TUNEL阳性细胞百分比的相关性检验。2 结果
2.1 光镜观察
, http://www.100md.com
①假手术组：血管周围和腺泡细胞结构正常，酶原颗粒嗜蓝染，较丰富，核较清楚。
②缺血/再灌注组：缺血15 min者，间质轻度水肿，少量出血，血管周围少量炎细胞浸润，中性粒细胞为主，有少量淋巴细胞；缺血30 min者，间质出血较明显，小静脉内微血栓形成(纤维素、血小板为主)，多处间质血管出血，未出血处可见水肿，局限性腺泡溶解、坏死，中性粒细胞浸润；缺血60 min者间质出血明显，较彻底坏死区，溶解性坏死，核及细胞结构消炎，炎细胞浸润，少量钙盐沉着，酶原颗粒大量减少或消失。
③异搏定保护组：缺血15min者，间质水肿轻微，炎性细胞浸润轻微，少量；缺血30 min者，间质少量出血，水肿轻微，部分腺泡细胞胞浆酶原颗粒减少；缺血60 min者，局限性坏死，面积小且局限，少量出血，中等量炎细胞浸润。
2.2 丙二醛、组织钙、细胞凋亡的检测结果
, 百拇医药
表1 缺血15 min组织MDA、Ca++、细胞凋亡检测结果
组 别
MDA(nmol/g湿重)
组织钙(μg/g干重)
细胞凋亡(%)
假手术组
9.014±2.024
88.857±17.468
3.000±1.633
缺血/再灌注组
20.131±1.223*
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215.428±24.839*
28.286±3.251*
异搏定组
17.981±2.132*△
142.857±19.039*△△
19.571±2.991*△△
*：与假手术组相比P<0.01 △：与缺血/再灌注组相比P<0.05 △△：与缺血/再灌注组相比P<0.01表2 缺血30 min组织MDA、Ca++、细胞凋亡检测结果
组 别
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MDA(nmol/g湿重)
组织钙(μg/g干重)
细胞凋亡(%)
假手术组
9.097±2.089
102.429±17.952
2.714±1.976
缺血/再灌注组
34.994±2.685*
470.571±31.973*
44.857±3.132*
, 百拇医药
异搏定组
25.259±3.335*△
411.143±55.846*△
33.571±6.133*△△
*：与假手术组相比P<0.01 △：与缺血/再灌注组相比P<0.05 △△：与缺血/再灌注组相比P<0.01表3 缺血60 min组织MDA、Ca++、细胞凋亡检测结果
组 别
MDA(nmol/g湿重)
组织钙(μg/g干重)
细胞凋亡(%)
, 百拇医药
假手术组
9.981±3.275
124.871±50.829
3.428±2.370
缺血/再灌注组
41.274±3.792*
585.000±39.188*
46.571±4.503*
异搏定组
37.124±2.686*△△
, 百拇医药
607.143±62.060*△
46.142±3.024*△
*：与假手术组相比P<0.01 △：与缺血/再灌注组相比P<0.05 △△：与缺血/再灌注组相比P<0.05表4 缺血/再灌注组缺血各时段组织MDA、组织钙、细胞凋亡百分数相关分析
缺血时段
MDA与Ca++
MDA与凋亡百分数
Ca++与凋亡百分数
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缺血15 min
0.7746
<0.01
0.6927
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0.8485
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缺血30 min
0.6496
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0.6578
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0.7499
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缺血60 min
0.6574
>0.05
0.6494
>0.05
0.5232
>0.05
, 百拇医药 假手术组和异搏定保护组在缺血各时段三者没有相关；缺血/再灌注组在缺血15 min和30 min时，三者存在正相关，在缺血60 min时三者不存在相关。
2.3 凋亡相关基因Bcl-2和C-myc的表达
假手术组基因未见Bcl-2和C-myc的表达。凋亡抑制基因Bcl-2的表达在异搏定保护组15 min、30 min缺血时较缺血/再灌注组同缺血时段增加，缺血30 min时Bcl-2表达明显。两组在60 min缺血时段Bcl-2的表达基本相同。
凋亡双向调节基因C-myc的表达在异搏定保护组15 min、30 min、60 min缺血时段较缺血/再灌注组同缺血时段增加，以30 min缺血时段增加明显。
3 讨论
, 百拇医药
在Medline中阐明缺血/再灌注过程中存在着细胞凋亡现象可能是胰腺炎的发病机理[1]。目前国内外对缺血/再灌注的研究：①再灌注过程中的无复流现象；②再灌注过程中远处组织和器官的损伤；③中性白细胞在缺血/再灌注损伤中的作用；④内皮因子在缺血/再灌注损伤中的作用(如PGI2、TXA2、白三烯β4、内皮素、NO、内皮组织松驰因子，血小板活化因子、补体、细胞因子等)。
本实验显示：缺血/再灌注损伤时除有氧自由基(MDA)和组织钙超载的参与，又有细胞凋亡机制的参与；异搏定具有细胞保护的作用，其最佳应用时期是在胰腺缺血30 min之内，并在再灌注前静脉注射；胰腺缺血/再灌注模型中可见氧自由基(MDA)、组织钙、细胞凋亡三者之间存在相关性，说明三者之间存在有统计联系的因果关系。它们三者相互促进、相互作用，在缺血/再灌注损伤的发生、发展中互为因果，共同导致细胞的不可逆损伤；凋亡相关基因Bcl-2的表达在异搏定保护组升高，说明异搏定可以减缓细胞凋亡。Bcl-2是细胞凋亡的抑制基因，虽然它不影响细胞的增殖活性，但它的过度表达可以抑制细胞的凋亡[2]，这种作用与细胞存在的周期无关[3]；凋亡相关基因 C-myc表达在异搏定保护组升高，说明凋亡双向调节基因C-myc在本实验中起到抑制细胞凋亡的作用。
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缺血/再灌注中产生的大量氧自由基引发脂质过氧化，使膜受体、膜蛋白酶和离子通道的脂质微循环改变，引起它们的功能障碍，Na--K+-ATP酶、Ca++-ATP酶失活，细胞钙内流增加超载，钙超载又促进氧自由基生成，两者互为因果、互相作用。Ca++在胞质和线粒体中大量蓄积[4～6]。细胞钙超载又使胞核内核酸酶、钙调素(CaM)、蛋白激酶等激活而发挥生物学效应，促进细胞凋亡的发生。
参考文献
[1]Fujimoto K,Hosotani R,Wada M,et al.Ischemia-reperfusion injury on the pancreas in rats:identification of acirar cell apoptosis[J].J Surg Res 1997，71(2):127-136.
, 百拇医药
[2]Maulik N,et al.Oxidative stress developed during the reperfusion of ischemic myocardium induces apoptosis[J].Free Radic Biol Med,1998，24(5):869.
[3]Eujimoto K,et al.Role of neutrophils in cerulein-induced pancreatitis in rats:possible involvement of apoptosis[J].Digestion,1997, 58(5):421.
[4]Van Doijen B，et al.Prostanoid imbalance in experimental acute necrotizing pancreatitis in rats[J].Scard J Gastroenterol, 1988，23(2):193.
, 百拇医药
[5]Lake-Bakaar G,et al.Calcium channel blockade protects against the development of diet induced pancreatitis in mice[J].Castroenterology, 1989，96:A282.
[6]Cheung JY,et al.Calcium and ischemic injury[J].New Eng1 J Med, 1986，314(26):1670.
收稿：1999-02-19
修回：1999-06-07, 百拇医药