益肾生血片对再生障碍性贫血模型小鼠造血细胞作用的研究
作者：许勇钢 麻 柔 王洪蓓 王展翔 王洪志 周霭祥 廖军鲜 钟明华
单位：许勇钢 麻 柔 王洪蓓 王展翔 王洪志 中国中医研究院西苑医院血液病研究室，北京 100091；周霭祥 廖军鲜 钟明华 中日友好医院，北京 100029
关键词：益肾生血片；再生障碍性贫血；造血细胞；模型小鼠
中国中医基础医学杂志991108 摘 要：目的 探讨益肾生血片(YSSXT)治疗再生障碍性贫血(AA)的作用机理。方法 用马利兰造成小鼠AA模型，观察该药对AA模型小鼠造血细胞的作用。结果 显示益肾生血片对马利兰引起的造血损伤小鼠骨髓造血干细胞(CFUmix)、粒系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)、有核细胞(MNC)计数、巨核细胞计数和外周血白细胞、血色素和血小板数量的恢复有明显促进作用。结论 保进骨髓造血干细胞增殖是益肾生血片治疗AA的机制之一。
, 百拇医药
再生障碍性贫血(AplasticAnemia,AA)，是由多种因素引起的骨髓造血干细胞、造血微环境损伤及机体免疫机制改变，导致骨髓造血干细胞减少，造血功能衰竭，出现以全血细胞减少为主要表现的综合症。中医认为，AA属于虚痨、虚损、血虚、血证范畴，其发生、发展多因邪毒伤及气血、脏腑(尤其肾及骨髓)，导致血虚及虚劳诸证。本研究采用马利兰造成小鼠AA模型，观察益肾生血片对AA小鼠造血干细胞作用，探讨该药治疗AA作用机理。
材料与方法
1 动物
615小鼠230只，12周龄，雄性；18g～20g；由医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：医动字D01-0387。随机分组，用200只建立AA小鼠模型，30只做正常对照。
2 药物及试剂
益肾生血片，由江苏丹阳药业有限公司提供，为压制益肾生血片(由熟地、补骨脂、黄芪、当归、旱莲草、仙鹤草等中药组成。其功能为补肾生髓，益气生血)药片的原药粉除去赋形剂，每克药粉相当于生药4.2g，用蒸馏水配成40.25%浓度待用；康力隆，广西南宁制药企业集团公司产品，2.0mg/片，用蒸馏水配成0.05%混悬液待用，马利兰片剂(河南鹤壁市制药厂)研碎，丙酮提取4～5次，蒸馏掉丙酮，制成2g/L的混悬液备用；GM-CSF：50μg/支，日本中外制药有限公司产品；IL-3∶0.1ml/支，0.28mg/ml，日本麒麟株式会社产品；EPO：2000u/支，日本麒麟株式会社产品；健马血清：市售标准，军事医学科学院提供。
, 百拇医药
3 造模方法
参照文献[1]，将200只615小鼠，按15mg/kg体重计算剂量给与马利兰，每周一次，腹腔注射，共10周。
4 动物分组
AA模型小鼠随机分为5组：模型对照组、康力隆阳性对照组(4mgkg-1d-1)、益肾生血大剂量组(4.0kg-1d-1)、益肾生血中剂量组(2.0kg-1d-1)、益肾生血小剂量组(1.0gkg-1d-1)；等体积不同浓度灌胃，每日两次，连续灌胃20d，模型对照组以等体积生理盐水灌胃20d，同时用20只正常615小鼠以等体积生理盐水灌胃20d作为正常对照组。
5 观察方法及检测指标
, 百拇医药
5.1 益肾生血片对AA模型小鼠外周血的观察
在给药前、给药后每周及末次给药后次日每只实验小鼠尾静脉取血，用CELL-DYN-1500自动血球计数仪计数，同时涂片经瑞氏染色后，在显微镜下(10×100)计数100个白细胞，进行细胞分类。
5.2 益肾生血片对AA模型小鼠骨髓有核细胞数(MNC)的观察
末次给药后每只实验小鼠各取一侧(右侧)股骨，将骨髓细胞全部冲在4mlMcCOy5A培养液中，用CELL-DYN-1500血球自动计数仪计数骨髓MNC。取胸骨作骨髓细胞涂片，瑞氏染色后，在显微镜下(10×100)计数200有核细胞，进行骨髓细胞分类；同时，全片计数巨核细胞数。
5.3 益肾生血片对AA模型小鼠造血干细胞，造血祖细胞影响
用骨髓造血干细胞培养方法，观察益肾生血片对造血损伤小鼠股骨多向性造血祖细胞(CFU-mix)、红系祖细胞(CUF-E)、粒单系祖细胞(CFU-GM)的影响。停药次日测定小鼠股骨内CFU-mix、CFU-GM、CFU-E数量。方法参照文献[2]。
, 百拇医药
CFU-mix测定：每组小鼠各10只，每只取一根股骨(右侧)，用McCOy5A培养液冲出骨髓细胞，过4号针头制成单细胞悬液，培养体系包括McCOy5A培养液，20%马血清，GM-CSF10ng/ml,IL-310ng/ml,EPO1u/ml，有核细胞105，种入35mm培养皿，每皿1ml培养体系，在37℃，5%CO2条件下培养7d后，低倍镜下按50个以上的细胞团为一个CFUmix进行计数。
CFU-GM测定：培养体系包括McCOy5A培养液，20%马血清，GM-CSF10ng/ml,有核细胞105种入35mm培养皿，每皿1ml培养体系，在37℃，5%CO2条件下培养3d后，低倍镜下按50个以上的细胞团为一个CFU-GM进行计数。
CFU-E测定：培养体系包括McCoy5A培养液，20%马血清，EPO1u/ml,有核细胞0.5×105种入35mm培养皿，每皿1ml培养体系，在37℃，5%CO2条件下培养7d后，低倍镜下按50个以上的细胞团为一个CFU-E进行计数。
, 百拇医药
5.4 病理形态学观察
末次给药后，每组小鼠各10只，取另一侧股骨(左侧)，10%甲醛固定，石蜡或塑料包埋，BRM-SLEE切片机(德国)切片(4μm)，HE染色后进行组织学观察。骨髓观察项目：用10×10网型目尺计数10×40视野30个，记录骨髓造血面积、造血细胞比例、巨核细胞数和血窦数目、骨髓基质等，详细方法参照文献[3]。
6 统计学处理
采用F检验及q检验。
结果
1 益肾生血片对各组AA模型小鼠外周血的影响(见表1)
表1 益肾生血片对AA模型小鼠外周血的影响(
±s) 组 别
, 百拇医药
n
WBC
(×109L)
Hb
(g/L)
RBC
(×1012/L)
Hct
(%)
Plt
(×109/L)
正常对照
, 百拇医药
20
14.50±5.80▲
149±16▲
8.79±0.94▲
35.9±4.2▲
1604±279▲
模型对照
20
6.22±2.42*
121±17*
, 百拇医药
6.97±0.78
28.1±3.6*
929±202*
阳性对照
20
14.14±4.34▲
136±16▲
7.77±1.07*▲
32.5±4.5*▲
1441±277▲
, 百拇医药
大剂量组
20
14.24±5.91▲
146±15▲
8.00±1.36*▲
32.6±6.2*▲
1525±290▲
中剂量组
20
13.09±3.83▲
141±21▲
, http://www.100md.com
7.97±0.84*▲
32.5±3.8*▲
1352±210*▲
小剂量组
20
10.68±3.99▲
129±22*
7.21±1.18*
28.7±4.8*
1175±188*▲
, 百拇医药
注：与正常对照组比较：P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。
结果表明：AA模型对照组的Hb、RBC、Hct、WBC、Plt较正常对照组明显减少(P<0.05)；给予阳性对照药和大、中剂量中药后Hb、RBC、Hct、WBC、Plt与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，部分项目如Hb、WBC、Plt与正常组比已无差异，但RBC、Hct较正常组仍低下；而小剂量中药对部分项目(WBC、Plt)有作用，对部分项目(Hb、RBC、Hct)作用不明显。表明大、中剂量补肾生血片对AA模型小鼠外周血数量的恢复有明显的促进作用。外周血涂片分类粒细胞、淋巴细胞数值各组之间无明显差异(P>0.05，数值未列出)。
2 益肾生血片对AA模型小鼠骨髓有核细胞数(MNC)的影响(见表2)
表2 益肾生血片对AA模型小鼠CFU-mix、CFU-GM、CFU-E的影响(±s) 组 别
, http://www.100md.com
动物数
骨髓MNC
(×107/股骨)
CFUmix
(个/105MNC)
CFU-GM
(个/105MNC)
CFU-E
(个/0.5×105MNC)
正常对照
20
, 百拇医药
2.19±0.42▲
25.5±3.6▲
86.0±5.1▲
121.8±9.8▲
模型对照
20
1.40±0.39*
15.2±3.1
41.9±8.0*
57.0±10.4*
, 百拇医药
阳性对照
20
1.91±0.46▲
24.6±3.5▲
83.1±4.3▲
112.4±8.8▲
大剂量组
20
1.95±0.51▲
25.0±2.9▲
84.9±3.8▲
, http://www.100md.com
114.8±7.9▲
中剂量组
20
1.91±0.31▲
23.9±3.7▲
72.6±5.7*▲
106.6±6.5*▲
小剂量组
20
1.66±0.23*
21.7±3.5▲
, 百拇医药
65.3±4.7*▲
80.1±8.7*▲
注：与正常对照组比较：P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。 结果显示：模型对照组骨髓MNC1.40±0.39×107股骨，较正常对照组(2.19±0.42×107/股骨)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和大、中剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异，而小剂量中药组虽较模型对照组有升高，但仍与正常对照组有明显差异(P<0.05)，说明康力隆和大、中剂量中药对AA模型小鼠的骨髓有核细胞有明显的提升作用，而小剂量中药作用不明显。
3 益肾生血片对AA模型小鼠CFU-mix的影响(见表2)
, http://www.100md.com 结果表明，模型对照组骨髓CFU-mix数最低(15.2±3.1个/105MNC)，较正常对照组(25.5±3.6个/105MNC)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和三个剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异。说明在此种造血功能受到抑制的情况下，益肾生血片对CFU-mix数量回升有明显的促进作用。
4 益肾生血片对AA模型小鼠粒系祖细胞CFU-GM的影响(见表2)
结果表明，模型对照组骨髓CFU-GM数最低(41.9±8.0个/105MNC)，较正常对照组(86.0±5.1个/105MNC)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和大、中剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异。而小剂量中药组虽较模型对照组有明显升高(P<0.05)，但仍与正常对照组有明显差异(P<0.05)，说明阳性对照药(康力隆)和三个剂量中药对AA模型小鼠CFU-GM数量的恢复有明显的促进作用，但小剂量中药作用较大，中剂量中药为弱。
, 百拇医药
5 益肾生血片对AA模型小鼠红系祖细胞CFU-E的影响(见表2)
结果表明，模型对照组骨髓CFU-E数最低(57.0±10.4个/0.5×105MNC)，较正常对照组(121.8±9.8个/0.5×105MNC)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和大、中剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组无明显差异，而小剂量中药组虽较模型对照组有明显升高(P<0.05)，但仍与正常对照组有明显差异(P<0.05)，说明阳性对照药(康力隆)和三个剂量中药对AA模型小鼠CFU-E数量的恢复有明显的促进作用，但小剂量中药作用较大，中剂量中药为弱。
6 益肾生血片对AA模型小鼠胸骨骨髓涂片形态学观察(见表3)
表3 益肾生血片对AA模型小鼠胸骨骨髓涂片形态学影响(±s) 组 别
, 百拇医药
n
粒：红
粒系(%)
红系(%)
巨核细胞个/片
淋巴细胞(%)
非造血细胞(%)
正常对照
20
1.47±0.33▲
41.9±5.4▲
28.9±3.2
, 百拇医药
185±69
25.9±3.6
1.73±0.99▲
模型对照
20
0.88±0.13*
29.9±2.3*
34.5±3.1*
88±48*
26.7±2.7
6.31±1.81*
, http://www.100md.com
阳性对照
20
1.21±0.31*▲
38.2±6.1▲
32.4±4.0*
140±62
25.6±5.2
2.53±1.06▲
大剂量组
20
1.25±0.24*▲
, 百拇医药
39.5±4.2▲
32.2±3.4*
156±85▲
24.1±4.0
2.56±1.04▲
中剂量组
20
1.10±0.28*▲
35.8±5.2*▲
33.6±5.4*
, http://www.100md.com
147±81
26.3±2.7
2.88±1.62▲
小剂量组
20
1.00±0.16*
34.2±4.4*▲
34.3±3.1*
138±63
26.6±3.8
3.39±1.24*▲
, 百拇医药
注：与正常对照组比较：P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。 结果表明，模型对照组巨核细胞、粒细胞较正常对照组明显减少而非造血细胞明显增高(P<0.05)；给药后阳性对照组和中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异。说明在此种造血功能受到抑制的情况下，益肾生血片对骨髓造血有明显的改善作用。
7 益肾生血片对AA模型小鼠股骨病理形态学观察(见表4)
表4 益肾生血片对AA模型小鼠股骨病理形态学影响(
±s) 组 别
动物数
造血细胞
%
, 百拇医药
非造血细胞
%
巨 核
个/0.0625mm2
血 窦
正常对照
20
89.5▲
10.5▲
4.8±1.0
8.8±1.5
模型对照
, 百拇医药
20
61.1*
38.9*
2.6±0.9*
11.7±4.1*
阳性对照
20
80.1▲
19.9▲
3.2±1.0▲
9.0±3.5▲
, 百拇医药
大剂量组
20
87.6▲
12.4▲
5.0±1.4▲
9.0±3.9▲
中剂量组
20
81.7▲
18.3▲
3.3±2.2▲
, 百拇医药
10.3±3.7
小剂量组
20
80.1▲
19.9▲
3.8±1.0▲
9.8±3.1
注：与正常对照组比较：*P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。
结果表明，模型对照组造血细胞(包括巨核细胞)较正常对照组明显减少(P<0.05)，而非造血细胞明显增多；给药后阳性对照组和大中两个剂量中药组红系细胞、巨核细胞与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组无明显差异，而非造血细胞较模型对照组明显减少。说明在此种造血功能受到抑制的情况下，益肾生血片对骨髓造血有明显的促进作用。
, 百拇医药
讨论
再生障碍性贫血属于中医的“虚劳”、“血虚”、“血证”等范畴。中医认为，其病机主要为肾虚，益肾生血片补肾益髓，治疗AA的临床研究取得令人满意的结果，总有效率82.1%[4]。为探讨其疗效机理，我们观察了该药对马利兰造成的AA模型小鼠外周血和造血干细胞、粒系、红系造血祖细胞的影响。结果显示：1.大、中剂量补肾生血片对AA模型小鼠外周血数量的恢复有明显的促进作用。2.阳性对照药(康力隆)和大、中剂量中药对AA模型小鼠的骨髓有核细胞有明显的提升作用。3.益肾生血片对AA模型小鼠骨髓造血干细胞(CFUmix)、粒系祖细胞(CFU-GM)和红系祖细胞(CFU-E)数量恢复有明显促进作用。
我们以往的工作已证明：黄芪促进多能造血干细胞增殖，补肾中药促进粒、单系祖细胞的增殖，补脾和活血中药促进红系祖细胞的增殖[5]，这些结果互相印证，说明补脾肾中药确能促进造血。
, 百拇医药
本实验结果提示：益肾生血片治疗AA可能是通过促进骨髓造血干细胞增殖作用来实现的。
参考文献
[1] 赵堂富，王素钦，褚建新，等.马利兰诱发小鼠骨髓造血障碍.中华血液学杂志，1988，9(2)：80.
[2] 吴祖泽.造血干细胞移植基础.北京：人民卫生出版社，1988.4，57，86.
[3] 陈文杰，陈辉树，等.造血系统疾病临床病理学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.11.
[4] 周霭祥，王天恩，杨经敏，等.益肾生血片为主治疗再生障碍性贫血的临床研究.中国中西医结合杂志，1998，18(10)：603-606.
[5] 周金黄，王建华.中药药理与临床研究进展(第4册).北京：军事医学科学出版社，1996，266-272.
(收稿日期 1999-07-11 修回日期 1999-08-03), http://www.100md.com
单位：许勇钢 麻 柔 王洪蓓 王展翔 王洪志 中国中医研究院西苑医院血液病研究室，北京 100091；周霭祥 廖军鲜 钟明华 中日友好医院，北京 100029
关键词：益肾生血片；再生障碍性贫血；造血细胞；模型小鼠
中国中医基础医学杂志991108 摘 要：目的 探讨益肾生血片(YSSXT)治疗再生障碍性贫血(AA)的作用机理。方法 用马利兰造成小鼠AA模型，观察该药对AA模型小鼠造血细胞的作用。结果 显示益肾生血片对马利兰引起的造血损伤小鼠骨髓造血干细胞(CFUmix)、粒系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)、有核细胞(MNC)计数、巨核细胞计数和外周血白细胞、血色素和血小板数量的恢复有明显促进作用。结论 保进骨髓造血干细胞增殖是益肾生血片治疗AA的机制之一。
, 百拇医药
再生障碍性贫血(AplasticAnemia,AA)，是由多种因素引起的骨髓造血干细胞、造血微环境损伤及机体免疫机制改变，导致骨髓造血干细胞减少，造血功能衰竭，出现以全血细胞减少为主要表现的综合症。中医认为，AA属于虚痨、虚损、血虚、血证范畴，其发生、发展多因邪毒伤及气血、脏腑(尤其肾及骨髓)，导致血虚及虚劳诸证。本研究采用马利兰造成小鼠AA模型，观察益肾生血片对AA小鼠造血干细胞作用，探讨该药治疗AA作用机理。
材料与方法
1 动物
615小鼠230只，12周龄，雄性；18g～20g；由医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：医动字D01-0387。随机分组，用200只建立AA小鼠模型，30只做正常对照。
2 药物及试剂
益肾生血片，由江苏丹阳药业有限公司提供，为压制益肾生血片(由熟地、补骨脂、黄芪、当归、旱莲草、仙鹤草等中药组成。其功能为补肾生髓，益气生血)药片的原药粉除去赋形剂，每克药粉相当于生药4.2g，用蒸馏水配成40.25%浓度待用；康力隆，广西南宁制药企业集团公司产品，2.0mg/片，用蒸馏水配成0.05%混悬液待用，马利兰片剂(河南鹤壁市制药厂)研碎，丙酮提取4～5次，蒸馏掉丙酮，制成2g/L的混悬液备用；GM-CSF：50μg/支，日本中外制药有限公司产品；IL-3∶0.1ml/支，0.28mg/ml，日本麒麟株式会社产品；EPO：2000u/支，日本麒麟株式会社产品；健马血清：市售标准，军事医学科学院提供。
, 百拇医药
3 造模方法
参照文献[1]，将200只615小鼠，按15mg/kg体重计算剂量给与马利兰，每周一次，腹腔注射，共10周。
4 动物分组
AA模型小鼠随机分为5组：模型对照组、康力隆阳性对照组(4mgkg-1d-1)、益肾生血大剂量组(4.0kg-1d-1)、益肾生血中剂量组(2.0kg-1d-1)、益肾生血小剂量组(1.0gkg-1d-1)；等体积不同浓度灌胃，每日两次，连续灌胃20d，模型对照组以等体积生理盐水灌胃20d，同时用20只正常615小鼠以等体积生理盐水灌胃20d作为正常对照组。
5 观察方法及检测指标
, 百拇医药
5.1 益肾生血片对AA模型小鼠外周血的观察
在给药前、给药后每周及末次给药后次日每只实验小鼠尾静脉取血，用CELL-DYN-1500自动血球计数仪计数，同时涂片经瑞氏染色后，在显微镜下(10×100)计数100个白细胞，进行细胞分类。
5.2 益肾生血片对AA模型小鼠骨髓有核细胞数(MNC)的观察
末次给药后每只实验小鼠各取一侧(右侧)股骨，将骨髓细胞全部冲在4mlMcCOy5A培养液中，用CELL-DYN-1500血球自动计数仪计数骨髓MNC。取胸骨作骨髓细胞涂片，瑞氏染色后，在显微镜下(10×100)计数200有核细胞，进行骨髓细胞分类；同时，全片计数巨核细胞数。
5.3 益肾生血片对AA模型小鼠造血干细胞，造血祖细胞影响
用骨髓造血干细胞培养方法，观察益肾生血片对造血损伤小鼠股骨多向性造血祖细胞(CFU-mix)、红系祖细胞(CUF-E)、粒单系祖细胞(CFU-GM)的影响。停药次日测定小鼠股骨内CFU-mix、CFU-GM、CFU-E数量。方法参照文献[2]。
, 百拇医药
CFU-mix测定：每组小鼠各10只，每只取一根股骨(右侧)，用McCOy5A培养液冲出骨髓细胞，过4号针头制成单细胞悬液，培养体系包括McCOy5A培养液，20%马血清，GM-CSF10ng/ml,IL-310ng/ml,EPO1u/ml，有核细胞105，种入35mm培养皿，每皿1ml培养体系，在37℃，5%CO2条件下培养7d后，低倍镜下按50个以上的细胞团为一个CFUmix进行计数。
CFU-GM测定：培养体系包括McCOy5A培养液，20%马血清，GM-CSF10ng/ml,有核细胞105种入35mm培养皿，每皿1ml培养体系，在37℃，5%CO2条件下培养3d后，低倍镜下按50个以上的细胞团为一个CFU-GM进行计数。
CFU-E测定：培养体系包括McCoy5A培养液，20%马血清，EPO1u/ml,有核细胞0.5×105种入35mm培养皿，每皿1ml培养体系，在37℃，5%CO2条件下培养7d后，低倍镜下按50个以上的细胞团为一个CFU-E进行计数。
, 百拇医药
5.4 病理形态学观察
末次给药后，每组小鼠各10只，取另一侧股骨(左侧)，10%甲醛固定，石蜡或塑料包埋，BRM-SLEE切片机(德国)切片(4μm)，HE染色后进行组织学观察。骨髓观察项目：用10×10网型目尺计数10×40视野30个，记录骨髓造血面积、造血细胞比例、巨核细胞数和血窦数目、骨髓基质等，详细方法参照文献[3]。
6 统计学处理
采用F检验及q检验。
结果
1 益肾生血片对各组AA模型小鼠外周血的影响(见表1)
表1 益肾生血片对AA模型小鼠外周血的影响(
±s) 组 别, 百拇医药
n
WBC
(×109L)
Hb
(g/L)
RBC
(×1012/L)
Hct
(%)
Plt
(×109/L)
正常对照
, 百拇医药
20
14.50±5.80▲
149±16▲
8.79±0.94▲
35.9±4.2▲
1604±279▲
模型对照
20
6.22±2.42*
121±17*
, 百拇医药
6.97±0.78
28.1±3.6*
929±202*
阳性对照
20
14.14±4.34▲
136±16▲
7.77±1.07*▲
32.5±4.5*▲
1441±277▲
, 百拇医药
大剂量组
20
14.24±5.91▲
146±15▲
8.00±1.36*▲
32.6±6.2*▲
1525±290▲
中剂量组
20
13.09±3.83▲
141±21▲
, http://www.100md.com
7.97±0.84*▲
32.5±3.8*▲
1352±210*▲
小剂量组
20
10.68±3.99▲
129±22*
7.21±1.18*
28.7±4.8*
1175±188*▲
, 百拇医药
注：与正常对照组比较：P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。
结果表明：AA模型对照组的Hb、RBC、Hct、WBC、Plt较正常对照组明显减少(P<0.05)；给予阳性对照药和大、中剂量中药后Hb、RBC、Hct、WBC、Plt与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，部分项目如Hb、WBC、Plt与正常组比已无差异，但RBC、Hct较正常组仍低下；而小剂量中药对部分项目(WBC、Plt)有作用，对部分项目(Hb、RBC、Hct)作用不明显。表明大、中剂量补肾生血片对AA模型小鼠外周血数量的恢复有明显的促进作用。外周血涂片分类粒细胞、淋巴细胞数值各组之间无明显差异(P>0.05，数值未列出)。
2 益肾生血片对AA模型小鼠骨髓有核细胞数(MNC)的影响(见表2)
表2 益肾生血片对AA模型小鼠CFU-mix、CFU-GM、CFU-E的影响(
±s) 组 别, http://www.100md.com
动物数
骨髓MNC
(×107/股骨)
CFUmix
(个/105MNC)
CFU-GM
(个/105MNC)
CFU-E
(个/0.5×105MNC)
正常对照
20
, 百拇医药
2.19±0.42▲
25.5±3.6▲
86.0±5.1▲
121.8±9.8▲
模型对照
20
1.40±0.39*
15.2±3.1
41.9±8.0*
57.0±10.4*
, 百拇医药
阳性对照
20
1.91±0.46▲
24.6±3.5▲
83.1±4.3▲
112.4±8.8▲
大剂量组
20
1.95±0.51▲
25.0±2.9▲
84.9±3.8▲
, http://www.100md.com
114.8±7.9▲
中剂量组
20
1.91±0.31▲
23.9±3.7▲
72.6±5.7*▲
106.6±6.5*▲
小剂量组
20
1.66±0.23*
21.7±3.5▲
, 百拇医药
65.3±4.7*▲
80.1±8.7*▲
注：与正常对照组比较：P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。 结果显示：模型对照组骨髓MNC1.40±0.39×107股骨，较正常对照组(2.19±0.42×107/股骨)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和大、中剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异，而小剂量中药组虽较模型对照组有升高，但仍与正常对照组有明显差异(P<0.05)，说明康力隆和大、中剂量中药对AA模型小鼠的骨髓有核细胞有明显的提升作用，而小剂量中药作用不明显。
3 益肾生血片对AA模型小鼠CFU-mix的影响(见表2)
, http://www.100md.com 结果表明，模型对照组骨髓CFU-mix数最低(15.2±3.1个/105MNC)，较正常对照组(25.5±3.6个/105MNC)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和三个剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异。说明在此种造血功能受到抑制的情况下，益肾生血片对CFU-mix数量回升有明显的促进作用。
4 益肾生血片对AA模型小鼠粒系祖细胞CFU-GM的影响(见表2)
结果表明，模型对照组骨髓CFU-GM数最低(41.9±8.0个/105MNC)，较正常对照组(86.0±5.1个/105MNC)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和大、中剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异。而小剂量中药组虽较模型对照组有明显升高(P<0.05)，但仍与正常对照组有明显差异(P<0.05)，说明阳性对照药(康力隆)和三个剂量中药对AA模型小鼠CFU-GM数量的恢复有明显的促进作用，但小剂量中药作用较大，中剂量中药为弱。
, 百拇医药
5 益肾生血片对AA模型小鼠红系祖细胞CFU-E的影响(见表2)
结果表明，模型对照组骨髓CFU-E数最低(57.0±10.4个/0.5×105MNC)，较正常对照组(121.8±9.8个/0.5×105MNC)明显减少(P<0.05)；给药后阳性对照组和大、中剂量中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组无明显差异，而小剂量中药组虽较模型对照组有明显升高(P<0.05)，但仍与正常对照组有明显差异(P<0.05)，说明阳性对照药(康力隆)和三个剂量中药对AA模型小鼠CFU-E数量的恢复有明显的促进作用，但小剂量中药作用较大，中剂量中药为弱。
6 益肾生血片对AA模型小鼠胸骨骨髓涂片形态学观察(见表3)
表3 益肾生血片对AA模型小鼠胸骨骨髓涂片形态学影响(
±s) 组 别, 百拇医药
n
粒：红
粒系(%)
红系(%)
巨核细胞个/片
淋巴细胞(%)
非造血细胞(%)
正常对照
20
1.47±0.33▲
41.9±5.4▲
28.9±3.2
, 百拇医药
185±69
25.9±3.6
1.73±0.99▲
模型对照
20
0.88±0.13*
29.9±2.3*
34.5±3.1*
88±48*
26.7±2.7
6.31±1.81*
, http://www.100md.com
阳性对照
20
1.21±0.31*▲
38.2±6.1▲
32.4±4.0*
140±62
25.6±5.2
2.53±1.06▲
大剂量组
20
1.25±0.24*▲
, 百拇医药
39.5±4.2▲
32.2±3.4*
156±85▲
24.1±4.0
2.56±1.04▲
中剂量组
20
1.10±0.28*▲
35.8±5.2*▲
33.6±5.4*
, http://www.100md.com
147±81
26.3±2.7
2.88±1.62▲
小剂量组
20
1.00±0.16*
34.2±4.4*▲
34.3±3.1*
138±63
26.6±3.8
3.39±1.24*▲
, 百拇医药
注：与正常对照组比较：P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。 结果表明，模型对照组巨核细胞、粒细胞较正常对照组明显减少而非造血细胞明显增高(P<0.05)；给药后阳性对照组和中药组与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组已无明显差异。说明在此种造血功能受到抑制的情况下，益肾生血片对骨髓造血有明显的改善作用。
7 益肾生血片对AA模型小鼠股骨病理形态学观察(见表4)
表4 益肾生血片对AA模型小鼠股骨病理形态学影响(
±s) 组 别动物数
造血细胞
%
, 百拇医药
非造血细胞
%
巨 核
个/0.0625mm2
血 窦
正常对照
20
89.5▲
10.5▲
4.8±1.0
8.8±1.5
模型对照
, 百拇医药
20
61.1*
38.9*
2.6±0.9*
11.7±4.1*
阳性对照
20
80.1▲
19.9▲
3.2±1.0▲
9.0±3.5▲
, 百拇医药
大剂量组
20
87.6▲
12.4▲
5.0±1.4▲
9.0±3.9▲
中剂量组
20
81.7▲
18.3▲
3.3±2.2▲
, 百拇医药
10.3±3.7
小剂量组
20
80.1▲
19.9▲
3.8±1.0▲
9.8±3.1
注：与正常对照组比较：*P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05。
结果表明，模型对照组造血细胞(包括巨核细胞)较正常对照组明显减少(P<0.05)，而非造血细胞明显增多；给药后阳性对照组和大中两个剂量中药组红系细胞、巨核细胞与模型对照组比有明显升高(P<0.05)，且与正常对照组无明显差异，而非造血细胞较模型对照组明显减少。说明在此种造血功能受到抑制的情况下，益肾生血片对骨髓造血有明显的促进作用。
, 百拇医药
讨论
再生障碍性贫血属于中医的“虚劳”、“血虚”、“血证”等范畴。中医认为，其病机主要为肾虚，益肾生血片补肾益髓，治疗AA的临床研究取得令人满意的结果，总有效率82.1%[4]。为探讨其疗效机理，我们观察了该药对马利兰造成的AA模型小鼠外周血和造血干细胞、粒系、红系造血祖细胞的影响。结果显示：1.大、中剂量补肾生血片对AA模型小鼠外周血数量的恢复有明显的促进作用。2.阳性对照药(康力隆)和大、中剂量中药对AA模型小鼠的骨髓有核细胞有明显的提升作用。3.益肾生血片对AA模型小鼠骨髓造血干细胞(CFUmix)、粒系祖细胞(CFU-GM)和红系祖细胞(CFU-E)数量恢复有明显促进作用。
我们以往的工作已证明：黄芪促进多能造血干细胞增殖，补肾中药促进粒、单系祖细胞的增殖，补脾和活血中药促进红系祖细胞的增殖[5]，这些结果互相印证，说明补脾肾中药确能促进造血。
, 百拇医药
本实验结果提示：益肾生血片治疗AA可能是通过促进骨髓造血干细胞增殖作用来实现的。
参考文献
[1] 赵堂富，王素钦，褚建新，等.马利兰诱发小鼠骨髓造血障碍.中华血液学杂志，1988，9(2)：80.
[2] 吴祖泽.造血干细胞移植基础.北京：人民卫生出版社，1988.4，57，86.
[3] 陈文杰，陈辉树，等.造血系统疾病临床病理学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.11.
[4] 周霭祥，王天恩，杨经敏，等.益肾生血片为主治疗再生障碍性贫血的临床研究.中国中西医结合杂志，1998，18(10)：603-606.
[5] 周金黄，王建华.中药药理与临床研究进展(第4册).北京：军事医学科学出版社，1996，266-272.
(收稿日期 1999-07-11 修回日期 1999-08-03), http://www.100md.com