兔动脉内膜损伤后血管狭窄模型的建立及动态观察的研究**
作者：姚玉宇 冷 静 彭 韬 李晶阁 冯振卿 尹 航 黄 峻
单位：姚玉宇 冷 静 彭 韬 李晶阁 冯振卿：南京医科大学病理学学系 邮政编码：210029；尹 航 黄 峻：南京医科大学第一附属医院
关键词：动脉内膜损伤 动物模型 血管平滑肌细胞 基质
江苏医药991205 摘要 建立经皮冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄动物模型，探讨血管平滑肌细胞(VSMC)及基质在动脉内膜损伤后的增殖动力学变化。用5F动脉导管损伤兔腹主动脉，采用光镜、电镜及图像分析系统观察内膜损伤后的形态及VSMC增殖动力学改变。内膜损伤后2周内以VSMC增殖为主，在基质形成的参与下形成血管狭窄，4周后以基质增殖为主。此动物模型能较好地模拟PTCA术后再狭窄的病理变化，对VSMC和基质的动态观察能指导临床不同时期药物应用。
经皮冠状动脉成形术(PTCA)是目前治疗冠心病的主要方法，但术后半年内约有30%～50%的病人发生原病变部位的再狭窄[1]。有报道中膜血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖、迁移以及VSMC大量分泌基质是再狭窄形成的主要原因[2]。本实验在建立动物模型的基础上，对狭窄形成中的相关因素进行了探讨。
, 百拇医药
材料与方法
一、兔腹-髂动脉损伤后血管狭窄动物模型的建立：(1)新西兰兔24只，雄性，分为正常对照组3只，内膜损伤组21只。麻醉后，沿腹正中线切开腹部，暴露腹主动脉，再沿髂动脉方向做一纵切口，钝性分离髂动脉，在髂动脉上剪一小切口，逆行插入J型导引钢丝至腹主动脉上端，沿导丝插入表面粗糙的5F动脉导管，在腹部切口的帮助下，将导管插入至主动脉腹段，来回抽插2次，造成动脉内膜损伤，术中肝素化，术后常规抗菌治疗。(2)于术后4小时、24小时、7天、14天、28天、3个月、4个月各处死模型兔3只，并在1个月时处死对照组动物。取出腹主动脉，迅速放入4%多聚甲醛中固定，行常规病理检查。另取1个月模型组兔的增生动脉戊二醛固定后，行透射电镜检查。(3)所取石蜡切片均常规HE及Masson染色，并应用计算机图像分析系统(NYD-1000型)进行图像分析，测量增生内膜面积(μm2)，中膜面积(μm2)，增生内膜中SMC的数目(个)及增殖基质所占的面积(μm2)。以内膜面积与内膜面积+中膜面积之比定义为内膜增生指数。管腔面积与内膜面积+管腔面积之比定义为管腔狭窄指数。增生内膜内胶原的面积与增生内膜的面积之比定义为胶原生成指数。并计算单位增生内膜面积内增生细胞的数(增生细胞的数量/增生内膜的面积)。
, 百拇医药
二、判断增殖内膜中细胞的来源：常规ABC法进行Myosin免疫组织化学实验。
三、统计变量以均数±标准差表示，组间比较用方差分析组间q检验。
结 果
一、形态学变化：(1)正常对照组：HE染色见内皮细胞、内弹力板完整，内弹力板内有极少量结缔组织无平滑肌存在。可认为内膜面积为零。(2)造模后4小时组：内皮消失，内弹力板断裂。(3)24小时组：内皮消失，内弹力板断裂，有血栓形成。(4)1周组：管腔面见较完整的扁平状内皮，增生内膜细胞排列紊乱，VSMC核大而椭圆，胞浆丰富。胶原染色VSMC周围有少量阳性反应存在。(5)2周组：增生内膜近管腔面有一至两层SMC呈环行排列，近中膜处细胞排列紊乱，见SMC穿越内弹力板。胶原染色，SMC周围胶原略有增加。(6)4周组：内膜明显增厚，SMC环行排列整齐，SMC周围有较多胶原，管腔狭窄明显。透射电镜：增生内膜SMC胞浆内肌丝减少，出现大量的内质网和高尔基体及线粒体，呈典型的“合成型”SMC表现。对照组中膜SMC胞浆内含大量的肌丝、密斑、密体，仅有少量的内质网，SMC呈现为“收缩型”。(7)12周组：内膜明显增厚，细胞周围基质大量增加，管腔狭窄。(8)16周组：HE及胶原染色与12周的表现极为相似。
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二、增殖指标分析：各指标变化见附表(统计时3个月组数据与4个月组两两相比时P>0.05，将两组数据合并)。
三、免疫组化结果：损伤后4个月内，增殖内膜中细胞Myosin标记阳性率在90%以上。
附表 兔动脉内膜损伤后主要指标的变化
细胞增生数
胶原生成指数
狭窄指数
增殖指数
单位面积内SMC
例数
细胞数
, 百拇医药
例数
数值
例数
数值
例数
数值
例数
10-3个/μm2
对照组
12
0
12
0
, 百拇医药
12
1
12
0
12
0
7天组
9
228.80±86.84
10
0.11±0.05*
10
0.96±0.03
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11
0.13±0.004*
11
6.28±1.27
14天组
7
1452.20±337.70△
10
0.14±0.04*
10
0.64±0.12△
, 百拇医药
10
0.32±0.050△
10
4.49±0.61△
28天组
8
2068.00±681.90△＃
8
0.21±0.06*
8
0.62±0.07△
, 百拇医药
10
0.48±0.060△
10
4.43±0.52△
3、4个月组
10
2042.00±351.69△＃
14
0.42±0.05△
12
0.60±0.16△
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14
0.49±0.070△
14
4.00±0.81△
与7天组比△P<0.01， 与14天组比＃P<0.05， 与3、4个月组相比*P<0.01
讨 论
PTCA术一直困扰人们的问题是术后的再狭窄。再狭窄涉及的因素众多，还没有一个动物模型能模拟再狭窄发生全过程中的所有因素，但动物模型可用来研究引起再狭窄的某些因素和环节。本实验着重研究内膜损伤后VSMC的增殖动力学变化。在模型动物的选择和制备上也有独特性。
当前常用的动物有大鼠、狗、猪及兔[3，4]。兔的腹主动脉中下段中膜肌层较厚，可较好模拟人的冠状动脉。另外其管腔大小适中，可使操作简单易行。Clowes等[6]报道建立的鼠颈动脉狭窄模型，手术器械是价格昂贵的特制的动脉球囊成型术导管，以气囊控制压力。且鼠颈动脉与人的冠状动脉的相似性不如兔的腹主动脉下端。本实验创新之处是选用了经改制的表面粗糙的动脉导管，在J型导引钢丝的引导下到达损伤部位，来回抽插2次，即达到损伤的目的。本法的优点之一是达到了预期的损伤目的[5]，之二是简单、价廉，因此，优于Clowes等人的方法。
, 百拇医药
在损伤早期，可见内皮消失，内弹力板分离、断裂，血栓形成。损伤后期可见内膜大量细胞及基质增生，管腔狭窄。免疫组化证实增生内膜内绝大多数的细胞是平滑肌细胞。电镜显示增生细胞是分泌型平滑肌细胞，以上几点及HE染色的动态观察共同说明本模型成功地模拟了血管内膜损伤后的病理过程，实验结果表明，从7天至14天，内膜细胞数上升了84%，增生指数上升了59%，狭窄指数下降了33%，均有显著性差异。说明损伤后14天内大量VSMC增殖造成内膜增厚、管腔狭窄。以后随着时间的延长，增生指数只是略有增加，但14天组与3个月组仍有显著性差异。而细胞数在28天后甚至略有减少，说明此时增殖不是由细胞增生造成的。同时发现单位面积内SMC随着时间的增加而逐渐减少，胶原生成指数却不断上升，28天组与3个月组有显著性差异，说明损伤后期内膜面积的增加是胶原生成引起的。而狭窄指数在14天后虽然略有增加但已无显著性差异，说明狭窄在损伤后14天即形成。
省教委自然科学基金(98KJB310002)及卫生部科研基金(96-1-344)资助
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参考文献
[1] Fanelli C, et al. Am Heart J 1990；119：357.
[2] Austin GE, et al. J Am Coll Cardiol 1985；6：369.
[3] Muller DWM, et al. J Am Coll Cardiol 1992；19：418.
[4] Hanke H, et al. Cir Res 1990;67：651.
[5] 陈伯荣.中华循环杂志 1991；6(5)：422.
[6] Clowes AW, et al. Lab Invest 1983；49：327.
(1999年4月18日收稿，同年6月4日修回), 百拇医药
单位：姚玉宇 冷 静 彭 韬 李晶阁 冯振卿：南京医科大学病理学学系 邮政编码：210029；尹 航 黄 峻：南京医科大学第一附属医院
关键词：动脉内膜损伤 动物模型 血管平滑肌细胞 基质
江苏医药991205 摘要 建立经皮冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄动物模型，探讨血管平滑肌细胞(VSMC)及基质在动脉内膜损伤后的增殖动力学变化。用5F动脉导管损伤兔腹主动脉，采用光镜、电镜及图像分析系统观察内膜损伤后的形态及VSMC增殖动力学改变。内膜损伤后2周内以VSMC增殖为主，在基质形成的参与下形成血管狭窄，4周后以基质增殖为主。此动物模型能较好地模拟PTCA术后再狭窄的病理变化，对VSMC和基质的动态观察能指导临床不同时期药物应用。
经皮冠状动脉成形术(PTCA)是目前治疗冠心病的主要方法，但术后半年内约有30%～50%的病人发生原病变部位的再狭窄[1]。有报道中膜血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖、迁移以及VSMC大量分泌基质是再狭窄形成的主要原因[2]。本实验在建立动物模型的基础上，对狭窄形成中的相关因素进行了探讨。
, 百拇医药
材料与方法
一、兔腹-髂动脉损伤后血管狭窄动物模型的建立：(1)新西兰兔24只，雄性，分为正常对照组3只，内膜损伤组21只。麻醉后，沿腹正中线切开腹部，暴露腹主动脉，再沿髂动脉方向做一纵切口，钝性分离髂动脉，在髂动脉上剪一小切口，逆行插入J型导引钢丝至腹主动脉上端，沿导丝插入表面粗糙的5F动脉导管，在腹部切口的帮助下，将导管插入至主动脉腹段，来回抽插2次，造成动脉内膜损伤，术中肝素化，术后常规抗菌治疗。(2)于术后4小时、24小时、7天、14天、28天、3个月、4个月各处死模型兔3只，并在1个月时处死对照组动物。取出腹主动脉，迅速放入4%多聚甲醛中固定，行常规病理检查。另取1个月模型组兔的增生动脉戊二醛固定后，行透射电镜检查。(3)所取石蜡切片均常规HE及Masson染色，并应用计算机图像分析系统(NYD-1000型)进行图像分析，测量增生内膜面积(μm2)，中膜面积(μm2)，增生内膜中SMC的数目(个)及增殖基质所占的面积(μm2)。以内膜面积与内膜面积+中膜面积之比定义为内膜增生指数。管腔面积与内膜面积+管腔面积之比定义为管腔狭窄指数。增生内膜内胶原的面积与增生内膜的面积之比定义为胶原生成指数。并计算单位增生内膜面积内增生细胞的数(增生细胞的数量/增生内膜的面积)。
, 百拇医药
二、判断增殖内膜中细胞的来源：常规ABC法进行Myosin免疫组织化学实验。
三、统计变量以均数±标准差表示，组间比较用方差分析组间q检验。
结 果
一、形态学变化：(1)正常对照组：HE染色见内皮细胞、内弹力板完整，内弹力板内有极少量结缔组织无平滑肌存在。可认为内膜面积为零。(2)造模后4小时组：内皮消失，内弹力板断裂。(3)24小时组：内皮消失，内弹力板断裂，有血栓形成。(4)1周组：管腔面见较完整的扁平状内皮，增生内膜细胞排列紊乱，VSMC核大而椭圆，胞浆丰富。胶原染色VSMC周围有少量阳性反应存在。(5)2周组：增生内膜近管腔面有一至两层SMC呈环行排列，近中膜处细胞排列紊乱，见SMC穿越内弹力板。胶原染色，SMC周围胶原略有增加。(6)4周组：内膜明显增厚，SMC环行排列整齐，SMC周围有较多胶原，管腔狭窄明显。透射电镜：增生内膜SMC胞浆内肌丝减少，出现大量的内质网和高尔基体及线粒体，呈典型的“合成型”SMC表现。对照组中膜SMC胞浆内含大量的肌丝、密斑、密体，仅有少量的内质网，SMC呈现为“收缩型”。(7)12周组：内膜明显增厚，细胞周围基质大量增加，管腔狭窄。(8)16周组：HE及胶原染色与12周的表现极为相似。
, http://www.100md.com
二、增殖指标分析：各指标变化见附表(统计时3个月组数据与4个月组两两相比时P>0.05，将两组数据合并)。
三、免疫组化结果：损伤后4个月内，增殖内膜中细胞Myosin标记阳性率在90%以上。
附表 兔动脉内膜损伤后主要指标的变化
细胞增生数
胶原生成指数
狭窄指数
增殖指数
单位面积内SMC
例数
细胞数
, 百拇医药
例数
数值
例数
数值
例数
数值
例数
10-3个/μm2
对照组
12
0
12
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, 百拇医药
12
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12
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0
7天组
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228.80±86.84
10
0.11±0.05*
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0.96±0.03
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11
0.13±0.004*
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6.28±1.27
14天组
7
1452.20±337.70△
10
0.14±0.04*
10
0.64±0.12△
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0.32±0.050△
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4.49±0.61△
28天组
8
2068.00±681.90△＃
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0.21±0.06*
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0.62±0.07△
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10
0.48±0.060△
10
4.43±0.52△
3、4个月组
10
2042.00±351.69△＃
14
0.42±0.05△
12
0.60±0.16△
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14
0.49±0.070△
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4.00±0.81△
与7天组比△P<0.01， 与14天组比＃P<0.05， 与3、4个月组相比*P<0.01
讨 论
PTCA术一直困扰人们的问题是术后的再狭窄。再狭窄涉及的因素众多，还没有一个动物模型能模拟再狭窄发生全过程中的所有因素，但动物模型可用来研究引起再狭窄的某些因素和环节。本实验着重研究内膜损伤后VSMC的增殖动力学变化。在模型动物的选择和制备上也有独特性。
当前常用的动物有大鼠、狗、猪及兔[3，4]。兔的腹主动脉中下段中膜肌层较厚，可较好模拟人的冠状动脉。另外其管腔大小适中，可使操作简单易行。Clowes等[6]报道建立的鼠颈动脉狭窄模型，手术器械是价格昂贵的特制的动脉球囊成型术导管，以气囊控制压力。且鼠颈动脉与人的冠状动脉的相似性不如兔的腹主动脉下端。本实验创新之处是选用了经改制的表面粗糙的动脉导管，在J型导引钢丝的引导下到达损伤部位，来回抽插2次，即达到损伤的目的。本法的优点之一是达到了预期的损伤目的[5]，之二是简单、价廉，因此，优于Clowes等人的方法。
, 百拇医药
在损伤早期，可见内皮消失，内弹力板分离、断裂，血栓形成。损伤后期可见内膜大量细胞及基质增生，管腔狭窄。免疫组化证实增生内膜内绝大多数的细胞是平滑肌细胞。电镜显示增生细胞是分泌型平滑肌细胞，以上几点及HE染色的动态观察共同说明本模型成功地模拟了血管内膜损伤后的病理过程，实验结果表明，从7天至14天，内膜细胞数上升了84%，增生指数上升了59%，狭窄指数下降了33%，均有显著性差异。说明损伤后14天内大量VSMC增殖造成内膜增厚、管腔狭窄。以后随着时间的延长，增生指数只是略有增加，但14天组与3个月组仍有显著性差异。而细胞数在28天后甚至略有减少，说明此时增殖不是由细胞增生造成的。同时发现单位面积内SMC随着时间的增加而逐渐减少，胶原生成指数却不断上升，28天组与3个月组有显著性差异，说明损伤后期内膜面积的增加是胶原生成引起的。而狭窄指数在14天后虽然略有增加但已无显著性差异，说明狭窄在损伤后14天即形成。
省教委自然科学基金(98KJB310002)及卫生部科研基金(96-1-344)资助
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参考文献
[1] Fanelli C, et al. Am Heart J 1990；119：357.
[2] Austin GE, et al. J Am Coll Cardiol 1985；6：369.
[3] Muller DWM, et al. J Am Coll Cardiol 1992；19：418.
[4] Hanke H, et al. Cir Res 1990;67：651.
[5] 陈伯荣.中华循环杂志 1991；6(5)：422.
[6] Clowes AW, et al. Lab Invest 1983；49：327.
(1999年4月18日收稿，同年6月4日修回), 百拇医药