肿瘤相关抗原CA-X体内外的差异性表达
作者：王雄彪 张红宇 徐永华
单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433；张红宇 徐永华 中国科学院上海细胞生物学研究
关键词：肺肿瘤；肿瘤抗原；表达调控
第二军医大学学报991216 摘要 目的: 探讨肿瘤相关抗原 CA-X体内外表达的差异性。方法: 采用蛋白质印迹法和流式细胞术分别检测肺腺癌细胞株移植裸鼠前后抗原表达的变化。结果: CA-X为高分子量糖蛋白，体外培养的SpcA1细胞株不表达CA-X，而一旦移植入裸鼠后，肿瘤重又表达该抗原。结论: 肿瘤相关抗原CA-X移植入裸鼠后重新表达，说明CA-X的表达调控受体内某些因素的调控，也可能与细胞间信号转导有关。
中图分类号 R 734.2 文章编号：0258-879X(1999)12-0983-03 文献标识码：A
, 百拇医药
The differential expression of tumor associated antigen CA-X in vitro and in vivo
Wang Xiongbiao, Zhang Hongyu, Xu Yonghua
(Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai， 200433)
ABSTRACT Objective: To explore the differential expression of tumor associated antigen CA-X in tumor cells in vitro and in vivo. Methods: Tumor xenografts of the human lung adenocarcinoma cell line SpcA1 were grown in athymia mice. The antigen was measured before and after xenograft by Western blotting and flow cytometric analysis. Results: The antigen CA-X was a glycoprotein with a molecular weight of 170 000 to 200 000. Human lung adenocarcinoma cell lines regain expression of antigen CA-X when xenografted into athymia mice. Conclusion: These data indicate that CA-X synthesis in human lung adenocarcinoma cells SpcA1 is regulated by factors presented only in the xenograft.
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KEY WORDS lung cancer; tumor associated antigen; expression control
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 983～985]
抗人结肠癌单克隆抗体(MAb)W2是由人结肠癌细胞膜提取物免疫小鼠后，获得的高活性的杂交瘤细胞株分泌产生，为加拿大YES生物技术公司实验室制备。研究发现，该抗体能与多种人肿瘤细胞特异结合，包括肺腺癌、肺鳞癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌，而癌旁正常组织通过免疫组织化学分析没有特异结合，因此我们把抗体W2所针对的抗原命名为CA-X。为了探讨该抗原的特性及在肿瘤发生、发展和转移过程中的意义，本实验作了初步研究，发现该抗原是大分子量糖蛋白，且有趣地发现该抗原的表达受到某些因素的控制，建株的细胞株不表达该抗原，而一旦该细胞株被移植入裸鼠，此抗原又再度表达。表明该抗原在肿瘤生长中发挥重要作用。
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1 材料和方法
1.1 材料 抗CA-X单克隆抗体W2由加拿大YES生物技术公司实验室提供;肺腺癌细胞株SpcA1由本室传代；裸鼠由中国科学院细胞所动物房提供并饲养(雄性裸鼠2只，为7～8周龄，平均质量为15 g)。
1.2 裸鼠肿瘤细胞接种 SpcA1细胞株培养至对数期生长时，用0.1%胰酶消化，然后用无血清RPMI 1640洗涤2遍，重悬于PBS中，细胞密度为1×107个/ml。选择7～8周龄裸鼠常规消毒，皮下接种，每只鼠接种2～3个点，注射约50～100 μl细胞悬液。
1.3 新鲜肿瘤细胞的制备 接种肿瘤细胞后的裸鼠按常规置层流架饲养15～20 d后，接种部位即有肿瘤生长，当长至绿豆大时，切下瘤体，迅速清除周围组织，剪碎后，将瘤组织挤压，过150目尼龙网，制备游离的单细胞悬液，用D-Hanks洗两遍，备用。
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1.4 蛋白质印迹法 参照文献[1]方法，稍加修改。
1.5 流式细胞术分析 1×106个建株细胞和新鲜肿瘤细胞用PBS洗涤后，加入W2 单抗(2 μl/ml)，置4℃ 1 h，PBS洗5遍，加入荧光标记羊抗鼠抗体(1∶2 000稀释)，置4℃ 1 h，PBS洗5遍后，重悬于PBS中，上流式细胞仪(FACS calibure, Becton Dickinson公司)检测。
2 结果
2.1 蛋白质印迹法检测 体外培养的肺腺癌细胞及新鲜肿瘤细胞的总蛋白经蛋白质印迹法检测后发现，CA-X在建株的肿瘤细胞SpcA1中未表达;在新鲜的移植肿瘤细胞中则有明显表达。该抗原分子量介于170 000～200 000之间(结果未列出)。
2.2 流式细胞术检测 新鲜的移植肿瘤细胞被荧光标记的细胞数近60%，而建株细胞仅有少量被荧光标记(图1)。
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图1 流式细胞术检测结果
Fig 1 The result of flow cytometric analysis
A: Cell line SpcA1 cells as control; B: Cell line SpcA1 cells+MAb W2;
C: Tumor cells from SpcA1 bearing mice as control; D: Tumor cells from SpcA1 bearing mice+MAb
3 讨论
肿瘤相关抗原是肿瘤的标志。不同的单抗识别不同的肿瘤抗原，比较经典的肿瘤相关抗原如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等已被广泛运用于肿瘤的诊断和治疗中。肿瘤的发生、发展是一系列基因变化的结果，肿瘤抗原表达又是受多种因素调节的[2]。同一种肿瘤细胞可以出现数种肿瘤相关抗原；同时，肿瘤细胞由于组织来源的不同，具有各自的特征及肿瘤相关抗原。但肿瘤细胞又存在共同的分子和细胞生物学特征，特异的肿瘤抗原一直是人们寻找的目标。因而不断有新的癌基因、肿瘤抗原被发现和认识。
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CA-X是尚未被深入了解的肿瘤相关抗原之一，其结构和生物学意义尚不清楚。本实验结果表明，CA-X是一个大于170 000的大分子糖蛋白复合物。
糖蛋白是由大分子糖基和蛋白构成，在细胞表面丰富存在，正常时保护细胞抵御物理和化学的损害。糖蛋白往往在肿瘤细胞表面过度表达，在肿瘤发生、发展和转移中起重要作用。目前认为，糖蛋白与细胞间的信号转导密切相关[3]。推测CA-X也与肿瘤的恶性程度有关。事实上，许多建株的单抗可以识别特定的糖蛋白，如19-9[4],Du-Pan-2[5]等。
尽管建株的肿瘤细胞保留了原代肿瘤细胞部分生物学活性，但是建株也使原代肿瘤细胞的某些生物学活性发生改变，这种变化是由基因调控的[6]。建株细胞部分基因失活，处于关闭状态，基因产物不能被转录或翻译。一旦肿瘤细胞移植到体内，在某些未知调控因素影响下，肿瘤抗原基因被激活，再度表达。目前有2例报道介绍体内外抗原表达的差异，人神经母细胞瘤建株传代后失去了分泌儿茶酚胺的能力，体内的某些因素对分泌儿茶酚胺有决定性意义[7]；另外结肠癌细胞株LS-174T能低水平表达TAG-72肿瘤相关抗原，当该细胞株移植入裸鼠后，能高度表达TAG-72抗原，这种差异达到100倍，接近人体内肿瘤组织的表达水平[8]。CA-X抗原可能同样处于这样的基因调控下。
, 百拇医药
对肿瘤相关抗原体内外表达的差异尚难提出明确的调控机制，但有两方面的工作或许有助于揭示其机制。有作者模仿肿瘤组织，用立体组织细胞培养的方法，培养LS-174T细胞，能使 TAG-72抗原的表达比单层细胞培养提高 2～7倍[8]。这两种培养方法比较显著的差异在于每簇细胞的数量，单层细胞培养每簇细胞数约数百个，而立体组织细胞培养大约(1～10)×106。由此可见，细胞与细胞之间空间构型乃至细胞之间的信号转导对肿瘤相关抗原的表达发挥了重要作用。Yamashita等[9]认为细胞密度影响粘蛋白的分泌。本实验为研究细胞信号转导提供了很好的模型。其次，目前已有报道证实，干扰素能提高肿瘤抗原的表达，在人体内、裸鼠、体外细胞培养都有相同的结论，这种促进作用不再仅仅涉及肿瘤细胞间信号转导，而且涉及细胞因子对肿瘤基因的调控[10]。这种体内、体外的差异至少说明了两个问题：(1) 建株细胞和在体细胞有着许多性质上的区别，因而单凭体外的实验往往不足以说明问题，如杀伤活性等实验，必须结合体内实验，尽可能建立肿瘤动物模型，才能比较客观地反映肿瘤在人体的特性。(2) 这种差异表达的肿瘤相关基因，所表达的基因产物，必然在肿瘤发生、生长、发展、预后中发挥重要功能，如细胞接触抑制、远处转移，对这些抗原的再认识，有助于揭示肿瘤发生、发展的机制。
, 百拇医药
本实验所揭示的事实，即肿瘤相关抗原在体内外表达的差异，有助于我们对CA-X抗原的深入了解。通过两种方式生长细胞的差异显示，构建噬菌体表面表达文库，用抗体筛选，克隆CA-X的全基因,从而将彻底了解该抗原的结构和功能。我们将在这方面予以深入研究。
作者简介：王雄彪，男，1962年7月生，博士，主治医师
参考文献
1 Sambrook J，Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989. 880
2 Sivinski CL, Lindner DJ, Borden EC, et al. Modulation of tumor-associated antigen expression on human pancreatic and prostate carcinoma cells in vitro by alpha- and gamma-interferons[J]. J Immunother Emphasis Tumor Immunol， 1995,18(3):156
, 百拇医药
3 Obrink B. CEA adhesion molecules: multifunctional proteins with signal-regulatory properties[J]. Curr Opin Cell Biol， 1997,9(5): 616
4 Klopocki AG, Krop Watorek A, Dus D, et al. Adhesion of human uroepithelial cells to E-selectin: possible involvement of sialosyl LewisA-ganglioside[J]. Int J Cancer， 1996， 68(2): 239
5 Narimatsu H, Iwasaki H, Nishihara S, et al. Genetic evidence for the Lewis enzyme, which synthesizes type-1 Lewis antigens in colon tissue, and intracellular localization of the enzyme[J]. Cancer Res， 1996， 56(2): 330
, 百拇医药
6 Hartmann C, Kluwe L, Lucke M, et al. The rate of homozygous CDKN2A/p16 deletions in glioma cell lines and in primary tumors[J]. Int J Oncol， 1999, 15(5):975
7 Tomayko MM, Triche TJ, Reynolds CP. Human neuroblastoma cell lines regain catecholamine fluorescence when xenografted into athymic (nude) mice[J]. Int J Dev Neurosci，1996， 14(6): 771
8 Horan-Hand P, Colcher D, Salomon D, et al. Influence of spatial configuration of carcinoma cell populations on the expression of a tumor-associated glycoprotein[J]. Cancer Res， 1985， 45(2): 833
, 百拇医药
9 Yamashita Y, Ho JJ, Cheng S, et al. Expression of mucin-associated tumor antigens is altered by cell density[J]. Int J Cancer，1997， 72(3): 457
10 Greiner JW, Guadagni F, Roselli M, et al. Improved experimental radioimmunotherapy of colon xenografts by combining 131I-CC49 and interferon-gamma[J]. Dis Colon Rectum， 1994， 37 (2 Suppl): S100
(1999-05-18收稿，1999-10-31修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433；张红宇 徐永华 中国科学院上海细胞生物学研究
关键词：肺肿瘤；肿瘤抗原；表达调控
第二军医大学学报991216 摘要 目的: 探讨肿瘤相关抗原 CA-X体内外表达的差异性。方法: 采用蛋白质印迹法和流式细胞术分别检测肺腺癌细胞株移植裸鼠前后抗原表达的变化。结果: CA-X为高分子量糖蛋白，体外培养的SpcA1细胞株不表达CA-X，而一旦移植入裸鼠后，肿瘤重又表达该抗原。结论: 肿瘤相关抗原CA-X移植入裸鼠后重新表达，说明CA-X的表达调控受体内某些因素的调控，也可能与细胞间信号转导有关。
中图分类号 R 734.2 文章编号：0258-879X(1999)12-0983-03 文献标识码：A
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The differential expression of tumor associated antigen CA-X in vitro and in vivo
Wang Xiongbiao, Zhang Hongyu, Xu Yonghua
(Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai， 200433)
ABSTRACT Objective: To explore the differential expression of tumor associated antigen CA-X in tumor cells in vitro and in vivo. Methods: Tumor xenografts of the human lung adenocarcinoma cell line SpcA1 were grown in athymia mice. The antigen was measured before and after xenograft by Western blotting and flow cytometric analysis. Results: The antigen CA-X was a glycoprotein with a molecular weight of 170 000 to 200 000. Human lung adenocarcinoma cell lines regain expression of antigen CA-X when xenografted into athymia mice. Conclusion: These data indicate that CA-X synthesis in human lung adenocarcinoma cells SpcA1 is regulated by factors presented only in the xenograft.
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KEY WORDS lung cancer; tumor associated antigen; expression control
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 983～985]
抗人结肠癌单克隆抗体(MAb)W2是由人结肠癌细胞膜提取物免疫小鼠后，获得的高活性的杂交瘤细胞株分泌产生，为加拿大YES生物技术公司实验室制备。研究发现，该抗体能与多种人肿瘤细胞特异结合，包括肺腺癌、肺鳞癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌，而癌旁正常组织通过免疫组织化学分析没有特异结合，因此我们把抗体W2所针对的抗原命名为CA-X。为了探讨该抗原的特性及在肿瘤发生、发展和转移过程中的意义，本实验作了初步研究，发现该抗原是大分子量糖蛋白，且有趣地发现该抗原的表达受到某些因素的控制，建株的细胞株不表达该抗原，而一旦该细胞株被移植入裸鼠，此抗原又再度表达。表明该抗原在肿瘤生长中发挥重要作用。
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1 材料和方法
1.1 材料 抗CA-X单克隆抗体W2由加拿大YES生物技术公司实验室提供;肺腺癌细胞株SpcA1由本室传代；裸鼠由中国科学院细胞所动物房提供并饲养(雄性裸鼠2只，为7～8周龄，平均质量为15 g)。
1.2 裸鼠肿瘤细胞接种 SpcA1细胞株培养至对数期生长时，用0.1%胰酶消化，然后用无血清RPMI 1640洗涤2遍，重悬于PBS中，细胞密度为1×107个/ml。选择7～8周龄裸鼠常规消毒，皮下接种，每只鼠接种2～3个点，注射约50～100 μl细胞悬液。
1.3 新鲜肿瘤细胞的制备 接种肿瘤细胞后的裸鼠按常规置层流架饲养15～20 d后，接种部位即有肿瘤生长，当长至绿豆大时，切下瘤体，迅速清除周围组织，剪碎后，将瘤组织挤压，过150目尼龙网，制备游离的单细胞悬液，用D-Hanks洗两遍，备用。
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1.4 蛋白质印迹法 参照文献[1]方法，稍加修改。
1.5 流式细胞术分析 1×106个建株细胞和新鲜肿瘤细胞用PBS洗涤后，加入W2 单抗(2 μl/ml)，置4℃ 1 h，PBS洗5遍，加入荧光标记羊抗鼠抗体(1∶2 000稀释)，置4℃ 1 h，PBS洗5遍后，重悬于PBS中，上流式细胞仪(FACS calibure, Becton Dickinson公司)检测。
2 结果
2.1 蛋白质印迹法检测 体外培养的肺腺癌细胞及新鲜肿瘤细胞的总蛋白经蛋白质印迹法检测后发现，CA-X在建株的肿瘤细胞SpcA1中未表达;在新鲜的移植肿瘤细胞中则有明显表达。该抗原分子量介于170 000～200 000之间(结果未列出)。
2.2 流式细胞术检测 新鲜的移植肿瘤细胞被荧光标记的细胞数近60%，而建株细胞仅有少量被荧光标记(图1)。
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图1 流式细胞术检测结果
Fig 1 The result of flow cytometric analysis
A: Cell line SpcA1 cells as control; B: Cell line SpcA1 cells+MAb W2;
C: Tumor cells from SpcA1 bearing mice as control; D: Tumor cells from SpcA1 bearing mice+MAb
3 讨论
肿瘤相关抗原是肿瘤的标志。不同的单抗识别不同的肿瘤抗原，比较经典的肿瘤相关抗原如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等已被广泛运用于肿瘤的诊断和治疗中。肿瘤的发生、发展是一系列基因变化的结果，肿瘤抗原表达又是受多种因素调节的[2]。同一种肿瘤细胞可以出现数种肿瘤相关抗原；同时，肿瘤细胞由于组织来源的不同，具有各自的特征及肿瘤相关抗原。但肿瘤细胞又存在共同的分子和细胞生物学特征，特异的肿瘤抗原一直是人们寻找的目标。因而不断有新的癌基因、肿瘤抗原被发现和认识。
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CA-X是尚未被深入了解的肿瘤相关抗原之一，其结构和生物学意义尚不清楚。本实验结果表明，CA-X是一个大于170 000的大分子糖蛋白复合物。
糖蛋白是由大分子糖基和蛋白构成，在细胞表面丰富存在，正常时保护细胞抵御物理和化学的损害。糖蛋白往往在肿瘤细胞表面过度表达，在肿瘤发生、发展和转移中起重要作用。目前认为，糖蛋白与细胞间的信号转导密切相关[3]。推测CA-X也与肿瘤的恶性程度有关。事实上，许多建株的单抗可以识别特定的糖蛋白，如19-9[4],Du-Pan-2[5]等。
尽管建株的肿瘤细胞保留了原代肿瘤细胞部分生物学活性，但是建株也使原代肿瘤细胞的某些生物学活性发生改变，这种变化是由基因调控的[6]。建株细胞部分基因失活，处于关闭状态，基因产物不能被转录或翻译。一旦肿瘤细胞移植到体内，在某些未知调控因素影响下，肿瘤抗原基因被激活，再度表达。目前有2例报道介绍体内外抗原表达的差异，人神经母细胞瘤建株传代后失去了分泌儿茶酚胺的能力，体内的某些因素对分泌儿茶酚胺有决定性意义[7]；另外结肠癌细胞株LS-174T能低水平表达TAG-72肿瘤相关抗原，当该细胞株移植入裸鼠后，能高度表达TAG-72抗原，这种差异达到100倍，接近人体内肿瘤组织的表达水平[8]。CA-X抗原可能同样处于这样的基因调控下。
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对肿瘤相关抗原体内外表达的差异尚难提出明确的调控机制，但有两方面的工作或许有助于揭示其机制。有作者模仿肿瘤组织，用立体组织细胞培养的方法，培养LS-174T细胞，能使 TAG-72抗原的表达比单层细胞培养提高 2～7倍[8]。这两种培养方法比较显著的差异在于每簇细胞的数量，单层细胞培养每簇细胞数约数百个，而立体组织细胞培养大约(1～10)×106。由此可见，细胞与细胞之间空间构型乃至细胞之间的信号转导对肿瘤相关抗原的表达发挥了重要作用。Yamashita等[9]认为细胞密度影响粘蛋白的分泌。本实验为研究细胞信号转导提供了很好的模型。其次，目前已有报道证实，干扰素能提高肿瘤抗原的表达，在人体内、裸鼠、体外细胞培养都有相同的结论，这种促进作用不再仅仅涉及肿瘤细胞间信号转导，而且涉及细胞因子对肿瘤基因的调控[10]。这种体内、体外的差异至少说明了两个问题：(1) 建株细胞和在体细胞有着许多性质上的区别，因而单凭体外的实验往往不足以说明问题，如杀伤活性等实验，必须结合体内实验，尽可能建立肿瘤动物模型，才能比较客观地反映肿瘤在人体的特性。(2) 这种差异表达的肿瘤相关基因，所表达的基因产物，必然在肿瘤发生、生长、发展、预后中发挥重要功能，如细胞接触抑制、远处转移，对这些抗原的再认识，有助于揭示肿瘤发生、发展的机制。
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本实验所揭示的事实，即肿瘤相关抗原在体内外表达的差异，有助于我们对CA-X抗原的深入了解。通过两种方式生长细胞的差异显示，构建噬菌体表面表达文库，用抗体筛选，克隆CA-X的全基因,从而将彻底了解该抗原的结构和功能。我们将在这方面予以深入研究。
作者简介：王雄彪，男，1962年7月生，博士，主治医师
参考文献
1 Sambrook J，Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989. 880
2 Sivinski CL, Lindner DJ, Borden EC, et al. Modulation of tumor-associated antigen expression on human pancreatic and prostate carcinoma cells in vitro by alpha- and gamma-interferons[J]. J Immunother Emphasis Tumor Immunol， 1995,18(3):156
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3 Obrink B. CEA adhesion molecules: multifunctional proteins with signal-regulatory properties[J]. Curr Opin Cell Biol， 1997,9(5): 616
4 Klopocki AG, Krop Watorek A, Dus D, et al. Adhesion of human uroepithelial cells to E-selectin: possible involvement of sialosyl LewisA-ganglioside[J]. Int J Cancer， 1996， 68(2): 239
5 Narimatsu H, Iwasaki H, Nishihara S, et al. Genetic evidence for the Lewis enzyme, which synthesizes type-1 Lewis antigens in colon tissue, and intracellular localization of the enzyme[J]. Cancer Res， 1996， 56(2): 330
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6 Hartmann C, Kluwe L, Lucke M, et al. The rate of homozygous CDKN2A/p16 deletions in glioma cell lines and in primary tumors[J]. Int J Oncol， 1999, 15(5):975
7 Tomayko MM, Triche TJ, Reynolds CP. Human neuroblastoma cell lines regain catecholamine fluorescence when xenografted into athymic (nude) mice[J]. Int J Dev Neurosci，1996， 14(6): 771
8 Horan-Hand P, Colcher D, Salomon D, et al. Influence of spatial configuration of carcinoma cell populations on the expression of a tumor-associated glycoprotein[J]. Cancer Res， 1985， 45(2): 833
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9 Yamashita Y, Ho JJ, Cheng S, et al. Expression of mucin-associated tumor antigens is altered by cell density[J]. Int J Cancer，1997， 72(3): 457
10 Greiner JW, Guadagni F, Roselli M, et al. Improved experimental radioimmunotherapy of colon xenografts by combining 131I-CC49 and interferon-gamma[J]. Dis Colon Rectum， 1994， 37 (2 Suppl): S100
(1999-05-18收稿，1999-10-31修回), 百拇医药