一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用
作者：白 冲 韩一平 刘忠令 张世明
单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433
关键词：巨噬细胞；肺泡；一氧化氮合酶；肿瘤
摘要 目的摘要 目的：研究肺巨噬细胞(M
)内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及其产物一氧化氮(NO)在抗肿瘤免疫中的作用。方法：取小鼠肺泡灌洗液,用体外细胞培养技术，并加入不同剂量的干扰素γ(INFγ)制成肺M悬液,与肿瘤 P815细胞培养后测定NOS活性及NO含量；同时测定加特异性NOS抑制剂NG单甲基左旋精氨酸(L-NMMA)和不加L-NMMA的肺M肿瘤杀伤活性的抑制率。结果：不同剂量INFγ与活化的肺M共同培养后，培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高，且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P<0.01)；同时肺M iNOS的活性也随着INFγ剂量的增加而升高，两者呈显著正相关(r=0.990，t=19.78，P<0.01)；预先加入 L- NMMA的活化肺M与 P815细胞培养液中,NO含量减低(P<0.05),对 P815抑制率明显降低(P<0.05)。结论：活化的肺M中由iNOS催化产生的NO是杀伤肿瘤细胞的一个重要效应分子。
, 百拇医药
中国分类号 R 734.205 文章编号：0258-879X(1999)12-0977-03 文献标识码：A
The role of nitric oxide and nitric oxide synthase in killing tumor cells
Bai Chong, Han Yiping, Liu Zhongling, Zhang Shiming
(Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital, Second Military Medical University，Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To study the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in activated macrophages and nitric oxide (NO) in the defence against tumors. Methods: Macrophages were obtained by alveolar lavages of mice and activated through incubation with recombinant murine INFγ in vitro. P815 cells were added to the culture. Culture supernates were collected to measure the activity of iNOS and NO. Tumoricidal activity of macrophages was determined in presence and absence of the specific inhibitor of NO synthase: L-NMMA. Results: NO production and activity of iNOS induced by activated macrophages were positively related with concentration of INFγ in macrophage P815 coculture. The addition of L-NMMA to the culture suppressed NO production, the inhibitory rate of activated macrophages against P815 cells was reduced distinctly (P<0.05). Conclusion: NO produced by iNOS-induced alveolar macrophage can kill tumor cells.
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KEY WORDS macrophages, alveolar； nitric oxide synthase；neoplasms
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 977～979]
活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用[1]。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺M NOS活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。
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1 材料和方法
1.1 肺M的制备及培养 体质量20～25 g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1 ml,共15次。将回收的灌洗液以1 500 r/min离心10 min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成 1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5% CO2培养2 h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200 U/ml)的干扰素γ(INFγ),继续培养24 h。
1.2 肿瘤细胞培养上清液的收集 将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞 P815 (上海肿瘤研究所提供)以 5×105个/ml的密度培养在RPMI 1640培养液中,置37℃,5% CO2培养箱培养48 h, 2 500 r/min离心20 min,取上清液,置-20℃保存待用。
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1.3 iNOS活性测定 用Smith薄层层析法[2]测定上清液培养标本中瓜氨酸 (citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。
1.4 NO测定 10 mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10 mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545 nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式[3]。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂(1%磺胺、0.1%萘乙二胺、2.5%磷酸),室温放置10 min，545 nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。
1.5 肺M肿瘤杀伤活性测定 在培养板内加入肺M悬液 100 μl/孔，实验组再加入2 mmol/L NG单甲基左旋精氨酸(L-NMMA，Sigma公司)，50 μl/孔，置37℃，5% CO2培养箱培养 4 h，再加入含10% P815上清液的营养液 100 μl/孔，置37℃,5%CO2培养72 h。每孔加二甲基亚砜(DMSO) 100 μl,混匀静置20 min,在PG-3022酶联仪上用570 nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。
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1.6 统计学处理 所有数据采用
±s表示，组间显著性检验用配对资料t检验，各指标进行直线相关分析。
2 结果
2.1 不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响 不同剂量的 INFγ与活化的肺M共同培养24 h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P<0.01)。
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图1 INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响
Fig 1 The effect of INFγ on NO production and
activity of iNOS by macrophages
●: NO; ▲: iNOS
2.2 INFγ对肺M NOS活性的影响 不同剂量INFγ作用于肺M后，肺M iNOS活性随INFγ剂量的增加而升高(图1),与INFγ的剂量有明显的相关性(r=0.990, t=19.78，P<0.01)。
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2.3 L-NMMA对肺M肿瘤杀伤活性的影响 活化的肺M与P815单独作用时，其培养上清液中NO的浓度为(18.47±5.00) μmol/L，而预先加入 L-NMMA再培养的上清液中NO浓度为(11.07±4.06) μmol/L，两组之间有显著性差异(P<0.05)；未加L-NMMA组肺M对P815细胞生长的抑制率为66.6%，预先加入 L-NMMA组为43.3%，较前者明显降低[两组D(570)值分别为0.132±0.032和0.292±0.065，P<0.05]。
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3 讨论
NO由L-精氨酸经NOS作用而生成。NOS主要有两种同工酶：结构型(constitutive, cNOS)和诱导型(inducible,iNOS)。M、库普弗细胞是 iNOS的主要表达细胞，因此从肺M内测得的为iNOS[4]。某些细胞因子，如INFγ、TNFα、IL-2等可诱导iNOS的活性，增加NO的合成[5]。
活化的M具有杀伤肿瘤细胞的能力,其作用机制是多样的,可能是通过细胞间的联接或是依赖于一种或多种细胞毒效应分子，包括IL-2、过氧化氢、TNF等。自1985年发现活化的M可产生NO以来[6]，随着有关NO研究的深入，越来越多的结果表明NO与活化M杀伤肿瘤细胞的作用密切相关。Hibbs等[7]首先发现在缺乏精氨酸的培养条件下，活化的M的细胞毒效应作用不能表达，由此推测精氨酸的分解代谢产物NO是活化的M的细胞毒效应分子。以后的研究证实了NO具有抑制细胞生长和细胞毒性作用。本研究发现，活化的肺M可以产生NO，并对肿瘤细胞 P815有杀伤作用；在加入作为 NOS的竞争性抑制剂的L-NMMA后，NOS代谢产物NO减少，对 P815的杀伤作用也相应减弱，从而也证实了由iNOS催化产生的NO是活化的肺M杀伤肿瘤细胞的一个重要的效应分子。
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NO介导杀伤肿瘤细胞的机制可能是其与铁硫键(Fe-S)基团作用，形成铁-亚硝基复合物，从而引起顺乌头酸酶(aconitase)和线粒体呼吸链上的复合物Ⅰ与复合物Ⅱ中的 Fe-S辅基的纯化与降解，从而引起细胞毒性[8]。肿瘤细胞内铁的大量丧失，破坏了许多代谢酶的活性，因此可阻断肿瘤靶细胞的能量代谢和 DNA复制。同时活化的M产生的NO可通过促进细胞内 cGMP的升高来诱导并促进细胞凋亡的发生，从而抑制肿瘤细胞生长或引起肿瘤细胞的凋亡[9]。
综上所述，肺M内iNOS及其代谢产物NO与肺M肿瘤杀伤作用之间存在着明显的关系，通过各种手段提高肺M NO的产生，可能为肺癌的治疗提供一条新的途径。
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作者简介：白冲，男，1964年8月生，硕士，副教授
参考文献
1 Cui S, Reichner JS, Mateo RB, et al. Activated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide- dependent or -independent mechanisms[J]. Cancer Res，1994,54 (9)：2462
2 Smith SD, Wheeler MA, Weiss RM. Nitric oxide synthase: an endogenous source of elevated nitrite in infected urine[J]. Kidney Int, 1994,45(2):586
, 百拇医药
3 Wang W, Keller K, Chadee K. Entamoeba histolytica modulates the nitric oxide synthase gene and nitric oxide production by macrophages for cytotoxicity against amoebae and tumour cells[J]. Immunology, 1994,83(4):601
4 Langrehr JM, Hoffman RA, Lancaster JR,et al. Nitric oxide ——a new endogenous immunomodulator[J]. Transplantation,1993, 55(6):1205
5 Sanchez-Bueno A, Verkhusha V, Tanaka Y, et al. Interferon-γ-dependent expression of inducible nitric oxide synthase, interleukin-12, and interferon -γ- inducing factor in macrophages elicited by allografted tumor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996,224(2):555
, 百拇医药
6 Stuehr DJ, Marletta MA. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1985,82(22):7738
7 Hibbs JB Jr, Taintor RR, Vavrin Z. Macrophage cytotoxicity: role for L-arginine deiminase and iminonitrogen oxidation to nitrite[J]. Science,1987,235(4787):473
8 Sarih M, Souvannavong V, Adam A. Nitric oxide synthase induces macrophage death by apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993,191(2):503
9 Shimaoka M, Iida T,Ohara A, et al. NOC,a nitric-oxide-releasing compound, induces dose dependent apoptosis in macrophages[J]. Biochem Biophys Res Commun，1995,209(2):519
(1999-05-18收稿，1999-10-28修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433
关键词：巨噬细胞；肺泡；一氧化氮合酶；肿瘤
摘要 目的摘要 目的：研究肺巨噬细胞(M
)内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及其产物一氧化氮(NO)在抗肿瘤免疫中的作用。方法：取小鼠肺泡灌洗液,用体外细胞培养技术，并加入不同剂量的干扰素γ(INFγ)制成肺M悬液,与肿瘤 P815细胞培养后测定NOS活性及NO含量；同时测定加特异性NOS抑制剂NG单甲基左旋精氨酸(L-NMMA)和不加L-NMMA的肺M肿瘤杀伤活性的抑制率。结果：不同剂量INFγ与活化的肺M共同培养后，培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高，且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P<0.01)；同时肺M iNOS的活性也随着INFγ剂量的增加而升高，两者呈显著正相关(r=0.990，t=19.78，P<0.01)；预先加入 L- NMMA的活化肺M与 P815细胞培养液中,NO含量减低(P<0.05),对 P815抑制率明显降低(P<0.05)。结论：活化的肺M中由iNOS催化产生的NO是杀伤肿瘤细胞的一个重要效应分子。, 百拇医药
中国分类号 R 734.205 文章编号：0258-879X(1999)12-0977-03 文献标识码：A
The role of nitric oxide and nitric oxide synthase in killing tumor cells
Bai Chong, Han Yiping, Liu Zhongling, Zhang Shiming
(Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital, Second Military Medical University，Shanghai,200433)
ABSTRACT Objective: To study the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in activated macrophages and nitric oxide (NO) in the defence against tumors. Methods: Macrophages were obtained by alveolar lavages of mice and activated through incubation with recombinant murine INFγ in vitro. P815 cells were added to the culture. Culture supernates were collected to measure the activity of iNOS and NO. Tumoricidal activity of macrophages was determined in presence and absence of the specific inhibitor of NO synthase: L-NMMA. Results: NO production and activity of iNOS induced by activated macrophages were positively related with concentration of INFγ in macrophage P815 coculture. The addition of L-NMMA to the culture suppressed NO production, the inhibitory rate of activated macrophages against P815 cells was reduced distinctly (P<0.05). Conclusion: NO produced by iNOS-induced alveolar macrophage can kill tumor cells.
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KEY WORDS macrophages, alveolar； nitric oxide synthase；neoplasms
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 977～979]
活化的巨噬细胞(M
)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用[1]。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺M NOS活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 肺M
的制备及培养 体质量20～25 g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1 ml,共15次。将回收的灌洗液以1 500 r/min离心10 min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成 1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5% CO2培养2 h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200 U/ml)的干扰素γ(INFγ),继续培养24 h。1.2 肿瘤细胞培养上清液的收集 将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞 P815 (上海肿瘤研究所提供)以 5×105个/ml的密度培养在RPMI 1640培养液中,置37℃,5% CO2培养箱培养48 h, 2 500 r/min离心20 min,取上清液,置-20℃保存待用。
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1.3 iNOS活性测定 用Smith薄层层析法[2]测定上清液培养标本中瓜氨酸 (citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。
1.4 NO测定 10 mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10 mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545 nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式[3]。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂(1%磺胺、0.1%萘乙二胺、2.5%磷酸),室温放置10 min，545 nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。
1.5 肺M
肿瘤杀伤活性测定 在培养板内加入肺M悬液 100 μl/孔，实验组再加入2 mmol/L NG单甲基左旋精氨酸(L-NMMA，Sigma公司)，50 μl/孔，置37℃，5% CO2培养箱培养 4 h，再加入含10% P815上清液的营养液 100 μl/孔，置37℃,5%CO2培养72 h。每孔加二甲基亚砜(DMSO) 100 μl,混匀静置20 min,在PG-3022酶联仪上用570 nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。, 百拇医药
1.6 统计学处理 所有数据采用
±s表示，组间显著性检验用配对资料t检验，各指标进行直线相关分析。2 结果
2.1 不同剂量INFγ对肺M
产生NO的影响 不同剂量的 INFγ与活化的肺M共同培养24 h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P<0.01)。, http://www.100md.com
图1 INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响
Fig 1 The effect of INFγ on NO production and
activity of iNOS by macrophages
●: NO; ▲: iNOS
2.2 INFγ对肺M
NOS活性的影响 不同剂量INFγ作用于肺M后，肺M iNOS活性随INFγ剂量的增加而升高(图1),与INFγ的剂量有明显的相关性(r=0.990, t=19.78，P<0.01)。, 百拇医药
2.3 L-NMMA对肺M
肿瘤杀伤活性的影响 活化的肺M与P815单独作用时，其培养上清液中NO的浓度为(18.47±5.00) μmol/L，而预先加入 L-NMMA再培养的上清液中NO浓度为(11.07±4.06) μmol/L，两组之间有显著性差异(P<0.05)；未加L-NMMA组肺M对P815细胞生长的抑制率为66.6%，预先加入 L-NMMA组为43.3%，较前者明显降低[两组D(570)值分别为0.132±0.032和0.292±0.065，P<0.05]。, 百拇医药
3 讨论
NO由L-精氨酸经NOS作用而生成。NOS主要有两种同工酶：结构型(constitutive, cNOS)和诱导型(inducible,iNOS)。M
、库普弗细胞是 iNOS的主要表达细胞，因此从肺M内测得的为iNOS[4]。某些细胞因子，如INFγ、TNFα、IL-2等可诱导iNOS的活性，增加NO的合成[5]。活化的M
具有杀伤肿瘤细胞的能力,其作用机制是多样的,可能是通过细胞间的联接或是依赖于一种或多种细胞毒效应分子，包括IL-2、过氧化氢、TNF等。自1985年发现活化的M可产生NO以来[6]，随着有关NO研究的深入，越来越多的结果表明NO与活化M杀伤肿瘤细胞的作用密切相关。Hibbs等[7]首先发现在缺乏精氨酸的培养条件下，活化的M的细胞毒效应作用不能表达，由此推测精氨酸的分解代谢产物NO是活化的M的细胞毒效应分子。以后的研究证实了NO具有抑制细胞生长和细胞毒性作用。本研究发现，活化的肺M可以产生NO，并对肿瘤细胞 P815有杀伤作用；在加入作为 NOS的竞争性抑制剂的L-NMMA后，NOS代谢产物NO减少，对 P815的杀伤作用也相应减弱，从而也证实了由iNOS催化产生的NO是活化的肺M杀伤肿瘤细胞的一个重要的效应分子。, 百拇医药
NO介导杀伤肿瘤细胞的机制可能是其与铁硫键(Fe-S)基团作用，形成铁-亚硝基复合物，从而引起顺乌头酸酶(aconitase)和线粒体呼吸链上的复合物Ⅰ与复合物Ⅱ中的 Fe-S辅基的纯化与降解，从而引起细胞毒性[8]。肿瘤细胞内铁的大量丧失，破坏了许多代谢酶的活性，因此可阻断肿瘤靶细胞的能量代谢和 DNA复制。同时活化的M
产生的NO可通过促进细胞内 cGMP的升高来诱导并促进细胞凋亡的发生，从而抑制肿瘤细胞生长或引起肿瘤细胞的凋亡[9]。综上所述，肺M
内iNOS及其代谢产物NO与肺M肿瘤杀伤作用之间存在着明显的关系，通过各种手段提高肺M NO的产生，可能为肺癌的治疗提供一条新的途径。, 百拇医药
作者简介：白冲，男，1964年8月生，硕士，副教授
参考文献
1 Cui S, Reichner JS, Mateo RB, et al. Activated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide- dependent or -independent mechanisms[J]. Cancer Res，1994,54 (9)：2462
2 Smith SD, Wheeler MA, Weiss RM. Nitric oxide synthase: an endogenous source of elevated nitrite in infected urine[J]. Kidney Int, 1994,45(2):586
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3 Wang W, Keller K, Chadee K. Entamoeba histolytica modulates the nitric oxide synthase gene and nitric oxide production by macrophages for cytotoxicity against amoebae and tumour cells[J]. Immunology, 1994,83(4):601
4 Langrehr JM, Hoffman RA, Lancaster JR,et al. Nitric oxide ——a new endogenous immunomodulator[J]. Transplantation,1993, 55(6):1205
5 Sanchez-Bueno A, Verkhusha V, Tanaka Y, et al. Interferon-γ-dependent expression of inducible nitric oxide synthase, interleukin-12, and interferon -γ- inducing factor in macrophages elicited by allografted tumor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996,224(2):555
, 百拇医药
6 Stuehr DJ, Marletta MA. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1985,82(22):7738
7 Hibbs JB Jr, Taintor RR, Vavrin Z. Macrophage cytotoxicity: role for L-arginine deiminase and iminonitrogen oxidation to nitrite[J]. Science,1987,235(4787):473
8 Sarih M, Souvannavong V, Adam A. Nitric oxide synthase induces macrophage death by apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993,191(2):503
9 Shimaoka M, Iida T,Ohara A, et al. NOC,a nitric-oxide-releasing compound, induces dose dependent apoptosis in macrophages[J]. Biochem Biophys Res Commun，1995,209(2):519
(1999-05-18收稿，1999-10-28修回), http://www.100md.com