心脑瑞对oxLDL引起U937细胞毒性和增殖作用的影响*
作者：雷著斌 吉 玲 段 颖 荆 清 秦永文
单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；吉玲 北京松龄医药研究所
关键词：心脑瑞；脂蛋白类；LDL；单核细胞；细胞毒性；增殖
第二军医大学学报991203 摘要 目的：研究新型中成药心脑瑞对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)引起人前单核细胞系U937细胞毒性作用和增殖作用的影响。方法：以乳酸脱氢酶(LDH)释放法及利用细胞增殖测定试剂WST-1，分别测定U937细胞损伤和增殖情况。结果：心脑瑞2.5～25 μg/ml时，可以显著抑制50 μg/ml oxLDL引起的U937细胞释放LDH，并能显著抑制5 μg/ml oxLDL引起的U937细胞增殖。结论：心脑瑞对oxLDL引起的U937细胞的损伤有保护作用，对其引起的U937细胞的增殖有抑制作用。
中图分类号 R 285 文章编号：0258-879X(1999)12-0944-03 文献标识码：A
, 百拇医药
Effects of shilery on the cytotoxicity and proliferation of U937 cells induced by oxLDL
Lei Zhubin, Ji Ling, Duan Ying, Jin Qing, Qin Yongwen
(Department of Cardiovasology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the effects of Shilery(SL), a preserved Chinese traditional drug, on the cytotoxicity and proliferation of U937 cells induced by oxLDL. Methods: The injury and proliferation of U937 cells were respectively determined by lactic dehydrogenase (LDH) release kit and cell proliferation kit, WST-1. Results: SL of 2.5 to 25 μg/ml inhibited U937 cells from releasing LDH induced by oxLDL of 50 μg/ml and proliferating caused by oxLDL of 5 μg/ml. Conclusion: SL has protective effects on the injury and proliferation of U937 cells induced by oxLDL.
, 百拇医药
KEY WORDS shilery; lipoproteins, LDL; monocytes; cytotoxicity; proliferation
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 944～946]
血液单核细胞迁移入动脉内皮下是动脉粥样硬化(AS)发生过程中的最早事件，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在其中起重要作用。oxLDL被动脉壁内的单核-巨噬细胞(M
)大量摄取后，可转化为泡沫细胞；此外，oxLDL还具有细胞毒性作用，并能刺激细胞产生各种细胞因子及生长因子，从而促进AS的发展[1]。因此，可以利用oxLDL来研究抗AS药物的作用。心脑瑞(SL) 是一种新型的中成药, 其主要成分是葛根和珍珠层粉，临床上用于降低高血压，改善心脏血液循环等。本研究利用人前单核细胞系U937细胞观察oxLDL引起的细胞毒和增殖作用，以及SL对这两种作用的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人前单核细胞系U937细胞购自中科院上海细胞研究所。SL：原药由北京松龄医药研究所提供；RPMI 1640：美国Gibco公司；细胞毒测定试剂盒及细胞增殖测定试剂盒(WST-1)：德国Boehringer Mannheim公司。 CO2培养箱：美国Qneu公司；超净工作台：苏州净化设备厂；倒置相差显微镜：Olympus公司；全自动酶标检测仪：BioTek公司; 超速离心机: Beckman XL-90,Type70 Ti转头。
1.2 方法
1.2.1 oxLDL制备及鉴定 正常人新鲜血浆，用两步超速离心法快速分离低密度脂蛋白(LDL)[2]，LDL溶于PBS，加入灭菌CuSO4溶液(终浓度10 μmol/L)，37℃温育24 h制备oxLDL，并经0.4%琼脂糖凝胶电泳、苏丹黑B染色后观察迁移率，以验证氧化程度。
, 百拇医药
1.2.2 SL对U937细胞毒性作用 取生长良好的U937细胞，铺于96孔板上，每孔加90 μl无血清RPMI 1640细胞悬液，细胞密度3×104个/孔，分别在每孔加入含不同终质量浓度(0～250 μg/ml)SL的稀释液，温育24 h后，每孔各吸取50 μl的细胞上清液，用细胞毒测定试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，以490 nm处光密度值(D)表示。
1.2.3 oxLDL对U937细胞毒作用及SL的保护作用 同上将细胞悬液铺于96孔板，细胞密度3×104个/孔。分别在各孔中加入不同终质量浓度(0,25，50，100，150，200 μg/ml)oxLDL；或分别在各孔中加入不同终质量浓度(0,2.5,5.0,10.0,25.0 μg/ml) SL 5 μl预培养15 min后，再加入终质量浓度为50 μg/ml的oxLDL 5 μl，温育24 h后，测定上清液的LDH活性。
1.2.4 oxLDL对U937细胞的增殖作用及SL的抑制作用 同上将细胞悬液铺于96孔板，细胞密度3×104个/孔。分别在各孔中加入不同终质量浓度(1，5,10 μg/ml)oxLDL；或分别在每孔中加入各种终质量浓度(0,2.5,5.0,10.0,25.0 μg/ml)SL 5 μl预处理15 min后，再加入终质量浓度为5 μg/ml的oxLDL 5 μl。温育48 h后，每孔分别加10 μl WST-1,37℃、5% CO2温育4 h，检测每孔D(450)，以判断细胞增殖情况。
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1.3 统计学处理 实验数据均以
±s表示，采用非配对资料t检验进行显著性检验。
2 结果
2.1 SL对培养细胞的毒性作用 不同质量浓度SL与U937细胞温育24 h， 在2.5～100 μg/ml范围内，LDH活性与对照组无显著性差异； 在250 μg/ml时与对照组有显著性差异(P<0.01)(资料未显示)。表明：SL 2.5～100 μg/ml时对U937细胞无明显毒性作用，超高浓度(250 μg/ml)时则对U937细胞有一定毒性作用。
2.2 SL对oxLDL促进U937细胞释放LDH的拮抗作用 oxLDL 在25～200 μg/ml时LDH活性与未加oxLDL时有显著性差异(P<0.01),并随oxLDL浓度呈剂量依赖性增加(资料未显示)。以50 μg/ml 作为oxLDL对于U937 细胞毒的作用剂量，预先加入2.5～25 μg/ml SL,再加入50 μg/ml oxLDL时，LDH活性较未加SL时有明显差异(P<0.01，表1)。表明：SL呈剂量依赖性拮抗高浓度oxLDL引起的U937细胞释放LDH。
, 百拇医药
表1 SL对oxLDL引起U937细胞毒性
及增殖作用的影响
Tab 1 Protective effect of SL on U937 cytotoxicity
and proliferation induced by oxLDL
(n=4,±s) Group
Cytotoxicity
[D(490)]a
Proliferation
, 百拇医药
[D(450)]b
Control
1.015±0.084
1.340±0.105
SL(ρB/μg.ml-1)
2.5
0.783±0.081**
0.997±0.083ΔΔ
5.0
0.661±0.075**
, 百拇医药
0.869±0.075ΔΔ
10.0
0.534±0.048**
0.845±0.077ΔΔ
25.0
0.523±0.051**
0.794±0.081ΔΔ
a: Incubated with 50 μg/ml oxLDL; b: Incubated with 5 μg/ml oxLDL; **P<0.01 vs control group [D(490)]；△△P<0.01 vs control group [D(450)]
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2.3 SL对oxLDL引起U937细胞增殖的抑制作用 oxLDL 在1～10 μg/ml时D(450)值与未加oxLDL时有明显差异(P<0.01),并随oxLDL浓度呈剂量依赖性增加(资料未显示)。以5 μg/ml 作为oxLDL对于U937促增殖作用剂量。预先加入2.5～25 μg/ml SL，再加入5 μg/ml oxLDL时的 D(450)值较未加SL时有明显差异(P<0.01，表1)。表明： SL呈剂量依赖性抑制oxLDL引起的U937细胞增殖。
3 讨论
LDL被氧化修饰是引起AS的一个主要原因。当LDL颗粒进入动脉壁以后，能进一步氧化并被细胞表面的清道夫受体识别而发生内吞，单核细胞内吞oxLDL后形成单核细胞源性泡沫细胞。oxLDL对单核-M有毒性，并造成炎症反应的进一步扩大和晚期动脉粥样硬化性斑块中坏死中心的形成[3]。单核-M增殖是AS进一步发展的另一原因。近年来，随着AS发病机制研究的进一步深入，人们进一步认识到AS是受多种因素的影响而形成的一类病理变化复杂的疾病，从而在多方面发展抗AS药物，如调血脂药、抗血小板药、抗高血压药、抗氧化剂等，其中重要的一项是研究药物能否拮抗oxLDL的作用[4]。SL临床上用于有头痛晕厥、急躁易怒、心悸失眠等属于肝阳上亢症状的高血压患者；在高血压和高血脂的动物模型上有降低血压和调血脂作用。
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U937细胞现已被广泛用作单核细胞的研究模型[5]。我们发现在培养的U937细胞模型中，低浓度(1～10 μg/ml) oxLDL对细胞有促增殖作用，高浓度(25～200 μg/ml)oxLDL对细胞产生明显的细胞毒作用。本研究结果初步表明，SL可抑制低浓度oxLDL对U937细胞的促增殖作用，并能拮抗高浓度oxLDL对U937细胞的损伤作用，提示SL在防治AS中具有潜在的作用。至于SL具体作用机制是由于其对oxLDL的中和破坏作用，还是由于在细胞水平上阻断了oxLDL对单核细胞的破坏作用，值得进一步研究。
*国家自然科学基金资助项目，批准号39600063
作者简介：雷著斌，男，1965年9月生，硕士，主治医师
参考文献
1 Sternberg D. Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance[J]. J Biol Chem,1997，272(34):20963
, 百拇医药
2 王淳本，宗义强，吴万生， 等. 两步超速离心法快速分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白[J]. 同济医科大学学报，1995，24(3): 169
3 Goldstein JL, Basu SK, Brown MS. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein in cultured cells[J]. Methods Enzymol,1984,98(3):241
4 Walters-Laporte E, Furman C, Fouquet S, et al. A high concentration of melatonin inhibits in vitro LDL peroxidation but not oxidized LDL toxicity towards cultured endothelial cells[J]. J Cardiovasc Pharmacol,1998,32(4):582
5 Oberg F,Botting J, Nilsson K. Macrophages and the cytokine network[J]. Transplant Proc, 1993,25(2):2044
(1999-05-11收稿，1999-11-09修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；吉玲 北京松龄医药研究所
关键词：心脑瑞；脂蛋白类；LDL；单核细胞；细胞毒性；增殖
第二军医大学学报991203 摘要 目的：研究新型中成药心脑瑞对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)引起人前单核细胞系U937细胞毒性作用和增殖作用的影响。方法：以乳酸脱氢酶(LDH)释放法及利用细胞增殖测定试剂WST-1，分别测定U937细胞损伤和增殖情况。结果：心脑瑞2.5～25 μg/ml时，可以显著抑制50 μg/ml oxLDL引起的U937细胞释放LDH，并能显著抑制5 μg/ml oxLDL引起的U937细胞增殖。结论：心脑瑞对oxLDL引起的U937细胞的损伤有保护作用，对其引起的U937细胞的增殖有抑制作用。
中图分类号 R 285 文章编号：0258-879X(1999)12-0944-03 文献标识码：A
, 百拇医药
Effects of shilery on the cytotoxicity and proliferation of U937 cells induced by oxLDL
Lei Zhubin, Ji Ling, Duan Ying, Jin Qing, Qin Yongwen
(Department of Cardiovasology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the effects of Shilery(SL), a preserved Chinese traditional drug, on the cytotoxicity and proliferation of U937 cells induced by oxLDL. Methods: The injury and proliferation of U937 cells were respectively determined by lactic dehydrogenase (LDH) release kit and cell proliferation kit, WST-1. Results: SL of 2.5 to 25 μg/ml inhibited U937 cells from releasing LDH induced by oxLDL of 50 μg/ml and proliferating caused by oxLDL of 5 μg/ml. Conclusion: SL has protective effects on the injury and proliferation of U937 cells induced by oxLDL.
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KEY WORDS shilery; lipoproteins, LDL; monocytes; cytotoxicity; proliferation
[Acad J Sec Mil Med Univ, 1999, 20(12): 944～946]
血液单核细胞迁移入动脉内皮下是动脉粥样硬化(AS)发生过程中的最早事件，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在其中起重要作用。oxLDL被动脉壁内的单核-巨噬细胞(M
)大量摄取后，可转化为泡沫细胞；此外，oxLDL还具有细胞毒性作用，并能刺激细胞产生各种细胞因子及生长因子，从而促进AS的发展[1]。因此，可以利用oxLDL来研究抗AS药物的作用。心脑瑞(SL) 是一种新型的中成药, 其主要成分是葛根和珍珠层粉，临床上用于降低高血压，改善心脏血液循环等。本研究利用人前单核细胞系U937细胞观察oxLDL引起的细胞毒和增殖作用，以及SL对这两种作用的影响。, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人前单核细胞系U937细胞购自中科院上海细胞研究所。SL：原药由北京松龄医药研究所提供；RPMI 1640：美国Gibco公司；细胞毒测定试剂盒及细胞增殖测定试剂盒(WST-1)：德国Boehringer Mannheim公司。 CO2培养箱：美国Qneu公司；超净工作台：苏州净化设备厂；倒置相差显微镜：Olympus公司；全自动酶标检测仪：BioTek公司; 超速离心机: Beckman XL-90,Type70 Ti转头。
1.2 方法
1.2.1 oxLDL制备及鉴定 正常人新鲜血浆，用两步超速离心法快速分离低密度脂蛋白(LDL)[2]，LDL溶于PBS，加入灭菌CuSO4溶液(终浓度10 μmol/L)，37℃温育24 h制备oxLDL，并经0.4%琼脂糖凝胶电泳、苏丹黑B染色后观察迁移率，以验证氧化程度。
, 百拇医药
1.2.2 SL对U937细胞毒性作用 取生长良好的U937细胞，铺于96孔板上，每孔加90 μl无血清RPMI 1640细胞悬液，细胞密度3×104个/孔，分别在每孔加入含不同终质量浓度(0～250 μg/ml)SL的稀释液，温育24 h后，每孔各吸取50 μl的细胞上清液，用细胞毒测定试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，以490 nm处光密度值(D)表示。
1.2.3 oxLDL对U937细胞毒作用及SL的保护作用 同上将细胞悬液铺于96孔板，细胞密度3×104个/孔。分别在各孔中加入不同终质量浓度(0,25，50，100，150，200 μg/ml)oxLDL；或分别在各孔中加入不同终质量浓度(0,2.5,5.0,10.0,25.0 μg/ml) SL 5 μl预培养15 min后，再加入终质量浓度为50 μg/ml的oxLDL 5 μl，温育24 h后，测定上清液的LDH活性。
1.2.4 oxLDL对U937细胞的增殖作用及SL的抑制作用 同上将细胞悬液铺于96孔板，细胞密度3×104个/孔。分别在各孔中加入不同终质量浓度(1，5,10 μg/ml)oxLDL；或分别在每孔中加入各种终质量浓度(0,2.5,5.0,10.0,25.0 μg/ml)SL 5 μl预处理15 min后，再加入终质量浓度为5 μg/ml的oxLDL 5 μl。温育48 h后，每孔分别加10 μl WST-1,37℃、5% CO2温育4 h，检测每孔D(450)，以判断细胞增殖情况。
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1.3 统计学处理 实验数据均以
±s表示，采用非配对资料t检验进行显著性检验。2 结果
2.1 SL对培养细胞的毒性作用 不同质量浓度SL与U937细胞温育24 h， 在2.5～100 μg/ml范围内，LDH活性与对照组无显著性差异； 在250 μg/ml时与对照组有显著性差异(P<0.01)(资料未显示)。表明：SL 2.5～100 μg/ml时对U937细胞无明显毒性作用，超高浓度(250 μg/ml)时则对U937细胞有一定毒性作用。
2.2 SL对oxLDL促进U937细胞释放LDH的拮抗作用 oxLDL 在25～200 μg/ml时LDH活性与未加oxLDL时有显著性差异(P<0.01),并随oxLDL浓度呈剂量依赖性增加(资料未显示)。以50 μg/ml 作为oxLDL对于U937 细胞毒的作用剂量，预先加入2.5～25 μg/ml SL,再加入50 μg/ml oxLDL时，LDH活性较未加SL时有明显差异(P<0.01，表1)。表明：SL呈剂量依赖性拮抗高浓度oxLDL引起的U937细胞释放LDH。
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表1 SL对oxLDL引起U937细胞毒性
及增殖作用的影响
Tab 1 Protective effect of SL on U937 cytotoxicity
and proliferation induced by oxLDL
(n=4,
±s) GroupCytotoxicity
[D(490)]a
Proliferation
, 百拇医药
[D(450)]b
Control
1.015±0.084
1.340±0.105
SL(ρB/μg.ml-1)
2.5
0.783±0.081**
0.997±0.083ΔΔ
5.0
0.661±0.075**
, 百拇医药
0.869±0.075ΔΔ
10.0
0.534±0.048**
0.845±0.077ΔΔ
25.0
0.523±0.051**
0.794±0.081ΔΔ
a: Incubated with 50 μg/ml oxLDL; b: Incubated with 5 μg/ml oxLDL; **P<0.01 vs control group [D(490)]；△△P<0.01 vs control group [D(450)]
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2.3 SL对oxLDL引起U937细胞增殖的抑制作用 oxLDL 在1～10 μg/ml时D(450)值与未加oxLDL时有明显差异(P<0.01),并随oxLDL浓度呈剂量依赖性增加(资料未显示)。以5 μg/ml 作为oxLDL对于U937促增殖作用剂量。预先加入2.5～25 μg/ml SL，再加入5 μg/ml oxLDL时的 D(450)值较未加SL时有明显差异(P<0.01，表1)。表明： SL呈剂量依赖性抑制oxLDL引起的U937细胞增殖。
3 讨论
LDL被氧化修饰是引起AS的一个主要原因。当LDL颗粒进入动脉壁以后，能进一步氧化并被细胞表面的清道夫受体识别而发生内吞，单核细胞内吞oxLDL后形成单核细胞源性泡沫细胞。oxLDL对单核-M
有毒性，并造成炎症反应的进一步扩大和晚期动脉粥样硬化性斑块中坏死中心的形成[3]。单核-M增殖是AS进一步发展的另一原因。近年来，随着AS发病机制研究的进一步深入，人们进一步认识到AS是受多种因素的影响而形成的一类病理变化复杂的疾病，从而在多方面发展抗AS药物，如调血脂药、抗血小板药、抗高血压药、抗氧化剂等，其中重要的一项是研究药物能否拮抗oxLDL的作用[4]。SL临床上用于有头痛晕厥、急躁易怒、心悸失眠等属于肝阳上亢症状的高血压患者；在高血压和高血脂的动物模型上有降低血压和调血脂作用。, http://www.100md.com
U937细胞现已被广泛用作单核细胞的研究模型[5]。我们发现在培养的U937细胞模型中，低浓度(1～10 μg/ml) oxLDL对细胞有促增殖作用，高浓度(25～200 μg/ml)oxLDL对细胞产生明显的细胞毒作用。本研究结果初步表明，SL可抑制低浓度oxLDL对U937细胞的促增殖作用，并能拮抗高浓度oxLDL对U937细胞的损伤作用，提示SL在防治AS中具有潜在的作用。至于SL具体作用机制是由于其对oxLDL的中和破坏作用，还是由于在细胞水平上阻断了oxLDL对单核细胞的破坏作用，值得进一步研究。
*国家自然科学基金资助项目，批准号39600063
作者简介：雷著斌，男，1965年9月生，硕士，主治医师
参考文献
1 Sternberg D. Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance[J]. J Biol Chem,1997，272(34):20963
, 百拇医药
2 王淳本，宗义强，吴万生， 等. 两步超速离心法快速分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白[J]. 同济医科大学学报，1995，24(3): 169
3 Goldstein JL, Basu SK, Brown MS. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein in cultured cells[J]. Methods Enzymol,1984,98(3):241
4 Walters-Laporte E, Furman C, Fouquet S, et al. A high concentration of melatonin inhibits in vitro LDL peroxidation but not oxidized LDL toxicity towards cultured endothelial cells[J]. J Cardiovasc Pharmacol,1998,32(4):582
5 Oberg F,Botting J, Nilsson K. Macrophages and the cytokine network[J]. Transplant Proc, 1993,25(2):2044
(1999-05-11收稿，1999-11-09修回), 百拇医药