人直肠癌细胞HR-8348导入p16基因对细胞周期的影响及其意义
作者：王青 吴金生 赖大年 马庆久 要秀 潘伯荣
单位：中国人民解放军第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
关键词：直肠肿瘤；p16基因；细胞周期
世界华人消化杂志991229
中国图书馆分类号 R735.37
Subject headings rectal neoplasms; p16 gene; cyclin cycle; HR-8348 cell line
目前发现，在各类肿瘤中多肿瘤抑制基因(MTS1)变异率最高(75%)，其相对分子量最小，是唯一直接抑制肿瘤细胞增殖周期的细胞固有蛋白，利于导入，重组和标记，在肿瘤基因治疗中具有广阔的前景.我们用脂质体包裹法通过构建的MTS1真核表达载体pcDNA3将p16基因导入人直肠腺癌细胞系HR-8348中，用流式细胞仪进行检测，分析转染后HR-8348细胞周期变化及意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人直肠腺癌细胞系HR-8348由中国医学科学院肿瘤研究所提供.pUC19-P16质粒和pcDNA3真核表达载体由第四军医大学生化教研室提供.Plasmid Purification Kit购自上海华顺公司，PCR Purification Kit购自Clontech公司.BamHⅠ，EcoRⅠ，T4DNA Ligase，XbaⅠ，HindⅢ,DNA及其他常用试剂购自Promega公司和华美公司.脂染素(lipofectin)购自北京东方公司.
1.2 方法
1.2.1 MTS1真核表达载体的构建和鉴定 将pUC19-P16质粒切下的片段回收，用连接酶将其和pcDNA3真核表达载体酶切回收的片段连接.将构建的MTS1真核表达载体命名为pcDNA16，并经EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切进行初步鉴定.再将阳性克隆重新提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切进行进一步鉴定.
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1.2.2 HR-8348细胞的转染及细胞周期检测 人直肠腺癌细胞系HR-8348常规复苏培养传代，制成1×108/L细胞悬液接种于25mL培养瓶，待细胞铺满瓶底70%时，更换新鲜培养液培养4h，无血清培养基洗涤，无菌条件下，按脂染素说明书操作加入pcDNA16 8μg和脂染素20μL，加入无血清培养液混匀后加入待转染细胞，常规培养24h后再加入胎牛血清继续培养48h.同时转染空载体pcDNA3作为对照，将HR-8348，HR-8348-pcDNA3，HR-8348-pcDNA16细胞无血清培养液洗涤后，胰酶消化，制成单细胞悬液.用Profile Ⅱ型流式细胞仪检测.
2 结果
2.1 载体构建及鉴定 将pUC19-p16及pcDNA3酶切片段连接转化后经EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切可收到450 bp者即为阳性克隆，再提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切均可收到450bp片段，表明构建正确.将构建的真核表达载体命名为pcDNA16.
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2.2 HR-8348细胞转染p16基因后细胞周期变化 HR-8348细胞及转染空载体的HR-8348-pcDNA3细胞的S期指数分别是37.7，28.9，增殖指数分别是0.61，0.57；转染pcDNA16细胞的S期指数是10.0(P<0.01)，增殖指数是0.41.
3 讨论
细胞周期负调控与抑癌基因密切相关，P16蛋白作为CDK的抑制物，当同细胞周期素D竞争与CDK4结合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞分裂生长[1-3].进一步的研究表明，P16INK4编码的蛋白是CDK4的抑制因子，直接调控细胞增殖周期[4].在间皮瘤细胞(M9K)等3株细胞系中，转染表达P16INK4 cDNA的载体后，其克隆形成效率受到抑制[5].Poulos et al[6]以p16基因转染人成胶质细胞瘤细胞系，有77.5%发生了G→S期阻滞.国内也有作者将p16基因导入膀胱癌细胞和胃癌细胞.使表达外源性P16的裸鼠致瘤作用明显受到抑制[7，8]，我们曾使用袁建林et al[9]构建的MTS1逆转录病毒表达载体转染人直肠癌细胞和胆管癌细胞.在实验中发现该载体转染效率较低，转染细胞阳性克隆的筛选及传代均较困难，为此，我们构建了MTS1真核表达载体pcDNA16，同样，该载体转染细胞阳性克隆的筛选及传代仍较困难.目前，构建逆转肿瘤细胞异质性载体的方法包括构建逆转录病毒表达载体，真核表达载体及腺病毒表达载体等.对于结直肠癌，由于p16基因5＇CpG岛从头甲基化可能是基因失活的主要或唯一方式[10，11]，如果转染中联合应用脱甲基剂，转染效率，阳性克隆筛选及传代可能会得到提高.因此转染效率的提高，阳性克隆筛选的成功及传代的稳定可能不仅仅取决于载体种类的差异.此外，可能更主要的是p16作为抑癌基因，是目前为止唯一直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分，在导入肿瘤细胞后，对肿瘤细胞具有直接抑制作用，故难以筛选和传代.但在急性实验中，转染后的HR-8348细胞周期中S期指数及增殖指数明显降低，肿瘤细胞的DNA合成及恶性增殖受到抑制，表明导入外源性p16基因后，可抑制直肠癌细胞的分裂增殖，为开展消化道肿瘤的基因治疗提供了重要依据.
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通讯作者 王青
参考文献
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver Feldhaus J，Liu Q，Harshman K，Tavtigian SV，Stockert E，Day RS 3rd，Johnson BE，Skolnick MH.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994;264:436-440
2 Nobori T，Miura K，Wu DJ，Lois A，Takabayashi K，Carson DA.Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature，1994;368:753-756
, 百拇医药
3 Marx J.A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor.Science，1994;264:1846
4 Spillare EA，Okamoto A，Hagiwara K，Demetrick DJ，Serrano M，Beach D，Harris CC.Suppression of growth in vitro and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4.Mol-Carcinog，1996;16:53-60
5 Lois AF，Rosenbach M，Miura K，Michimata H，Carson DA，Nobori T.Structural functional analysis of the P16 tumor suppressor.Cancer Res，1995;36(Suppl):575
, 百拇医药
6 Poulos NE，Farmer AA，Chan KW，Stanbridge EJ.Design of a novel bicistronic expression vector with demonstration of a p16INK4-induced G(1)-S block(1).Cancer Res，1996;56:1719-1723
7 Yuan JL，Hui HX，Wang JB，Yu MS，Chai YB，Shao GX，Wang ZK，Wang CJ，Xin JG.Inhibitory effects of wild-type MTS1 on human bladder cancer line.Zhonghua Miniao Waike Zazhi，1997;9:545-548
8 Li WM，Lu YY.Introduction of Rb，p53，p16 and H-ras antisense RNA suppresses tumorigenicity in human gastric cancer lines.Zhongguo Zhongliu Shengwu Zhiliao Zazhi，1997;4:90-94
, 百拇医药
9 Yuan JL，Chai YB，Yu MS，Hui HX.Construction and identification of retroviral expression vector of MTS1.Zhonghua Miniao Zazhi，1996;17:395
10 Gonzalez Zulueta M，Bender CM，Yang AS，Nguyen T，Beart RW，Van Tornout JM，Jones PA.Methylation of the 5＇CpG island of the P16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995;55:4531-4535
11 Ahuja N，Mohan AL，Li Q，Stolker JM，Herman JG，Hamilton SR，Baylin SB，Issa JP.Association between CpG island methylation and microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res，1997;57:3370-3374
收稿日期 1999-11-08, http://www.100md.com
单位：中国人民解放军第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
关键词：直肠肿瘤；p16基因；细胞周期
世界华人消化杂志991229
中国图书馆分类号 R735.37
Subject headings rectal neoplasms; p16 gene; cyclin cycle; HR-8348 cell line
目前发现，在各类肿瘤中多肿瘤抑制基因(MTS1)变异率最高(75%)，其相对分子量最小，是唯一直接抑制肿瘤细胞增殖周期的细胞固有蛋白，利于导入，重组和标记，在肿瘤基因治疗中具有广阔的前景.我们用脂质体包裹法通过构建的MTS1真核表达载体pcDNA3将p16基因导入人直肠腺癌细胞系HR-8348中，用流式细胞仪进行检测，分析转染后HR-8348细胞周期变化及意义.
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1 材料和方法
1.1 材料 人直肠腺癌细胞系HR-8348由中国医学科学院肿瘤研究所提供.pUC19-P16质粒和pcDNA3真核表达载体由第四军医大学生化教研室提供.Plasmid Purification Kit购自上海华顺公司，PCR Purification Kit购自Clontech公司.BamHⅠ，EcoRⅠ，T4DNA Ligase，XbaⅠ，HindⅢ,DNA及其他常用试剂购自Promega公司和华美公司.脂染素(lipofectin)购自北京东方公司.
1.2 方法
1.2.1 MTS1真核表达载体的构建和鉴定 将pUC19-P16质粒切下的片段回收，用连接酶将其和pcDNA3真核表达载体酶切回收的片段连接.将构建的MTS1真核表达载体命名为pcDNA16，并经EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切进行初步鉴定.再将阳性克隆重新提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切进行进一步鉴定.
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1.2.2 HR-8348细胞的转染及细胞周期检测 人直肠腺癌细胞系HR-8348常规复苏培养传代，制成1×108/L细胞悬液接种于25mL培养瓶，待细胞铺满瓶底70%时，更换新鲜培养液培养4h，无血清培养基洗涤，无菌条件下，按脂染素说明书操作加入pcDNA16 8μg和脂染素20μL，加入无血清培养液混匀后加入待转染细胞，常规培养24h后再加入胎牛血清继续培养48h.同时转染空载体pcDNA3作为对照，将HR-8348，HR-8348-pcDNA3，HR-8348-pcDNA16细胞无血清培养液洗涤后，胰酶消化，制成单细胞悬液.用Profile Ⅱ型流式细胞仪检测.
2 结果
2.1 载体构建及鉴定 将pUC19-p16及pcDNA3酶切片段连接转化后经EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切可收到450 bp者即为阳性克隆，再提取质粒，以XbaⅠ和BamHⅠ，EcoRⅠ和HindⅢ分别双酶切均可收到450bp片段，表明构建正确.将构建的真核表达载体命名为pcDNA16.
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2.2 HR-8348细胞转染p16基因后细胞周期变化 HR-8348细胞及转染空载体的HR-8348-pcDNA3细胞的S期指数分别是37.7，28.9，增殖指数分别是0.61，0.57；转染pcDNA16细胞的S期指数是10.0(P<0.01)，增殖指数是0.41.
3 讨论
细胞周期负调控与抑癌基因密切相关，P16蛋白作为CDK的抑制物，当同细胞周期素D竞争与CDK4结合后，抑制其活性，使CDK4不能催化Rb蛋白磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞分裂生长[1-3].进一步的研究表明，P16INK4编码的蛋白是CDK4的抑制因子，直接调控细胞增殖周期[4].在间皮瘤细胞(M9K)等3株细胞系中，转染表达P16INK4 cDNA的载体后，其克隆形成效率受到抑制[5].Poulos et al[6]以p16基因转染人成胶质细胞瘤细胞系，有77.5%发生了G→S期阻滞.国内也有作者将p16基因导入膀胱癌细胞和胃癌细胞.使表达外源性P16的裸鼠致瘤作用明显受到抑制[7，8]，我们曾使用袁建林et al[9]构建的MTS1逆转录病毒表达载体转染人直肠癌细胞和胆管癌细胞.在实验中发现该载体转染效率较低，转染细胞阳性克隆的筛选及传代均较困难，为此，我们构建了MTS1真核表达载体pcDNA16，同样，该载体转染细胞阳性克隆的筛选及传代仍较困难.目前，构建逆转肿瘤细胞异质性载体的方法包括构建逆转录病毒表达载体，真核表达载体及腺病毒表达载体等.对于结直肠癌，由于p16基因5＇CpG岛从头甲基化可能是基因失活的主要或唯一方式[10，11]，如果转染中联合应用脱甲基剂，转染效率，阳性克隆筛选及传代可能会得到提高.因此转染效率的提高，阳性克隆筛选的成功及传代的稳定可能不仅仅取决于载体种类的差异.此外，可能更主要的是p16作为抑癌基因，是目前为止唯一直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分，在导入肿瘤细胞后，对肿瘤细胞具有直接抑制作用，故难以筛选和传代.但在急性实验中，转染后的HR-8348细胞周期中S期指数及增殖指数明显降低，肿瘤细胞的DNA合成及恶性增殖受到抑制，表明导入外源性p16基因后，可抑制直肠癌细胞的分裂增殖，为开展消化道肿瘤的基因治疗提供了重要依据.
, http://www.100md.com
通讯作者 王青
参考文献
1 Kamb A，Gruis NA，Weaver Feldhaus J，Liu Q，Harshman K，Tavtigian SV，Stockert E，Day RS 3rd，Johnson BE，Skolnick MH.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science，1994;264:436-440
2 Nobori T，Miura K，Wu DJ，Lois A，Takabayashi K，Carson DA.Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers.Nature，1994;368:753-756
, 百拇医药
3 Marx J.A challenge to p16 gene as a major tumor suppressor.Science，1994;264:1846
4 Spillare EA，Okamoto A，Hagiwara K，Demetrick DJ，Serrano M，Beach D，Harris CC.Suppression of growth in vitro and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected P16INK4.Mol-Carcinog，1996;16:53-60
5 Lois AF，Rosenbach M，Miura K，Michimata H，Carson DA，Nobori T.Structural functional analysis of the P16 tumor suppressor.Cancer Res，1995;36(Suppl):575
, 百拇医药
6 Poulos NE，Farmer AA，Chan KW，Stanbridge EJ.Design of a novel bicistronic expression vector with demonstration of a p16INK4-induced G(1)-S block(1).Cancer Res，1996;56:1719-1723
7 Yuan JL，Hui HX，Wang JB，Yu MS，Chai YB，Shao GX，Wang ZK，Wang CJ，Xin JG.Inhibitory effects of wild-type MTS1 on human bladder cancer line.Zhonghua Miniao Waike Zazhi，1997;9:545-548
8 Li WM，Lu YY.Introduction of Rb，p53，p16 and H-ras antisense RNA suppresses tumorigenicity in human gastric cancer lines.Zhongguo Zhongliu Shengwu Zhiliao Zazhi，1997;4:90-94
, 百拇医药
9 Yuan JL，Chai YB，Yu MS，Hui HX.Construction and identification of retroviral expression vector of MTS1.Zhonghua Miniao Zazhi，1996;17:395
10 Gonzalez Zulueta M，Bender CM，Yang AS，Nguyen T，Beart RW，Van Tornout JM，Jones PA.Methylation of the 5＇CpG island of the P16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995;55:4531-4535
11 Ahuja N，Mohan AL，Li Q，Stolker JM，Herman JG，Hamilton SR，Baylin SB，Issa JP.Association between CpG island methylation and microsatellite instability in colorectal cancer.Cancer Res，1997;57:3370-3374
收稿日期 1999-11-08, http://www.100md.com