P物质对大鼠脾细胞免疫功能的影响
作者：李成仁 蔡文琴 邓晓林 肖茂磊 杨忠 何家全 肖光夏
单位：李成仁 蔡文琴 邓晓林 肖茂磊 杨忠 何家全：第三军医大学：1基础医学部组织学与胚胎学教研室；肖光夏：附属西南医院烧伤研究所；重庆 400038
关键词：P物质；脾细胞；白介素-2；白介素-6；肿瘤坏死因子
第三军医大学学报991209
提要 目的：研究P物质(SP)对脾细胞免疫功能的调节作用。方法：采用3H-TdR掺入法、放射免疫测定和流式细胞仪等方法，检测了SP对体外培养的大鼠脾细胞的增殖和分泌IL-2、IL-6、TNF功能及T细胞表型表达的影响。结果：SP能明显刺激脾细胞的增殖，其中浓度为1×10-4mmol/L时作用最强；SP能促进T细胞CD分子的表达，使CD4+/CD8+升高；SP能显著促进脾细胞分泌IL-2，对脾细胞分泌IL-6具有抑制作用，而对分泌TNF无作用。结论：证实了SP是具有广泛的免疫调节作用的一种神经肽。
, 百拇医药
中图法分类号 R392.1 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0896-03
Effects of substance P on immune function
of splenic cells in rats
LI Cheng-ren, CAI Wen-qin, DENG Xiao-lin, XIAO Mao-lei, YANG Zhong, HE Jia-quan, XIAO Guang-xia
(Department of Histology and Embryology, Faculty of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract Objective: To explore the effects of substance P (SP) on immune function of splenic cells. Methods: After the splenic cells from rats were cultured in vitro, their proliferative activity was determined with incorporation of 3H-TdR, production of cytokines detected by RIA and phenotype of T lymphocytes investigated with FCM. Results: ① SP augmented the proliferation of splenic cells to a peak of 1×10-4 mmol/L. ② SP promoted the expression of phenotype of T lymphocytes to result in the increase in number of CD+3 and CD+4 T lymphocytes. ③ SP significantly promoted the secretion of IL-2 but decreased that of IL-6 and did not affect that of TNF from the splenic cells. Conclusion: SP is a kind of neuropeptide with high capacity of immunity regulation.
, 百拇医药
Key words substance P; splenic cell; interleukin; tumor necrosis factor; rat
P物质(Substance P,SP)是神经内分泌系统反应时分泌的一种生物活性多肽。文献[1]报道SP除了能作为神经递质传递信息之外，还具有广泛的免疫调节作用，能促进T细胞、B细胞等的增生，促进它们DNA的合成，增强淋巴细胞合成和分泌细胞因子与抗体[2，3]。已有的实验表明，在创伤、烧伤等伤害性刺激作用下，机体的神经内分泌系统产生明显的变化[4，5]。研究这种变化对机体免疫防御功能的影响，对研究创伤的发病机制及防治将具有重要意义。本研究观察了不同浓度的SP对体外培养的大鼠脾细胞的增殖和分泌功能及T细胞CD分子表达的影响，以期更深入了解SP对免疫的调节功能。
1 材料与方法
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1.1 动物
成年Wistar大鼠5只，体重180～220 g,由本校动物研究所提供。
1.2 试剂
SP(美国Sigma公司)；IL-2(本校免疫教研室)；RPMI 1640(Gibcobrl公司)；胎牛血清(美国Sigma公司)；3H-TdR(中科院上海原子能研究所)；anti-CD4-IgG-PE和anti-CD8-IgG-PE(美国Pharllingen公司)；125I标记的IL-6、TNF放射免疫试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)。
1.3 脾细胞的制备
大鼠麻醉，无菌操作取出脾脏，浸于D-Hank's液中，经200目钢网研磨，将细胞悬液吸入离心管，静置10 min，弃去沉淀的组织团块，用D-Hank's液洗3遍，再用培养液将细胞浓度调整为1×106/ml，于37°C、5%CO2培养箱中培养。培养液为加10%胎牛血清的RPMI 1640(后均同)。
, 百拇医药
1.4 SP对脾细胞增殖的影响
96孔培养板每孔加入大鼠脾细胞悬液0.1 ml及SP 0.1 ml。SP终浓度为：0、1×10-9、1×10-7、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2 mmol/L，每种浓度设平行孔3孔。培养48 h，每孔加入3H-TdR 1 μCi,再继续培养24 h后用自动多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用β-闪烁计数仪测量cpm值。
1.5 SP对脾细胞分泌IL-2功能的影响
1.5.1 IL-2的收集
24孔培养板中每孔加入大鼠脾细胞悬液0.5 ml及SP 0.5 ml，SP终浓度为0、1×10-9、1×10-7、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2 mmol/L，每种浓度设平行孔3孔。培养48 h后，离心，收集的上清即为IL-2粗制品，-20°C冻存待测。
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1.5.2 IL-2活性测定(3H-TdR掺入法)
采用生长旺盛的CTLL细胞株(IL-2依赖细胞株)(由本校免疫教研室邹强博士惠赠)，用RPMI 1640培养液洗涤3遍，配成1×106/ml细胞悬液，96孔培养板每孔加CTLL细胞悬液0.1 ml。将IL-2的标准品稀释成1×104、1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5 U/ml等10种浓度，与备测样品分别加入培养的CTLL细胞中，每孔0.1 ml，每一浓度设3平行孔。培养48 h，每孔再加入3H-TdR 1 μCi，继续培养24 h，用自动多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用β-闪烁计数仪测量cpm值。
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1.6 SP对脾细胞分泌IL-6、TNF功能的影响
24孔培养板中每孔加入大鼠脾细胞悬液0.5 ml及SP 0.5 ml，SP终浓度为0、1×10-9、1×10-7、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2 mmol/L，每种浓度设3平行孔。培养48 h，离心收集上清，进行IL-6、TNF放射免疫测定。
1.7 SP对脾细胞中T细胞表型表达的影响
取终浓度为1×10-2mmol/L SP进行以下实验，24孔培养板中每孔加入大鼠脾细胞悬液0.5 ml，实验组再加入SP 0.5 ml，对照组加入培养液0.5 ml，每组设平行孔6孔(CD4、CD8各3孔)。培养48 h后，离心收集细胞，4%多聚甲醛固定15 min，荧光素标记的CD4、CD8单抗37°C过夜，在荧光显微镜下观察有荧光细胞，上FACStarPLUS型流式细胞仪检测1×104个细胞。
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1.8 数据处理
各组数据采用Gwbasic统计程序中单因素方差分析程序PDA-2处理。
2 结果
2.1 SP对脾细胞增殖及分泌IL-2、IL-6、TNF功能的影响
不同SP浓度组的cpm较对照组有明显的提高(P<0.01)，见表1。其中1×10-4mmol/L SP组的cpm达到最高。各组之间在低浓度时cpm有显著性差异(P<0.05)，但浓度达1×10-4mmol/L后，浓度再增高相差也不显著(P>0.05)。以上结果表明SP能明显促进脾细胞的增生。
表1 SP对大鼠脾细胞增殖、分泌IL-2、IL-6
和TNF的影响(n=3)
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Tab 1 Effect of SP on proliferation, secretion of
IL-2,IL-6 and TNF of rat spleen cells(n=3) Group
cpm(min-1)
IL-2(U/ml)
IL-6(pg/ml)
TNF(min-1)
Control
5217±124
4.3±0.98
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0.46±0.01
4833±307
10-9mmol/L
7567±41**
7.4±0.99**
0.45±0.01
4803±12
10-7mmol/L
7792±48**
9.9±0.94**
, 百拇医药
0.33±0.02**
5565±223*
10-5mmol/L
8278±36**
18.7±1.1**
0.32±0.02**
5284±20
10-4mmol/L
8716±41**
22.4±1.8**
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0.42±0.02*
4729±204
10-3mmol/L
8507±75**
38.1±1.4**
0.39±0.08**
4200±335*
10-2mmol/L
8594±30**
33.4±1.3**
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0.30±0.01**
4967±676
*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
加入不同浓度SP的脾细胞条件培养上清液对CTLL细胞增殖的作用较对照组有了显著的提高，也即不同浓度的SP对脾细胞分泌IL-2有明显的促进作用(P<0.01)，见表1，各组之间也存在显著性差异(P<0.05)，其中1×10-3mmol/L SP促进脾细胞分泌IL-2的作用达到顶峰，而1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L两组之间无统计学意义。
脾细胞培养上清液用IL-6放射免疫试剂盒测试后的结果，见表1。一定浓度的SP对脾细胞分泌IL-6有明显抑制作用(P<0.01)，在SP浓度达到1×10-2mmol/L时，抑制作用最高；而在SP浓度低时，1×10-9mmol/L对脾细胞分泌IL-6无明显的抑制作用(P>0.05)。
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用TNF放射免疫试剂盒测试的结果，见表1。脾细胞分泌TNF很低，低于放射免疫试剂盒标准曲线的最低值，无法计算TNF的具体含量，用所测得的cpm来表示。显示SP对脾细胞分泌TNF的功能无明显影响(P>0.05)。
2.2 SP对T细胞表型表达的影响
流式细胞仪的测定结果，见表2。1×10-5mmol/L SP对脾细胞中T细胞亚群表型的表达有促进作用，其中对CD4+T细胞的促进作用最明显(P<0.01)，对CD+3(CD+4和CD+8T细胞的总和)T细胞也有促进作用(P<0.05)，而对CD+8T细胞的作用不明显，无统计学意义(P>0.05)，因此CD+4/CD+8比值升高(P<0.01)。
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表2 SP对大鼠脾细胞中T细胞亚群表型表达的影响(n=3)
Tab 2 Effects of SP on phenotype of T lymphocyte
of rat spleen cells(n=3) Group
CD+4
CD+8
CD+3(CD+4+CD+8)
CD+4/CD+8
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Control
709±16
775±19
1 484±35
0.9149±0.0018
SP(1×10-2mmol/L)
821±19**
753±17
1 574±36*
1.0898±0.0043**
*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
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3 讨论
SP是体内最常见的神经肽，也是第一个被发现的脑肠肽。它在体内广泛存在，几乎遍布全身，其中在胃肠道内含量最为丰富。SP除了可作为神经递质传递信息之外，还具有广泛的生物学活性。近年来SP对免疫功能的调节作用越来越受到人们的关注，已有实验证明在多种免疫细胞上均有SP的特异性受体[1，6，7]，SP对免疫功能的多个方面均有促进作用。
我们用3H-TdR掺入法观察了SP对体外培养大鼠脾细胞增殖作用的调节，结果发现SP对脾细胞的增殖作用有明显的促进作用，这与多位研究工作者的文献报道SP对淋巴细胞的增殖有促进作用的结果相一致[2，3，8，9]。
对于脾细胞分泌功能，我们选用了检测IL-2、IL-6和TNF。IL-2具有极为重要的免疫调节功能，因此研究SP对IL-2产生的调节作用，有助于更深入了解它对免疫调节的机制。对IL-2活性的生物学检测，本实验采用3H-TdR掺入法来检测CTLL细胞的增殖情况，同时设标准品组，结果显示SP对脾细胞分泌IL-2有明显的促进作用，并且与SP的浓度存在明显的量效关系，但达到一定浓度(本实验是1×10-3mmol/L)后，浓度再高，对脾细胞的促进作用不再加强。我们实验的结果与Calvo[10]的报道SP增强Jurkat T细胞的IL-2 mRNA信号，促进活化T细胞的IL-2的分泌的相一致。
, 百拇医药
IL-6和TNF也是近年来免疫学研究的热点，IL-6是一种生物学活性极为广泛的细胞因子，TNF也是一种多功能细胞因子。SP对淋巴细胞分泌IL-6和TNF的作用，文献报道不多。我们用放免法测定加入SP的脾细胞培养上清液，结果发现加入SP的上清液中IL-6含量明显低于对照组，而TNF却无明显变化，即SP具有显著抑制脾细胞分泌IL-6的作用，而对分泌TNF无作用。
近年来研究指出，T细胞表面的CD3、CD4以及CD8分子都是T细胞识别抗原、传递活化信号以及发挥杀伤靶细胞效应时所不可缺少的分子[11]。本实验用流式细胞仪检测的结果证实SP在一定剂量范围内可促进这些CD分子的表达，脾细胞内T细胞表达CD+3(T细胞总数)和CD+4(辅助/诱导T细胞)T淋巴细胞明显增加，而对CD+8(抑制/杀伤T细胞)T细胞的表达无影响，CD+4与CD+8细胞的比值升高。这与SP促进脾细胞增殖和分泌IL-2的结果相符，SP促进脾细胞中的T细胞(CD+3)增殖，主要是促进CD+4T细胞增生，该细胞亚型T细胞分泌IL-2。这些提示SP对免疫应答的促进作用有部分机制可能是通过促进这些分子的表达，从而增强T细胞对抗原识别及信号传递的能力。
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SP在全身分布广泛，尤其在胃肠道内分布最为丰富，它可能在胃肠道的舒缩、肠壁血液供应及肠道免疫功能等方面起重要的调节作用。在病理情况下，尤其在一些强应激状态中，胃肠道内的SP含量发生明显的变化。蔡文琴等[5]对枪弹伤及20 Gy-γ射线照射后胃肠道SP的变化进行了研究，结果显示在强应激状态下胃肠道的SP变化不仅存在，而且呈现有明显的反应性。我们对烧伤后大鼠肠道的SP含量也进行的测定，发现伤后SP明显升高(具体资料正在整理中)。在这些情况下，SP的变化对肠道粘膜免疫屏障以及肠道免疫功能的相关性，可能会影响烧伤和创伤后肠源性感染的发生及病程发展。
基金项目：军队“九五”攻关课题项目(96L042)
Foundation item: "Ninth five" obligatory budget of PLA(96L042)
作者简介：李成仁，男，1970.08.10生，浙江省东阳市人，硕士，助教，主要从事神经生物学方面的研究，发表论文4篇。电话：(023)68752229
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参考文献
[1] Goetzl E J, Xia M, Ingram A M, et al. Neuropeptide signaling of lymphocyte in immunological responses[J]. Int Arch Allergy Immunol,1995,107(1-3):202-204.
[2] Kavelaars A, Jeurissen F, Heijnen C J. Substance P receptors and signal transduction in leukocyte[J].J Immunol Method,1994,5(1):41-48.
[3] Stanisz A M, Befus D, Bienenstock J. Differential effects of vasoactive intestinal peptide, substance P, and somatostatin on immunoglobulin synthesis and proliferations by lymphocytes from Peyer's patches, mesenteric lymph nodes, and spleen[J]. J Immunol,1986,136(1):152-156.
, http://www.100md.com
[4] Hu D, Chen B, Lin S, et al. Changes in substance P in the jejuna of rats after burns[J]. Burns,1996,22(6):463-467.
[5] 蔡文琴，王正品.大鼠肠型放射病时VIP、SP、L-EN及SOM的变化-放射免疫测定、免疫组化和电镜观察[J].解剖学报，1989，20(Suppl):60-63.
[6] Bost K L, Breeding S A, Pascual D W. Modulation of the mRNAs encoding substance P and its receptor in rat macrophages by LPS[J]. Reg Immunol,1992,4(2):105-112.
[7] Payan D G, Brewster D R, Goetzl E J. Stereospecific receptors for substance P on cultured human IM-9 lymphoblasts[J].J Immunol,1984,133(6):3260-3265.
, 百拇医药
[8] Payan D G, Brewster D R, Goetzl E J. Specific stimulation of human T lymphocytes by substance P[J]. J Immunol,1985,135(Suppl 2):802-807.
[9] Luber-Narod J, Kage R, Leeman S E. Substance P enhances the secretion of tumor necrosis factor-alpha from neuroglial cells stimulated with lipopolysaccharide[J]. J Immunol,1994,152(2):819-824.
[10] Calvo C F. Substance P stabilizes interleukin-2 mRNA in activated Jurkat T cells[J]. J Neuroimmunol,1994,51(1):85-91.
[11] Abbas A K, Lichtman A H, Pober J S. Cellular and Molecular Immunology[M]. USA: W B Saunders Company,1994.128-130.
收稿日期：1998-11-10；修回日期：1999-08-11, 百拇医药
单位：李成仁 蔡文琴 邓晓林 肖茂磊 杨忠 何家全：第三军医大学：1基础医学部组织学与胚胎学教研室；肖光夏：附属西南医院烧伤研究所；重庆 400038
关键词：P物质；脾细胞；白介素-2；白介素-6；肿瘤坏死因子
第三军医大学学报991209
提要 目的：研究P物质(SP)对脾细胞免疫功能的调节作用。方法：采用3H-TdR掺入法、放射免疫测定和流式细胞仪等方法，检测了SP对体外培养的大鼠脾细胞的增殖和分泌IL-2、IL-6、TNF功能及T细胞表型表达的影响。结果：SP能明显刺激脾细胞的增殖，其中浓度为1×10-4mmol/L时作用最强；SP能促进T细胞CD分子的表达，使CD4+/CD8+升高；SP能显著促进脾细胞分泌IL-2，对脾细胞分泌IL-6具有抑制作用，而对分泌TNF无作用。结论：证实了SP是具有广泛的免疫调节作用的一种神经肽。
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中图法分类号 R392.1 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(1999)12-0896-03
Effects of substance P on immune function
of splenic cells in rats
LI Cheng-ren, CAI Wen-qin, DENG Xiao-lin, XIAO Mao-lei, YANG Zhong, HE Jia-quan, XIAO Guang-xia
(Department of Histology and Embryology, Faculty of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract Objective: To explore the effects of substance P (SP) on immune function of splenic cells. Methods: After the splenic cells from rats were cultured in vitro, their proliferative activity was determined with incorporation of 3H-TdR, production of cytokines detected by RIA and phenotype of T lymphocytes investigated with FCM. Results: ① SP augmented the proliferation of splenic cells to a peak of 1×10-4 mmol/L. ② SP promoted the expression of phenotype of T lymphocytes to result in the increase in number of CD+3 and CD+4 T lymphocytes. ③ SP significantly promoted the secretion of IL-2 but decreased that of IL-6 and did not affect that of TNF from the splenic cells. Conclusion: SP is a kind of neuropeptide with high capacity of immunity regulation.
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Key words substance P; splenic cell; interleukin; tumor necrosis factor; rat
P物质(Substance P,SP)是神经内分泌系统反应时分泌的一种生物活性多肽。文献[1]报道SP除了能作为神经递质传递信息之外，还具有广泛的免疫调节作用，能促进T细胞、B细胞等的增生，促进它们DNA的合成，增强淋巴细胞合成和分泌细胞因子与抗体[2，3]。已有的实验表明，在创伤、烧伤等伤害性刺激作用下，机体的神经内分泌系统产生明显的变化[4，5]。研究这种变化对机体免疫防御功能的影响，对研究创伤的发病机制及防治将具有重要意义。本研究观察了不同浓度的SP对体外培养的大鼠脾细胞的增殖和分泌功能及T细胞CD分子表达的影响，以期更深入了解SP对免疫的调节功能。
1 材料与方法
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1.1 动物
成年Wistar大鼠5只，体重180～220 g,由本校动物研究所提供。
1.2 试剂
SP(美国Sigma公司)；IL-2(本校免疫教研室)；RPMI 1640(Gibcobrl公司)；胎牛血清(美国Sigma公司)；3H-TdR(中科院上海原子能研究所)；anti-CD4-IgG-PE和anti-CD8-IgG-PE(美国Pharllingen公司)；125I标记的IL-6、TNF放射免疫试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)。
1.3 脾细胞的制备
大鼠麻醉，无菌操作取出脾脏，浸于D-Hank's液中，经200目钢网研磨，将细胞悬液吸入离心管，静置10 min，弃去沉淀的组织团块，用D-Hank's液洗3遍，再用培养液将细胞浓度调整为1×106/ml，于37°C、5%CO2培养箱中培养。培养液为加10%胎牛血清的RPMI 1640(后均同)。
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1.4 SP对脾细胞增殖的影响
96孔培养板每孔加入大鼠脾细胞悬液0.1 ml及SP 0.1 ml。SP终浓度为：0、1×10-9、1×10-7、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2 mmol/L，每种浓度设平行孔3孔。培养48 h，每孔加入3H-TdR 1 μCi,再继续培养24 h后用自动多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用β-闪烁计数仪测量cpm值。
1.5 SP对脾细胞分泌IL-2功能的影响
1.5.1 IL-2的收集
24孔培养板中每孔加入大鼠脾细胞悬液0.5 ml及SP 0.5 ml，SP终浓度为0、1×10-9、1×10-7、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2 mmol/L，每种浓度设平行孔3孔。培养48 h后，离心，收集的上清即为IL-2粗制品，-20°C冻存待测。
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1.5.2 IL-2活性测定(3H-TdR掺入法)
采用生长旺盛的CTLL细胞株(IL-2依赖细胞株)(由本校免疫教研室邹强博士惠赠)，用RPMI 1640培养液洗涤3遍，配成1×106/ml细胞悬液，96孔培养板每孔加CTLL细胞悬液0.1 ml。将IL-2的标准品稀释成1×104、1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5 U/ml等10种浓度，与备测样品分别加入培养的CTLL细胞中，每孔0.1 ml，每一浓度设3平行孔。培养48 h，每孔再加入3H-TdR 1 μCi，继续培养24 h，用自动多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用β-闪烁计数仪测量cpm值。
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1.6 SP对脾细胞分泌IL-6、TNF功能的影响
24孔培养板中每孔加入大鼠脾细胞悬液0.5 ml及SP 0.5 ml，SP终浓度为0、1×10-9、1×10-7、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2 mmol/L，每种浓度设3平行孔。培养48 h，离心收集上清，进行IL-6、TNF放射免疫测定。
1.7 SP对脾细胞中T细胞表型表达的影响
取终浓度为1×10-2mmol/L SP进行以下实验，24孔培养板中每孔加入大鼠脾细胞悬液0.5 ml，实验组再加入SP 0.5 ml，对照组加入培养液0.5 ml，每组设平行孔6孔(CD4、CD8各3孔)。培养48 h后，离心收集细胞，4%多聚甲醛固定15 min，荧光素标记的CD4、CD8单抗37°C过夜，在荧光显微镜下观察有荧光细胞，上FACStarPLUS型流式细胞仪检测1×104个细胞。
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1.8 数据处理
各组数据采用Gwbasic统计程序中单因素方差分析程序PDA-2处理。
2 结果
2.1 SP对脾细胞增殖及分泌IL-2、IL-6、TNF功能的影响
不同SP浓度组的cpm较对照组有明显的提高(P<0.01)，见表1。其中1×10-4mmol/L SP组的cpm达到最高。各组之间在低浓度时cpm有显著性差异(P<0.05)，但浓度达1×10-4mmol/L后，浓度再增高相差也不显著(P>0.05)。以上结果表明SP能明显促进脾细胞的增生。
表1 SP对大鼠脾细胞增殖、分泌IL-2、IL-6
和TNF的影响(n=3)
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Tab 1 Effect of SP on proliferation, secretion of
IL-2,IL-6 and TNF of rat spleen cells(n=3) Group
cpm(min-1)
IL-2(U/ml)
IL-6(pg/ml)
TNF(min-1)
Control
5217±124
4.3±0.98
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0.46±0.01
4833±307
10-9mmol/L
7567±41**
7.4±0.99**
0.45±0.01
4803±12
10-7mmol/L
7792±48**
9.9±0.94**
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0.33±0.02**
5565±223*
10-5mmol/L
8278±36**
18.7±1.1**
0.32±0.02**
5284±20
10-4mmol/L
8716±41**
22.4±1.8**
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0.42±0.02*
4729±204
10-3mmol/L
8507±75**
38.1±1.4**
0.39±0.08**
4200±335*
10-2mmol/L
8594±30**
33.4±1.3**
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0.30±0.01**
4967±676
*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
加入不同浓度SP的脾细胞条件培养上清液对CTLL细胞增殖的作用较对照组有了显著的提高，也即不同浓度的SP对脾细胞分泌IL-2有明显的促进作用(P<0.01)，见表1，各组之间也存在显著性差异(P<0.05)，其中1×10-3mmol/L SP促进脾细胞分泌IL-2的作用达到顶峰，而1×10-3mmol/L和1×10-2mmol/L两组之间无统计学意义。
脾细胞培养上清液用IL-6放射免疫试剂盒测试后的结果，见表1。一定浓度的SP对脾细胞分泌IL-6有明显抑制作用(P<0.01)，在SP浓度达到1×10-2mmol/L时，抑制作用最高；而在SP浓度低时，1×10-9mmol/L对脾细胞分泌IL-6无明显的抑制作用(P>0.05)。
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用TNF放射免疫试剂盒测试的结果，见表1。脾细胞分泌TNF很低，低于放射免疫试剂盒标准曲线的最低值，无法计算TNF的具体含量，用所测得的cpm来表示。显示SP对脾细胞分泌TNF的功能无明显影响(P>0.05)。
2.2 SP对T细胞表型表达的影响
流式细胞仪的测定结果，见表2。1×10-5mmol/L SP对脾细胞中T细胞亚群表型的表达有促进作用，其中对CD4+T细胞的促进作用最明显(P<0.01)，对CD+3(CD+4和CD+8T细胞的总和)T细胞也有促进作用(P<0.05)，而对CD+8T细胞的作用不明显，无统计学意义(P>0.05)，因此CD+4/CD+8比值升高(P<0.01)。
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表2 SP对大鼠脾细胞中T细胞亚群表型表达的影响(n=3)
Tab 2 Effects of SP on phenotype of T lymphocyte
of rat spleen cells(n=3) Group
CD+4
CD+8
CD+3(CD+4+CD+8)
CD+4/CD+8
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Control
709±16
775±19
1 484±35
0.9149±0.0018
SP(1×10-2mmol/L)
821±19**
753±17
1 574±36*
1.0898±0.0043**
*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
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3 讨论
SP是体内最常见的神经肽，也是第一个被发现的脑肠肽。它在体内广泛存在，几乎遍布全身，其中在胃肠道内含量最为丰富。SP除了可作为神经递质传递信息之外，还具有广泛的生物学活性。近年来SP对免疫功能的调节作用越来越受到人们的关注，已有实验证明在多种免疫细胞上均有SP的特异性受体[1，6，7]，SP对免疫功能的多个方面均有促进作用。
我们用3H-TdR掺入法观察了SP对体外培养大鼠脾细胞增殖作用的调节，结果发现SP对脾细胞的增殖作用有明显的促进作用，这与多位研究工作者的文献报道SP对淋巴细胞的增殖有促进作用的结果相一致[2，3，8，9]。
对于脾细胞分泌功能，我们选用了检测IL-2、IL-6和TNF。IL-2具有极为重要的免疫调节功能，因此研究SP对IL-2产生的调节作用，有助于更深入了解它对免疫调节的机制。对IL-2活性的生物学检测，本实验采用3H-TdR掺入法来检测CTLL细胞的增殖情况，同时设标准品组，结果显示SP对脾细胞分泌IL-2有明显的促进作用，并且与SP的浓度存在明显的量效关系，但达到一定浓度(本实验是1×10-3mmol/L)后，浓度再高，对脾细胞的促进作用不再加强。我们实验的结果与Calvo[10]的报道SP增强Jurkat T细胞的IL-2 mRNA信号，促进活化T细胞的IL-2的分泌的相一致。
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IL-6和TNF也是近年来免疫学研究的热点，IL-6是一种生物学活性极为广泛的细胞因子，TNF也是一种多功能细胞因子。SP对淋巴细胞分泌IL-6和TNF的作用，文献报道不多。我们用放免法测定加入SP的脾细胞培养上清液，结果发现加入SP的上清液中IL-6含量明显低于对照组，而TNF却无明显变化，即SP具有显著抑制脾细胞分泌IL-6的作用，而对分泌TNF无作用。
近年来研究指出，T细胞表面的CD3、CD4以及CD8分子都是T细胞识别抗原、传递活化信号以及发挥杀伤靶细胞效应时所不可缺少的分子[11]。本实验用流式细胞仪检测的结果证实SP在一定剂量范围内可促进这些CD分子的表达，脾细胞内T细胞表达CD+3(T细胞总数)和CD+4(辅助/诱导T细胞)T淋巴细胞明显增加，而对CD+8(抑制/杀伤T细胞)T细胞的表达无影响，CD+4与CD+8细胞的比值升高。这与SP促进脾细胞增殖和分泌IL-2的结果相符，SP促进脾细胞中的T细胞(CD+3)增殖，主要是促进CD+4T细胞增生，该细胞亚型T细胞分泌IL-2。这些提示SP对免疫应答的促进作用有部分机制可能是通过促进这些分子的表达，从而增强T细胞对抗原识别及信号传递的能力。
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SP在全身分布广泛，尤其在胃肠道内分布最为丰富，它可能在胃肠道的舒缩、肠壁血液供应及肠道免疫功能等方面起重要的调节作用。在病理情况下，尤其在一些强应激状态中，胃肠道内的SP含量发生明显的变化。蔡文琴等[5]对枪弹伤及20 Gy-γ射线照射后胃肠道SP的变化进行了研究，结果显示在强应激状态下胃肠道的SP变化不仅存在，而且呈现有明显的反应性。我们对烧伤后大鼠肠道的SP含量也进行的测定，发现伤后SP明显升高(具体资料正在整理中)。在这些情况下，SP的变化对肠道粘膜免疫屏障以及肠道免疫功能的相关性，可能会影响烧伤和创伤后肠源性感染的发生及病程发展。
基金项目：军队“九五”攻关课题项目(96L042)
Foundation item: "Ninth five" obligatory budget of PLA(96L042)
作者简介：李成仁，男，1970.08.10生，浙江省东阳市人，硕士，助教，主要从事神经生物学方面的研究，发表论文4篇。电话：(023)68752229
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参考文献
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[3] Stanisz A M, Befus D, Bienenstock J. Differential effects of vasoactive intestinal peptide, substance P, and somatostatin on immunoglobulin synthesis and proliferations by lymphocytes from Peyer's patches, mesenteric lymph nodes, and spleen[J]. J Immunol,1986,136(1):152-156.
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[5] 蔡文琴，王正品.大鼠肠型放射病时VIP、SP、L-EN及SOM的变化-放射免疫测定、免疫组化和电镜观察[J].解剖学报，1989，20(Suppl):60-63.
[6] Bost K L, Breeding S A, Pascual D W. Modulation of the mRNAs encoding substance P and its receptor in rat macrophages by LPS[J]. Reg Immunol,1992,4(2):105-112.
[7] Payan D G, Brewster D R, Goetzl E J. Stereospecific receptors for substance P on cultured human IM-9 lymphoblasts[J].J Immunol,1984,133(6):3260-3265.
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[8] Payan D G, Brewster D R, Goetzl E J. Specific stimulation of human T lymphocytes by substance P[J]. J Immunol,1985,135(Suppl 2):802-807.
[9] Luber-Narod J, Kage R, Leeman S E. Substance P enhances the secretion of tumor necrosis factor-alpha from neuroglial cells stimulated with lipopolysaccharide[J]. J Immunol,1994,152(2):819-824.
[10] Calvo C F. Substance P stabilizes interleukin-2 mRNA in activated Jurkat T cells[J]. J Neuroimmunol,1994,51(1):85-91.
[11] Abbas A K, Lichtman A H, Pober J S. Cellular and Molecular Immunology[M]. USA: W B Saunders Company,1994.128-130.
收稿日期：1998-11-10；修回日期：1999-08-11, 百拇医药