FMS基因突变在化疗后妇女及后代检测的意义
作者：王骅 张彦娜 黄必军 李艳芳 梁启万
单位：中山医科大学肿瘤医院，广东广州510060
关键词：化疗；FMS癌基因；突变
现代康复/991204
[摘要]目的：探索一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法。方法：以部分未经化疗的妇癌患者为对照，对部分经化疗后痊愈的患者和后代用半巢式多聚酶链反应-单链构象多态性分析法(Semi-nesledPCR-SSCP法)检测FMS基因的突变。结果：实验组4个标本中，1个取自乳腺癌患者的血清本的FMS969密码子出现突变，其余3个实验组的标本和对照组全部标本均为野生型FMS。结论：由于在1例经过化疗的乳腺癌患者血清中检出FMS969密码子突变，而其子宫肌瘤组织则为野生型，无突变。对照组无1例突变。说明该患者FMS969密码子的突变并非先天遗传的，而是后天的改变，因为在其体细胞上仍呈正常的基因型。根据有关研究结果推测，这种畸变很可能是化疗药物引起的。FMS基因突变的检测对化疗后保留生育力的患者及所生的子女的随访是有意义的，是一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R394.2
[文献标识码]A
[文章编号]1007-5496(1999)12-1414-02
Axamine gene FMS mutation meaning after
chemotherapy woman and treir descerdant
WANG Hua,HUANG Bi-jun,LI Yan-fang,et al.
Zhongshan Medical College Tumour Hospital,Guangdong Guangzhou 510060,China
[Abstract]Objective： To establish a method for monitoring of the gynecological malignancy patients with reservation of fertility and their children birthed after chemotherapy.Method： Using a semi-nested PCR SSCP technique to detect the FMS mutation in the patients and the controled group.Results： Among 4 specimens in study group,FMS mutation at codon 969 was found in a serum specimen from a patient with breast carcinoma ,treated with chemotherapy before her hysterectomy because of the diagnosis of leomyoma of the uterus .Interestingly ,wild type FMS gene was found in the leomyoma tissue of the same patients.Wild type FMS gene was also found in other 2 specimens of study group as well as in all specimens of control group.Conclusion： The mutation of FMS gene was found in serum specimen only,and the wild type of gene was found in the specimen obtained from the tissue of leomyoma from the same patient.This result implied that the mutation is acquired other than congenital,because the wild type gene was found in the body cells.According to the results of other researchers studies,the mutation should be caused by chemotherapy.Therefore,this study suggested that the detection of mutation of FMS gene may be used as a follow-up method for the patients with gynecologic malignancies cured by chemotherapy along and with reservation of fertility and their children born after the chemotherapy.However,the roll of the detection should be revaluated furthermore.
, 百拇医药
[Key words]female;fertility;descendants;anticancer drugs;chemotherapy;gene FMS;mutation
随着抗癌化疗研究的发展，大量抗癌药投入临床使用，而且由于治疗方法的进步，不少妇女单纯用化疗方法得到完全治愈并保存了生育功能。但是，抗癌药可能在人体上引起各种变化和影响，其中对生殖机能以及对所生的后代的影响特别引起人们的注意。
我科自1964～1993年底对恶性滋养细胞瘤进行以化疗为主的综合治疗[1]，其中有近20%的患者成功保留了生育功能，并有91.6%的患者怀孕成功，生育了121个活婴儿。已有研究发现：化疗可能引发继发性白血病，并发现继发性白血病患者常发生FMS基因的突变。为了探索一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法，我们用半巢式PCR—SSCP法检测FMS基因的突变，以部分未经化疗的妇癌患者为对照，对部分经化疗后痊愈的患者和后代进行检查。现将研究结果作初步报告。
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1 资料与方法
1.1 病例 1996年10月～1997年8月对38例患者的39个标本(除1个组织标本外，其余均为外周血的血清标本。其中1例乳腺癌患者取了外周血和子宫肌瘤组织分别进行检测。)，用半巢式多聚酶链反应-单FMS969密码子的突变情况进行检测。将38例分为2组：(1)实验组：曾接受化疗者或其后代3例(共取4个标本)，其中恶性滋养叶细胞肿瘤化疗后1例，该患者所生男孩1例，乳腺癌手术并发化疗后1例(取外周血和子宫肌瘤组织2个标本。该例采用CMF方案化疗1疗程，共用5FU4.5g,CTX4.8g,MTX240mg。)；(2)对照组：未化疗的妇癌患者35例，其中宫颈癌8例，子宫内膜癌4例，子宫肉瘤3例，卵巢恶性肿瘤16例，恶性滋养细胞肿瘤3例，阴道黑色素瘤1例。
1.2 Semi-nesledPCR-SSCP检测法本研究采用Taylor[6]等应用的方法并作了改良。具体按下列步骤进行：
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1.2.1 标本处理采用外周血标本者用红细胞冻融法分离单核细胞(PBMC)；采用组织标本者取组织块加裂解液，用匀浆机打碎。然后进行下列同样步骤处理。
1.2.2 DNA提取 蛋白酶K消化后，用氯仿/酚抽提法提取DNA。-20℃保存待测。
1.2.3 半巢式PCR-SSCP 第1次PCR，设计一对引物，将含有FMS-codon969片段(1.85bp)扩增出来。半巢式—PCR：3′端引物不变，5′端取185bp的片段内一引物，扩增出969bp片段，电泳鉴定。SSCP：将半巢式PCR产物变性，进行非变性胶的PAGE电泳，银染，观察结果见图1。
图1 FMS癌基因突变检测(SEMI-NESTEDPCRSSCP法)的结果
21、22FMS癌基因为野生型，标本取自对照组(妇癌病人未经化疗)。23FMS癌基因发生突变，标本取自实验组因乳腺癌术后并接受过化疗的病人的血清。24FMS癌基因为野生型，标本取自23的同一病人的子宫肌瘤组织。25FMS癌基因为野生型，标本取自实验组病人的血清。
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2 结果
实验组4个标本中，1个取自乳腺癌患者的血清标本的FMS969密码子出现突变。其余3个实验组的标本(包括取自乳腺癌患者的子宫肌瘤标本)和对照组全部标本均为野生型FMS。
3 讨论
抗癌药对妇女生育力和后代的影响，由于它的日渐广泛的应用而受到越来越大的重视。人们关注的问题主要有两个：(1)患者生育力所受的抑制程度；(2)对患者本人及所生后代的影响。
从目前多宗临床报道来看，第1个问题的答案似乎比较明确和肯定。即目前比较经常使用的抗癌药，对妇女的生育力的影响并不大，只要生殖器官保留完整或比较完整，治疗后再生育的可能性很大。我科自1964年6月治疗恶性滋养细胞肿瘤681例，保留生育功能的成功率为19.5%，妊娠率为91.8%。宋鸿钊等[2]报告410例恶性滋养细胞肿瘤成功保留子宫，其怀孕率为87.9%。国外还有多个研究报告了相似的结果[3～4]。除了恶性滋养细胞肿瘤之外，其他的恶性肿瘤也有治疗后成功保留生育力的报告[5～7]。
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至于第2个问题，即抗癌药对所生后代的影响，则因情况比较复杂，答案尚未完全明确。目前大多数的研究报告都未发现有大的影响。我科报告的恶性滋养细胞肿瘤化疗后保留了生育力的妇女所生的婴儿共122名，除2名于婴儿期死亡外，其余在体格、精神和智力发育方面都正常。宋鸿钊等[2]报告的后代包括子代和孙代的体格发育和精神发育均正常，也未见智力低下的。日本SUZUKI[3]等报告化疗后生产的101个儿童的生长情况，其身高体重与日本全国婴幼儿发育情况相比无明显差异。应用婴幼儿童精神发育测定法检查他们的精神发育情况，也未发现明显精神发育迟钝。
上述结果，由于病例数量较少，观察时间也较短，所以还需进一步积累更多的病例，观察更长的时间，才能得出较准确的结论。而且，上述研究仅限于临床观察，还没有从细胞生物学及生物遗传学的角度进行更深入的研究。
本研究正是从这一点出发，应用FMS基因突变的检测技术对保留生育功能的妇女和她们所生的子女进行研究。一般认为：化疗药物进入人体后，除了作用于肿瘤细胞外，还可能作用于其他细胞以及控制这些细胞生长的基因。其中负责携带遗传密码的DNA受到的影响尤其引人注意。化疗引起继发性白血病便是一个突出的例子。Kaldol等[8]报告了一组国际型合作的肿瘤研究资料，在存活的99113例卵巢癌中，发现114例化疗后继发性白血病。Taylor等[9]用分子遗传学方法检查50例儿童期患淋巴性白血病而目前血液学检查已完全缓解的患者。他们用PCR及寡核苷酸杂交(ONH)法检测RAS基因密码子12、13、61和FMS基因密码子969。结果发现3例(6%)N12RAS畸变，其中1例同时伴有FMS969的畸变。作者认为临床追踪这些病人可
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能有助于发现这些畸变在继发性白血病的发生过程中所起的作用。基于这些发现，本研究对化疗后的患者及其后代用经过改良的半透膜PCR-SSCP法(Semi-nesledPCR-SSCP)检测FMS969的突变。结果在1例经过化疗的乳腺癌患者血清中检出这种突变，而其子宫肌瘤组织则为野生型，无突变。对照组无1例突变。这种现象说明：该患者FMS969密码子的突变并非先天遗传的，而是后天的改变，因为在其体细胞上仍呈正常的基因型，根据Taylor的研究，这种畸变很可能是化疗药物引起的。
总之，本研究结果表明：FMS969的检测对化疗后保留生育力的患者及所生的子女的随访是有意义的，是一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法。不过，其意义还需进一步观察。
作者简介：王骅(1943-)，广东人，男，副主任医师，副主任。研究方向：妇科肿瘤诊治，尤其是妇癌保留生育力及化疗可致继发性疾病的鉴测。1986～1987年曾在美国威斯康星州医学院妇科进修一年多。
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参考文献
[1]王骅，李孟达.恶性妊娠性滋养细胞肿瘤患者保留生育力的研究[J].现代妇产科进展，1997，6(2)：127
[2]宋鸿钊，杨秀玉.恶性滋养细胞肿瘤化疗后所生子代和孙代的长期随访结果[J].上海：全国第六届妇产科会议
[3] Suzuki L.Pregnancy after chemotherapy for trophoblastic dis eases and psychosomatic development in the progeny[J].AciaOceania J Obstet Gynecol,1993,19(4):407
[4] Cobanoglu O.Reproductive outcome after chemotherapy for gestational trophoblastic diseases(meeting abstract)8 th Inter national Meeting of European Society of Gynecological Oncolo-gy,Spain:Barcelona,1993:9～ 12
, http://www.100md.com
[5] Forney JP， et al.Pregnancy following removal and chemotherapy forendodermal sinus tumor[J].Obste Gynecol,1978,52:360
[6] Pectasides D,et al.Fertility after chemotherapy for ovarian germcell tumors[J].Br J Obstet Gynecol,1987,94:477
[7] Wu P E,et al.Treatment of malignant germ cell tumors withp-reservation of fertility[J].A report of 28 cases,1991,40:2
[8] Kaldor J.M,et al.Leukemia following chemotherapy for ovarian cancers[J].The New Englang J of Medicine ,1990,322(1): 1～ 6
[9] Taylor ,et al.RAS and FMS mutations following cytotoxic therapy for childhood lymphoblastic leukaemia[J].Leukaemia,1995,9 (3):466～470
[收稿日期]1998-11-26
[修回日期]1999-10-09, http://www.100md.com
单位：中山医科大学肿瘤医院，广东广州510060
关键词：化疗；FMS癌基因；突变
现代康复/991204
[摘要]目的：探索一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法。方法：以部分未经化疗的妇癌患者为对照，对部分经化疗后痊愈的患者和后代用半巢式多聚酶链反应-单链构象多态性分析法(Semi-nesledPCR-SSCP法)检测FMS基因的突变。结果：实验组4个标本中，1个取自乳腺癌患者的血清本的FMS969密码子出现突变，其余3个实验组的标本和对照组全部标本均为野生型FMS。结论：由于在1例经过化疗的乳腺癌患者血清中检出FMS969密码子突变，而其子宫肌瘤组织则为野生型，无突变。对照组无1例突变。说明该患者FMS969密码子的突变并非先天遗传的，而是后天的改变，因为在其体细胞上仍呈正常的基因型。根据有关研究结果推测，这种畸变很可能是化疗药物引起的。FMS基因突变的检测对化疗后保留生育力的患者及所生的子女的随访是有意义的，是一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法。
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[中图分类号]R394.2
[文献标识码]A
[文章编号]1007-5496(1999)12-1414-02
Axamine gene FMS mutation meaning after
chemotherapy woman and treir descerdant
WANG Hua,HUANG Bi-jun,LI Yan-fang,et al.
Zhongshan Medical College Tumour Hospital,Guangdong Guangzhou 510060,China
[Abstract]Objective： To establish a method for monitoring of the gynecological malignancy patients with reservation of fertility and their children birthed after chemotherapy.Method： Using a semi-nested PCR SSCP technique to detect the FMS mutation in the patients and the controled group.Results： Among 4 specimens in study group,FMS mutation at codon 969 was found in a serum specimen from a patient with breast carcinoma ,treated with chemotherapy before her hysterectomy because of the diagnosis of leomyoma of the uterus .Interestingly ,wild type FMS gene was found in the leomyoma tissue of the same patients.Wild type FMS gene was also found in other 2 specimens of study group as well as in all specimens of control group.Conclusion： The mutation of FMS gene was found in serum specimen only,and the wild type of gene was found in the specimen obtained from the tissue of leomyoma from the same patient.This result implied that the mutation is acquired other than congenital,because the wild type gene was found in the body cells.According to the results of other researchers studies,the mutation should be caused by chemotherapy.Therefore,this study suggested that the detection of mutation of FMS gene may be used as a follow-up method for the patients with gynecologic malignancies cured by chemotherapy along and with reservation of fertility and their children born after the chemotherapy.However,the roll of the detection should be revaluated furthermore.
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[Key words]female;fertility;descendants;anticancer drugs;chemotherapy;gene FMS;mutation
随着抗癌化疗研究的发展，大量抗癌药投入临床使用，而且由于治疗方法的进步，不少妇女单纯用化疗方法得到完全治愈并保存了生育功能。但是，抗癌药可能在人体上引起各种变化和影响，其中对生殖机能以及对所生的后代的影响特别引起人们的注意。
我科自1964～1993年底对恶性滋养细胞瘤进行以化疗为主的综合治疗[1]，其中有近20%的患者成功保留了生育功能，并有91.6%的患者怀孕成功，生育了121个活婴儿。已有研究发现：化疗可能引发继发性白血病，并发现继发性白血病患者常发生FMS基因的突变。为了探索一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法，我们用半巢式PCR—SSCP法检测FMS基因的突变，以部分未经化疗的妇癌患者为对照，对部分经化疗后痊愈的患者和后代进行检查。现将研究结果作初步报告。
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1 资料与方法
1.1 病例 1996年10月～1997年8月对38例患者的39个标本(除1个组织标本外，其余均为外周血的血清标本。其中1例乳腺癌患者取了外周血和子宫肌瘤组织分别进行检测。)，用半巢式多聚酶链反应-单FMS969密码子的突变情况进行检测。将38例分为2组：(1)实验组：曾接受化疗者或其后代3例(共取4个标本)，其中恶性滋养叶细胞肿瘤化疗后1例，该患者所生男孩1例，乳腺癌手术并发化疗后1例(取外周血和子宫肌瘤组织2个标本。该例采用CMF方案化疗1疗程，共用5FU4.5g,CTX4.8g,MTX240mg。)；(2)对照组：未化疗的妇癌患者35例，其中宫颈癌8例，子宫内膜癌4例，子宫肉瘤3例，卵巢恶性肿瘤16例，恶性滋养细胞肿瘤3例，阴道黑色素瘤1例。
1.2 Semi-nesledPCR-SSCP检测法本研究采用Taylor[6]等应用的方法并作了改良。具体按下列步骤进行：
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1.2.1 标本处理采用外周血标本者用红细胞冻融法分离单核细胞(PBMC)；采用组织标本者取组织块加裂解液，用匀浆机打碎。然后进行下列同样步骤处理。
1.2.2 DNA提取 蛋白酶K消化后，用氯仿/酚抽提法提取DNA。-20℃保存待测。
1.2.3 半巢式PCR-SSCP 第1次PCR，设计一对引物，将含有FMS-codon969片段(1.85bp)扩增出来。半巢式—PCR：3′端引物不变，5′端取185bp的片段内一引物，扩增出969bp片段，电泳鉴定。SSCP：将半巢式PCR产物变性，进行非变性胶的PAGE电泳，银染，观察结果见图1。
图1 FMS癌基因突变检测(SEMI-NESTEDPCRSSCP法)的结果
21、22FMS癌基因为野生型，标本取自对照组(妇癌病人未经化疗)。23FMS癌基因发生突变，标本取自实验组因乳腺癌术后并接受过化疗的病人的血清。24FMS癌基因为野生型，标本取自23的同一病人的子宫肌瘤组织。25FMS癌基因为野生型，标本取自实验组病人的血清。
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2 结果
实验组4个标本中，1个取自乳腺癌患者的血清标本的FMS969密码子出现突变。其余3个实验组的标本(包括取自乳腺癌患者的子宫肌瘤标本)和对照组全部标本均为野生型FMS。
3 讨论
抗癌药对妇女生育力和后代的影响，由于它的日渐广泛的应用而受到越来越大的重视。人们关注的问题主要有两个：(1)患者生育力所受的抑制程度；(2)对患者本人及所生后代的影响。
从目前多宗临床报道来看，第1个问题的答案似乎比较明确和肯定。即目前比较经常使用的抗癌药，对妇女的生育力的影响并不大，只要生殖器官保留完整或比较完整，治疗后再生育的可能性很大。我科自1964年6月治疗恶性滋养细胞肿瘤681例，保留生育功能的成功率为19.5%，妊娠率为91.8%。宋鸿钊等[2]报告410例恶性滋养细胞肿瘤成功保留子宫，其怀孕率为87.9%。国外还有多个研究报告了相似的结果[3～4]。除了恶性滋养细胞肿瘤之外，其他的恶性肿瘤也有治疗后成功保留生育力的报告[5～7]。
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至于第2个问题，即抗癌药对所生后代的影响，则因情况比较复杂，答案尚未完全明确。目前大多数的研究报告都未发现有大的影响。我科报告的恶性滋养细胞肿瘤化疗后保留了生育力的妇女所生的婴儿共122名，除2名于婴儿期死亡外，其余在体格、精神和智力发育方面都正常。宋鸿钊等[2]报告的后代包括子代和孙代的体格发育和精神发育均正常，也未见智力低下的。日本SUZUKI[3]等报告化疗后生产的101个儿童的生长情况，其身高体重与日本全国婴幼儿发育情况相比无明显差异。应用婴幼儿童精神发育测定法检查他们的精神发育情况，也未发现明显精神发育迟钝。
上述结果，由于病例数量较少，观察时间也较短，所以还需进一步积累更多的病例，观察更长的时间，才能得出较准确的结论。而且，上述研究仅限于临床观察，还没有从细胞生物学及生物遗传学的角度进行更深入的研究。
本研究正是从这一点出发，应用FMS基因突变的检测技术对保留生育功能的妇女和她们所生的子女进行研究。一般认为：化疗药物进入人体后，除了作用于肿瘤细胞外，还可能作用于其他细胞以及控制这些细胞生长的基因。其中负责携带遗传密码的DNA受到的影响尤其引人注意。化疗引起继发性白血病便是一个突出的例子。Kaldol等[8]报告了一组国际型合作的肿瘤研究资料，在存活的99113例卵巢癌中，发现114例化疗后继发性白血病。Taylor等[9]用分子遗传学方法检查50例儿童期患淋巴性白血病而目前血液学检查已完全缓解的患者。他们用PCR及寡核苷酸杂交(ONH)法检测RAS基因密码子12、13、61和FMS基因密码子969。结果发现3例(6%)N12RAS畸变，其中1例同时伴有FMS969的畸变。作者认为临床追踪这些病人可
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能有助于发现这些畸变在继发性白血病的发生过程中所起的作用。基于这些发现，本研究对化疗后的患者及其后代用经过改良的半透膜PCR-SSCP法(Semi-nesledPCR-SSCP)检测FMS969的突变。结果在1例经过化疗的乳腺癌患者血清中检出这种突变，而其子宫肌瘤组织则为野生型，无突变。对照组无1例突变。这种现象说明：该患者FMS969密码子的突变并非先天遗传的，而是后天的改变，因为在其体细胞上仍呈正常的基因型，根据Taylor的研究，这种畸变很可能是化疗药物引起的。
总之，本研究结果表明：FMS969的检测对化疗后保留生育力的患者及所生的子女的随访是有意义的，是一种可用于了解妇科肿瘤患者及其后代受化疗影响的检测方法。不过，其意义还需进一步观察。
作者简介：王骅(1943-)，广东人，男，副主任医师，副主任。研究方向：妇科肿瘤诊治，尤其是妇癌保留生育力及化疗可致继发性疾病的鉴测。1986～1987年曾在美国威斯康星州医学院妇科进修一年多。
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参考文献
[1]王骅，李孟达.恶性妊娠性滋养细胞肿瘤患者保留生育力的研究[J].现代妇产科进展，1997，6(2)：127
[2]宋鸿钊，杨秀玉.恶性滋养细胞肿瘤化疗后所生子代和孙代的长期随访结果[J].上海：全国第六届妇产科会议
[3] Suzuki L.Pregnancy after chemotherapy for trophoblastic dis eases and psychosomatic development in the progeny[J].AciaOceania J Obstet Gynecol,1993,19(4):407
[4] Cobanoglu O.Reproductive outcome after chemotherapy for gestational trophoblastic diseases(meeting abstract)8 th Inter national Meeting of European Society of Gynecological Oncolo-gy,Spain:Barcelona,1993:9～ 12
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[5] Forney JP， et al.Pregnancy following removal and chemotherapy forendodermal sinus tumor[J].Obste Gynecol,1978,52:360
[6] Pectasides D,et al.Fertility after chemotherapy for ovarian germcell tumors[J].Br J Obstet Gynecol,1987,94:477
[7] Wu P E,et al.Treatment of malignant germ cell tumors withp-reservation of fertility[J].A report of 28 cases,1991,40:2
[8] Kaldor J.M,et al.Leukemia following chemotherapy for ovarian cancers[J].The New Englang J of Medicine ,1990,322(1): 1～ 6
[9] Taylor ,et al.RAS and FMS mutations following cytotoxic therapy for childhood lymphoblastic leukaemia[J].Leukaemia,1995,9 (3):466～470
[收稿日期]1998-11-26
[修回日期]1999-10-09, http://www.100md.com