柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病关系的研究
作者：张鹤萍 纪 辉 关振中 李 旋 牛美娟
单位：张鹤萍 关振中 李 旋 牛美娟 哈尔滨医科大学附属第二医院心内科，150086；纪 辉 黑龙江省嘉荫县人民医院
关键词：
中国急救医学991213 病毒性心肌炎和扩张型心肌病是心血管疾病中的常见病和多发病。许多学者的研究证实病毒性心肌炎的发病大部分与肠道病毒感染有关，尤其以柯萨奇病毒最为多见[1～4]，占心肌炎的40%～50%。关于扩张型心肌病的病因很复杂，可能与病毒感染、免疫障碍、神经体液因素、小血管病变、酗酒、遗传、中毒等因素有关。但目前有许多资料提示扩张型心肌病与病毒感染有关[5～8]，主张它是由CBV感染导致心肌炎进一步发展的结果。确定病毒感染与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系，对两病的预防、诊断和治疗均具有指导意义。本实验用CBV3cDNA重组质粒PGP51BDNA片断，通过光敏生物素法制备CBV3cDNA核酸探针与心肌切片标本进行原位杂交，检测心肌组织中柯萨奇B组病毒核酸，证实了柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系。
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1 材料与方法
1.1 CBV3重组质粒DNA(PGP51B) 哈医大微生物教研室。
1.2 待检标本 心肌石蜡包埋标本由哈尔滨医科大学附属第二医院病理科提供，经临床和病理检查确诊的心肌炎15例，扩张型心肌病7例。
1.3 CBV3cDNA核酸探针的制备 将含有CBV3cDNA重组质粒PGP51B进行质粒扩增，超速离心回收和纯化，用限制性内切酶PST切割，电洗脱，最后得到纯化的CBV3cDNA特异性片断，-30℃保存待用。cDNA片断采用光敏生物素法进行标记，主要步骤参考文献[9]。
1.4 原位杂交 方法简述如下，制备好的心肌组织石蜡切片用二甲苯脱蜡，乙醇水化，0.2 mol/L HCl室温处理20分钟，2×SSC(SSC：0.15 mol/ NaCl，0.015 mol/L柠檬酸钠)65℃处理20分钟，加入蛋白酶K(0.5 mol/L)，37℃消化15分钟，乙醇逐级脱水。加入预杂交液(50%甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s液、0.5 mg/mlxin新鲜变性的切变鲱精DNA、50 mmol/L磷酸钠缓冲液pH 6.5、5 mmol/L EDTA)温盒内42℃～45℃预杂交3～4小时，CBV3cDNA探针100℃煮沸5分钟，浸入冰水中变性，加到心肌切片上，再加杂交液42℃过夜，用2×SSC室温洗5分钟，0.1%TritonX—100室温冲洗2分钟，PBS洗3次，每次10分钟。加显色底物NBT、BCLP 37℃水浴2小时，显微镜观察结果。
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2 结果
15例临床确诊为病毒性心肌炎患者中，经心内膜心肌活检及光镜检查发现4例有早期心肌病的组织形态学改变，而7例临床确诊为扩张型心肌病的患者中，经心内膜心肌活检及光镜下检查发现有4例组织形态学同时有心肌炎性改变，这一结果说明病毒性心肌炎和扩张型心肌病之间有一定关系。
2.1 紫外分光光度计法 将提取的重组质粒DNA用紫外分光光度计扫描在260 nM处出现吸收高峰，OD260为0.071，OD280为0.036，OD260/OD280比值为1.9，均达到标准纯度。因此，本实验提取的质粒DNA纯度及含量均符合要求。
2.2 琼脂糖凝胶电泳法 将提取的质粒DNA做琼脂糖凝电泳，结果如下：重组质粒DNA出现两条典型的主带，与DNA/Hind标准物区带相比可看出提取的质粒DNA含量多、纯度高。
2.3 显微镜下观察原位杂交的结果 我们用标记好的CBV3cDNA探针检测心肌活检标本中的病毒核酸，发现15例组织形态学证实为病毒性心肌炎患者中有11例出现阳性杂交信号，呈兰色，位于受染细胞的胞浆及细胞内；7例组织形态学证实为扩张型心肌病患者中有4例出现阳性杂交信号。并且4例有早期心肌病者有3例出现CBV阳性杂交信号，4例同时有心肌炎性改变者有2例出现CBV阳性杂交信号。以上结果说明病毒性心肌炎和扩张型心肌病都与柯萨奇B组病毒感染心肌有关，部分扩张型心肌病是柯萨奇B组病毒感染心肌导致心肌炎进一步发展的结果。
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3 讨论
近年来，病毒性心肌炎和扩张型心肌病病例相应逐年增多，柯萨奇B组病毒引起的心肌炎动物模型已经证实，在心肌组织中病毒的增殖期仅1～2周，而组织的病理损伤可持续数周或更长[10]。因此，常规的血清学和病毒学方法对病毒性心脏疾病心肌组织中病毒或病毒特异性抗原的检测都是极端困难的[11～14]。而心内膜心肌活检可以从组织学上证实心肌炎，近年来临床医师已逐年应用此项检查诊断心肌炎，并成为目前诊断心肌炎最准确、最重要手段[15]，但对病因的诊断尚存在一定困难。80年代发展起来的原位核酸分子杂交技术，具有准备、特异、快速、直接进行组织定位等优点。病毒感染2周后，心肌组织中病毒消失，免疫荧光法也不能检出病毒抗原，而阳性杂交信号仍大量存在。这些现象表明，尽管在病毒感染早期，心肌组织病毒复制的程度与阳性杂交信号的多少及强弱存在一定的正相关系，病毒RNA却长期存在。可见用病毒基因探针的方法检测活检心肌组织中存在的病毒基因对病毒性心肌疾病的诊断具有特殊意义。
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本实验收集了15例临床诊断为病毒性心肌炎和7例临床确诊为扩张型心肌病患者的心肌活检标本，用核酸原位分子杂交法来探讨柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系，结果有73%的病毒性心肌炎患者与CBV感染有关，57%的扩张型心肌病患者与CBV感染有关。本结果比国内其他报道阳性率高，我们认为这可能是由于不同方法敏感性不同所致，文献报道多采用中和试验、分离病毒的方法，这些方法敏感性均不高，而检测疑诊病毒性心肌炎患者血清中抗CBV免疫球蛋白M，可对病毒性心肌炎进行早期诊断[16]，但敏感性不如核酸原位杂交法。本实验采用最敏感的核酸原位杂交试验，只需要少量的病毒核酸存在，无需有活性的病毒抗原或有感染力的病毒存在即可检测到，故用核酸原位分子杂交法可提高柯萨奇B组病毒感染心肌的检出率。
关于病毒心肌炎和扩张型心肌病的关系本文也做了探讨，Burch[17，18]早在1964年就提出扩张型心肌病可能是原有病毒性心肌炎发展的结果。Bengtsson[19，20]等随访90例病毒性心肌炎患者达5年之久，结果有30%呈现DCM。本实验收集的22例临床确诊为病毒性心肌炎(15例)和扩张型心肌病(7例)患者的心肌活检标本，经病理及光镜检查发现：病毒性心肌炎患者中有26.6%有早期心肌病的组织形态学改变，而扩张型心肌病患者中有57.1%同时有心肌炎性改变。并且发现4例有早期心肌病改变者有3例出现CBV阳性杂交信号，而4例同时有心肌炎性改变的扩张型心肌病患者中有2例出现CBV阳性杂交信号。这进一步说明了DCM是CBV感染导致心肌炎进一步发展的结果。由此可见，病毒性心肌炎是扩张型心肌病的前驱疾病，扩张型心肌病是病毒性心肌炎的晚期阶段。
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作者简介：张鹤萍，女，硕士生，主治医师
参考文献
[1]杨英珍.病毒性心肌炎研究进展.国内外医学科学进展，1989：11.
[2]中华内科学杂志编委会.全国心肌炎心肌病专题座谈会纪要.中华内科杂志，1987，10：597.
[3]Kandell R,Ameis D,Kirschner P,et al.In situ detection of enteroviral genomes in myocardial cells by nucleic acid hybridization:an approach to the diagnosis of viral heat disease.Proc Natl Acad Sei USA,1987,84:6272.
, http://www.100md.com
[4]Richardson-PJ,Why-HJ,Archard-LC.Virus infection and dilated cardiomyopathy.Postgrad Med J，1992，68 Suppl:S17-20.
[5]李进喜，郑道声.特发性扩张型心肌病病因的探讨：病毒感染和免疫机制系乱.国外医学内科学分册，1988，15(5)：216.
[6]Robert Arnold Johnson,M.D,Igor Palacios,M.D.Dilated cardiomyopathies of the adult.N EngI J Med，1988，307:1051.
[7]扬英珍，浦寿月，金佩英，等.心脏病患者血清Coxsackie B组病毒中和抗体的调查.中国循环杂志，1988，3：177.
[8]PJ Quigley,PT Richardson,BT Meany,et al.Long-term follow-up in biopsy proven myocarditis:progression to dilated cardiomyopathy.Br Heart J,1987，57:71.
, 百拇医药
[9]G William Dec,JR,MD,Igor F. Palauaos,MD.John T Fallon,MD,et al.Active myocarditis in the spectrum of acute dilated-cardiomyopathy-clinical histologic correlates and clinical autcome.N Engl J Med,1985,312:885.
[10]Kandolf R,Ameis D,Kirschner P,et al.in situ detection of enteroviral genomes in myocardial cells by nucleic acid hybridization:an approach to the diagnosisof viral heart disease.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:6272.
, http://www.100md.com [11]Aret HT.Diagnosis of myocarditis by endomyocardial biopsy.Med Clin Narth Am,1986,70:1215.
[12]Martino-TA,Liu-P,Sole-MJ.Viral infection and the pathogenesis of dilated cardiomyopathy.Circ-Res,1994 Feb,74(2):182-8.
[13]Petitjean-J,Kopecka-H,Freymuth-F,et al.Detection of enterovinuses in endomyocardial biopsy by molecular approach.J Med Virol,1992,37(1):76-82.
收稿：1998-11-10，修回：1999-04-25, 百拇医药
单位：张鹤萍 关振中 李 旋 牛美娟 哈尔滨医科大学附属第二医院心内科，150086；纪 辉 黑龙江省嘉荫县人民医院
关键词：
中国急救医学991213 病毒性心肌炎和扩张型心肌病是心血管疾病中的常见病和多发病。许多学者的研究证实病毒性心肌炎的发病大部分与肠道病毒感染有关，尤其以柯萨奇病毒最为多见[1～4]，占心肌炎的40%～50%。关于扩张型心肌病的病因很复杂，可能与病毒感染、免疫障碍、神经体液因素、小血管病变、酗酒、遗传、中毒等因素有关。但目前有许多资料提示扩张型心肌病与病毒感染有关[5～8]，主张它是由CBV感染导致心肌炎进一步发展的结果。确定病毒感染与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系，对两病的预防、诊断和治疗均具有指导意义。本实验用CBV3cDNA重组质粒PGP51BDNA片断，通过光敏生物素法制备CBV3cDNA核酸探针与心肌切片标本进行原位杂交，检测心肌组织中柯萨奇B组病毒核酸，证实了柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系。
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1 材料与方法
1.1 CBV3重组质粒DNA(PGP51B) 哈医大微生物教研室。
1.2 待检标本 心肌石蜡包埋标本由哈尔滨医科大学附属第二医院病理科提供，经临床和病理检查确诊的心肌炎15例，扩张型心肌病7例。
1.3 CBV3cDNA核酸探针的制备 将含有CBV3cDNA重组质粒PGP51B进行质粒扩增，超速离心回收和纯化，用限制性内切酶PST切割，电洗脱，最后得到纯化的CBV3cDNA特异性片断，-30℃保存待用。cDNA片断采用光敏生物素法进行标记，主要步骤参考文献[9]。
1.4 原位杂交 方法简述如下，制备好的心肌组织石蜡切片用二甲苯脱蜡，乙醇水化，0.2 mol/L HCl室温处理20分钟，2×SSC(SSC：0.15 mol/ NaCl，0.015 mol/L柠檬酸钠)65℃处理20分钟，加入蛋白酶K(0.5 mol/L)，37℃消化15分钟，乙醇逐级脱水。加入预杂交液(50%甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s液、0.5 mg/mlxin新鲜变性的切变鲱精DNA、50 mmol/L磷酸钠缓冲液pH 6.5、5 mmol/L EDTA)温盒内42℃～45℃预杂交3～4小时，CBV3cDNA探针100℃煮沸5分钟，浸入冰水中变性，加到心肌切片上，再加杂交液42℃过夜，用2×SSC室温洗5分钟，0.1%TritonX—100室温冲洗2分钟，PBS洗3次，每次10分钟。加显色底物NBT、BCLP 37℃水浴2小时，显微镜观察结果。
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2 结果
15例临床确诊为病毒性心肌炎患者中，经心内膜心肌活检及光镜检查发现4例有早期心肌病的组织形态学改变，而7例临床确诊为扩张型心肌病的患者中，经心内膜心肌活检及光镜下检查发现有4例组织形态学同时有心肌炎性改变，这一结果说明病毒性心肌炎和扩张型心肌病之间有一定关系。
2.1 紫外分光光度计法 将提取的重组质粒DNA用紫外分光光度计扫描在260 nM处出现吸收高峰，OD260为0.071，OD280为0.036，OD260/OD280比值为1.9，均达到标准纯度。因此，本实验提取的质粒DNA纯度及含量均符合要求。
2.2 琼脂糖凝胶电泳法 将提取的质粒DNA做琼脂糖凝电泳，结果如下：重组质粒DNA出现两条典型的主带，与DNA/Hind标准物区带相比可看出提取的质粒DNA含量多、纯度高。
2.3 显微镜下观察原位杂交的结果 我们用标记好的CBV3cDNA探针检测心肌活检标本中的病毒核酸，发现15例组织形态学证实为病毒性心肌炎患者中有11例出现阳性杂交信号，呈兰色，位于受染细胞的胞浆及细胞内；7例组织形态学证实为扩张型心肌病患者中有4例出现阳性杂交信号。并且4例有早期心肌病者有3例出现CBV阳性杂交信号，4例同时有心肌炎性改变者有2例出现CBV阳性杂交信号。以上结果说明病毒性心肌炎和扩张型心肌病都与柯萨奇B组病毒感染心肌有关，部分扩张型心肌病是柯萨奇B组病毒感染心肌导致心肌炎进一步发展的结果。
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3 讨论
近年来，病毒性心肌炎和扩张型心肌病病例相应逐年增多，柯萨奇B组病毒引起的心肌炎动物模型已经证实，在心肌组织中病毒的增殖期仅1～2周，而组织的病理损伤可持续数周或更长[10]。因此，常规的血清学和病毒学方法对病毒性心脏疾病心肌组织中病毒或病毒特异性抗原的检测都是极端困难的[11～14]。而心内膜心肌活检可以从组织学上证实心肌炎，近年来临床医师已逐年应用此项检查诊断心肌炎，并成为目前诊断心肌炎最准确、最重要手段[15]，但对病因的诊断尚存在一定困难。80年代发展起来的原位核酸分子杂交技术，具有准备、特异、快速、直接进行组织定位等优点。病毒感染2周后，心肌组织中病毒消失，免疫荧光法也不能检出病毒抗原，而阳性杂交信号仍大量存在。这些现象表明，尽管在病毒感染早期，心肌组织病毒复制的程度与阳性杂交信号的多少及强弱存在一定的正相关系，病毒RNA却长期存在。可见用病毒基因探针的方法检测活检心肌组织中存在的病毒基因对病毒性心肌疾病的诊断具有特殊意义。
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本实验收集了15例临床诊断为病毒性心肌炎和7例临床确诊为扩张型心肌病患者的心肌活检标本，用核酸原位分子杂交法来探讨柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系，结果有73%的病毒性心肌炎患者与CBV感染有关，57%的扩张型心肌病患者与CBV感染有关。本结果比国内其他报道阳性率高，我们认为这可能是由于不同方法敏感性不同所致，文献报道多采用中和试验、分离病毒的方法，这些方法敏感性均不高，而检测疑诊病毒性心肌炎患者血清中抗CBV免疫球蛋白M，可对病毒性心肌炎进行早期诊断[16]，但敏感性不如核酸原位杂交法。本实验采用最敏感的核酸原位杂交试验，只需要少量的病毒核酸存在，无需有活性的病毒抗原或有感染力的病毒存在即可检测到，故用核酸原位分子杂交法可提高柯萨奇B组病毒感染心肌的检出率。
关于病毒心肌炎和扩张型心肌病的关系本文也做了探讨，Burch[17，18]早在1964年就提出扩张型心肌病可能是原有病毒性心肌炎发展的结果。Bengtsson[19，20]等随访90例病毒性心肌炎患者达5年之久，结果有30%呈现DCM。本实验收集的22例临床确诊为病毒性心肌炎(15例)和扩张型心肌病(7例)患者的心肌活检标本，经病理及光镜检查发现：病毒性心肌炎患者中有26.6%有早期心肌病的组织形态学改变，而扩张型心肌病患者中有57.1%同时有心肌炎性改变。并且发现4例有早期心肌病改变者有3例出现CBV阳性杂交信号，而4例同时有心肌炎性改变的扩张型心肌病患者中有2例出现CBV阳性杂交信号。这进一步说明了DCM是CBV感染导致心肌炎进一步发展的结果。由此可见，病毒性心肌炎是扩张型心肌病的前驱疾病，扩张型心肌病是病毒性心肌炎的晚期阶段。
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作者简介：张鹤萍，女，硕士生，主治医师
参考文献
[1]杨英珍.病毒性心肌炎研究进展.国内外医学科学进展，1989：11.
[2]中华内科学杂志编委会.全国心肌炎心肌病专题座谈会纪要.中华内科杂志，1987，10：597.
[3]Kandell R,Ameis D,Kirschner P,et al.In situ detection of enteroviral genomes in myocardial cells by nucleic acid hybridization:an approach to the diagnosis of viral heat disease.Proc Natl Acad Sei USA,1987,84:6272.
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[4]Richardson-PJ,Why-HJ,Archard-LC.Virus infection and dilated cardiomyopathy.Postgrad Med J，1992，68 Suppl:S17-20.
[5]李进喜，郑道声.特发性扩张型心肌病病因的探讨：病毒感染和免疫机制系乱.国外医学内科学分册，1988，15(5)：216.
[6]Robert Arnold Johnson,M.D,Igor Palacios,M.D.Dilated cardiomyopathies of the adult.N EngI J Med，1988，307:1051.
[7]扬英珍，浦寿月，金佩英，等.心脏病患者血清Coxsackie B组病毒中和抗体的调查.中国循环杂志，1988，3：177.
[8]PJ Quigley,PT Richardson,BT Meany,et al.Long-term follow-up in biopsy proven myocarditis:progression to dilated cardiomyopathy.Br Heart J,1987，57:71.
, 百拇医药
[9]G William Dec,JR,MD,Igor F. Palauaos,MD.John T Fallon,MD,et al.Active myocarditis in the spectrum of acute dilated-cardiomyopathy-clinical histologic correlates and clinical autcome.N Engl J Med,1985,312:885.
[10]Kandolf R,Ameis D,Kirschner P,et al.in situ detection of enteroviral genomes in myocardial cells by nucleic acid hybridization:an approach to the diagnosisof viral heart disease.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:6272.
, http://www.100md.com [11]Aret HT.Diagnosis of myocarditis by endomyocardial biopsy.Med Clin Narth Am,1986,70:1215.
[12]Martino-TA,Liu-P,Sole-MJ.Viral infection and the pathogenesis of dilated cardiomyopathy.Circ-Res,1994 Feb,74(2):182-8.
[13]Petitjean-J,Kopecka-H,Freymuth-F,et al.Detection of enterovinuses in endomyocardial biopsy by molecular approach.J Med Virol,1992,37(1):76-82.
收稿：1998-11-10，修回：1999-04-25, 百拇医药