复方汉防己对人成纤维细胞增殖和凋亡及层粘蛋白合成的影响
作者：王要军 权启镇 孙自勤 齐凤 江学良 张修礼 王东
单位：250031 济南军区总医院消化内科
关键词：复方汉防己；成纤维细胞；增殖；凋亡；层粘蛋白
德国医学000111 【摘要】 目的：观察复方汉防己对人成纤维细胞增殖和凋亡及合成层粘蛋白的影响，探讨其抗肝纤维化的机制。方法：采用细胞培养法，于细胞培养液中加入不同浓度的药物，再培养48h，行流式细胞仪检测细胞Fas基因表达，部分细胞涂片进行AgNOR染色，观察AgNOR计数变化，培养上清用放免法测定层粘蛋白含量。结果：正常人成纤维细胞AgNOR计数为2.12±0.50个核，Fas基因表达率为15.42%±6.20%，层粘蛋白含量为1.46±0.47mg/L；加入复方汉防己组AgNOR计数明显下降，Fas表达率增加，培养上清层粘蛋白含量减少。结论：复方汉防己能抑制成纤维细胞的增殖和增加凋亡，使合成层粘蛋白减少，这可能是其抗肝纤维化机理之一。
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Proliferation，apoptosis and laminin synthesis in human fibroblasts affected by fufanghanfangji (Radix stephauiae tetrandrae)
Wang Yaojun,Quan Qizhen,Sun Ziqin,et al.
(Department of Gastroenterology,General Hospital of Jinan Military Region,Jinan 250031)
【Abstract】 Objective:To explore the anti-fibrotic mechanism of Fufanghanfangji,We observed the proliferation,apoptosis and laminin synthesis in fibroblasts affected by Fufanghanfangji.Method:Different dosage of Fufanghanfangji was added in the cultural fibroblasts.AgNOR,the cell proliferative index was showed with silver dye method.Fas gene protein expression which reflected cell apoptosis was assessed by flow cytometry.Laminin was assessed by using radioimmunoassay method.Results:In normal cultural fibroblasts,the AgNOR was 2.12±0.50.Fas gene protein positive rate was 15.42±6.20.And laminin content was 1.46±0.47mg/L.The AgNORcount decreased and Fas postive rate increased in fibroblasts cultured with Fufanghanfangji.And the laminin content in supernate decreased in the cultural cell treated with the drug.Conclusions:Fufanghanfangji can inhibit fibroblasts to proliferate and synthesize extracellular matrix components such as laminin.The drug can also promote cell apoptosis.These may be the anti-fibrotic mechanisms.
, 百拇医药
【Key Words】 Fufanghanfangji Fibroblasts AgNOR Apoptosis Laminin Fas
将人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast,HLF)用于肝纤维化的机理及药物疗效的研究已有报道[1]，作者的临床研究结果提示复方汉防己有良好的抗肝纤维化作用[2]，但其机理尚不清楚。本文观察复方汉防己(汉防己，Radix stephauiae tetrandrae)对培养的HLF核仁组成区嗜银蛋白的变化和Fas基因蛋白表达及其合成层粘蛋白(laminin,LN)的影响，观察药物对成纤维细胞增殖和凋亡以及合成细胞外基质成分的影响，探讨其抗肝纤维化机理。
材料与方法
材料 HLF由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，RPMI-1640培养基为Gibco产品。FITC标记的鼠抗人Fas单克隆抗体为Immunotech产品，流式细胞仪FACScan为美国BD公司产品，LN放免试剂盒为海军医学研究所产品。所用中药经山东中医药大学中药鉴定教研究王长墉教授鉴定无伪。自制复方汉防己水提液(汉防己5.0g,丹参2.5g，半枝莲2.5g，虎杖3.75g，黄芪5.0g等制成水提液，使每毫升含生药1g)。
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方法 细胞培养方法[3]：选择对数期生长的HLF，胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1.2×108/L，分别加入96孔培养板中，每孔1.0ml细胞悬液，分4个浓度组，每个浓度组作6个复孔，置37℃、5%CO2和95%O2的细胞培养箱中孵育24h后，分别加入复方汉防己水提液，使每组药物浓度(生药)分别为0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml，对照组6个孔内加同体积培养，再培养48h，倒置显微镜观察细胞形态后，收集细胞并取上清。
细胞AgNOR银染及计数方法[4，5]：细胞涂片，室温下滴加AgNOR银染工作液(用1%甲酸配制2%明胶，将其与50%硝酸银以1∶2比例混合)于切片上，室温避光1h，蒸镏水冲洗后脱水封固。在油镜下随机计数120个细胞(每一浓度组6张涂片，每张计数20个细胞)核内AgNOR颗粒数，求其均值，即为每组的AgNOR数。
, 百拇医药
表1 不同浓度复方汉防己对HLF AgNOR计数、Fas表达及合成LN的影响(
±s) 复方汉防己浓度(mg/ml)
AgNOR(个/核)
FAS %
LN(mg/L)
对照组0
2.12±0.50
15.42±6.20
1.46±0.47
0.25
0.63±0.21**
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46.23±5.59**
0.55±0.28**
0.125
0.95±0.38**
49.34±3.98**
0.57±0.14**
0.0625
1.31±0.47**
34.14±6.72**
0.64±0.29*
0.03125
, http://www.100md.com 1.54±0.36*
23.51±6.41
0.87±0.30*
与对照组相比*P<0.05 **P<0.01
Fas基因表达检测方法：细胞用70%乙醇固定，调整细胞数为109/ml,分2管，每管加20μl细胞悬液，其中一管加鼠抗人Fas-FITC标记抗体，另一管加羊抗鼠IgG1-FITC作阴性对照。室温避光30min，上机待测。流式细胞仪检测：上机前用标准荧光微球调整仪器，使变异系数在2.0%以内。上机后收集1000个细胞，荧光强度以对数放大。光散射数据存软盘。测试完后在Macintosh650型计算机上用Cell Quest Plot软件(BD公司产)分析数据，由HP1200c/ps打印结果。Fas基因表达值用±s表示。
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LN测定：采用放免法，严格按试剂盒要求操作。
统计学：采用F检验。
结 果
正常培养条件下成纤维细胞AgNOR计数为2.12±0.50个/核，Fas基因表达率为15.42%±6.20%，LN为1.46±0.47mg/L，复方汉防己培养的成纤维细胞AgNOR计数减少，Fas表达阳性率增加，合成LN能力受到抑制(见表1)。
讨 论
肝纤维化过程中成纤维细胞起着极其重要的作用，多数学者认为肝储脂细胞也是限定于特殊组织结构即肝窦周间隙的成纤维细胞[6]。目前成纤维细胞成为肝纤维化细胞学研究的热点。核仁组成区嗜银蛋白是位于人类第13、14、15、21及22号染色体短臂上的一些特殊区域，其中包含着编码为rRNA的基因。AgNOR计数的多少主要取决于转录的活性水平，因此AgNOR是核增殖活性的一个指标。本文结果显示复方汉防己能抑制成纤维细胞AgNOR计数，提示它能抑制成纤维细胞的增殖活性。其抑制作用随浓度增加而增强。
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细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，是一种生理性细胞自杀现象，其生理功能在于维持细胞正常数量在组织和器官中的生长与死亡之间的动态平衡。凋亡与细胞增殖是保持肌体相对稳定的对立统一体，它们共同决定组织器官的增生与退化。Fas基因蛋白是新发现的一种凋亡信息的细胞表面蛋白，它位于人类第10号染色体上臂，含在235个氨基酸，Fas基因蛋白表达的消长能够反映细胞凋亡的程度。本文结果提示复方汉防己能促进人成纤维细胞的凋亡。
LN是肝纤维化的重要的细胞外基质，在肝纤维化或肝硬化早期即明显升高，它主要来自于成纤维细胞[7]。复方汉防己能显著抑制LN的合成。
中医认为肝纤维化和肝硬化多属于血淤，但还有湿热、肝郁、脾虚、阴虚4个基本证型，肝硬化时同时存在气滞、湿遏、热蕴、痰阻表现者也很多，故单味中药难以起到全面效果，只有依赖于中药复方制剂[8]。动物实验及临床研究结果显示，汉防己提取物汉防己甲素具有抑制肝组织成纤维细胞增殖和转化，从而减轻肝组织细胞外基质和防治肝纤维化，丹参可改善肝脏微循环，抗脂质过氧化，增强网状内皮系统吞噬功能，促进肝再生和抗肝纤维化作用。黄芪则具有良好的免疫促进作用和抗肝纤维化作用。我们以汉防己、丹参、黄芪等组成活血化淤、软坚散结方治疗肝硬化取得良好疗效，但机理尚不清楚。本文结果提示复方汉防己能抑制人成纤维细胞的增殖活性、促进其凋亡并抑制合成细胞外基质成分如LN的能力，从而防治肝纤维化。这可能是复方汉防己抗肝纤维化的机理之一。
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参考文献
1，刘海林.桂利嗪、尼卡地平对人成纤维细胞胶原合成的影响.中国药理学通报，1994，10∶308-310.
2，王要军.活血化淤治疗失代偿期肝硬化的临床疗效及T细胞亚群观察.滨州医学院学报，1996，19∶441-444.
3，齐凤.EGTA、A23187对人成纤维细胞DNA合成的影响.上海第二医科大学学报，1994，14∶173-174.
4，王要军.良性与恶性疾病胃粘膜活检标本核仁组成区嗜银蛋白的研究.中国冶金工业医学杂志，1996，13∶1-2.
5，崔玉芳.地塞米松对成纤维细胞核仁组成区相关嗜银蛋白增生的抑制作用.中国病理生理杂志，1999，15∶57-59.
6，王要军.储脂细胞与肝纤维化.临床肝胆病杂志，1993，9∶182-183.
7，王要军.肝纤维化的细胞学和分子生物学研究进展.新消化病学杂志，1994，2∶244-247.
8，程明亮主编.肝纤维化的基础研究及临床.北京∶人民卫生出版社，1996.248-249., 百拇医药
单位：250031 济南军区总医院消化内科
关键词：复方汉防己；成纤维细胞；增殖；凋亡；层粘蛋白
德国医学000111 【摘要】 目的：观察复方汉防己对人成纤维细胞增殖和凋亡及合成层粘蛋白的影响，探讨其抗肝纤维化的机制。方法：采用细胞培养法，于细胞培养液中加入不同浓度的药物，再培养48h，行流式细胞仪检测细胞Fas基因表达，部分细胞涂片进行AgNOR染色，观察AgNOR计数变化，培养上清用放免法测定层粘蛋白含量。结果：正常人成纤维细胞AgNOR计数为2.12±0.50个核，Fas基因表达率为15.42%±6.20%，层粘蛋白含量为1.46±0.47mg/L；加入复方汉防己组AgNOR计数明显下降，Fas表达率增加，培养上清层粘蛋白含量减少。结论：复方汉防己能抑制成纤维细胞的增殖和增加凋亡，使合成层粘蛋白减少，这可能是其抗肝纤维化机理之一。
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Proliferation，apoptosis and laminin synthesis in human fibroblasts affected by fufanghanfangji (Radix stephauiae tetrandrae)
Wang Yaojun,Quan Qizhen,Sun Ziqin,et al.
(Department of Gastroenterology,General Hospital of Jinan Military Region,Jinan 250031)
【Abstract】 Objective:To explore the anti-fibrotic mechanism of Fufanghanfangji,We observed the proliferation,apoptosis and laminin synthesis in fibroblasts affected by Fufanghanfangji.Method:Different dosage of Fufanghanfangji was added in the cultural fibroblasts.AgNOR,the cell proliferative index was showed with silver dye method.Fas gene protein expression which reflected cell apoptosis was assessed by flow cytometry.Laminin was assessed by using radioimmunoassay method.Results:In normal cultural fibroblasts,the AgNOR was 2.12±0.50.Fas gene protein positive rate was 15.42±6.20.And laminin content was 1.46±0.47mg/L.The AgNORcount decreased and Fas postive rate increased in fibroblasts cultured with Fufanghanfangji.And the laminin content in supernate decreased in the cultural cell treated with the drug.Conclusions:Fufanghanfangji can inhibit fibroblasts to proliferate and synthesize extracellular matrix components such as laminin.The drug can also promote cell apoptosis.These may be the anti-fibrotic mechanisms.
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【Key Words】 Fufanghanfangji Fibroblasts AgNOR Apoptosis Laminin Fas
将人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast,HLF)用于肝纤维化的机理及药物疗效的研究已有报道[1]，作者的临床研究结果提示复方汉防己有良好的抗肝纤维化作用[2]，但其机理尚不清楚。本文观察复方汉防己(汉防己，Radix stephauiae tetrandrae)对培养的HLF核仁组成区嗜银蛋白的变化和Fas基因蛋白表达及其合成层粘蛋白(laminin,LN)的影响，观察药物对成纤维细胞增殖和凋亡以及合成细胞外基质成分的影响，探讨其抗肝纤维化机理。
材料与方法
材料 HLF由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，RPMI-1640培养基为Gibco产品。FITC标记的鼠抗人Fas单克隆抗体为Immunotech产品，流式细胞仪FACScan为美国BD公司产品，LN放免试剂盒为海军医学研究所产品。所用中药经山东中医药大学中药鉴定教研究王长墉教授鉴定无伪。自制复方汉防己水提液(汉防己5.0g,丹参2.5g，半枝莲2.5g，虎杖3.75g，黄芪5.0g等制成水提液，使每毫升含生药1g)。
, 百拇医药
方法 细胞培养方法[3]：选择对数期生长的HLF，胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1.2×108/L，分别加入96孔培养板中，每孔1.0ml细胞悬液，分4个浓度组，每个浓度组作6个复孔，置37℃、5%CO2和95%O2的细胞培养箱中孵育24h后，分别加入复方汉防己水提液，使每组药物浓度(生药)分别为0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml，对照组6个孔内加同体积培养，再培养48h，倒置显微镜观察细胞形态后，收集细胞并取上清。
细胞AgNOR银染及计数方法[4，5]：细胞涂片，室温下滴加AgNOR银染工作液(用1%甲酸配制2%明胶，将其与50%硝酸银以1∶2比例混合)于切片上，室温避光1h，蒸镏水冲洗后脱水封固。在油镜下随机计数120个细胞(每一浓度组6张涂片，每张计数20个细胞)核内AgNOR颗粒数，求其均值，即为每组的AgNOR数。
, 百拇医药
表1 不同浓度复方汉防己对HLF AgNOR计数、Fas表达及合成LN的影响(
±s) 复方汉防己浓度(mg/ml)AgNOR(个/核)
FAS %
LN(mg/L)
对照组0
2.12±0.50
15.42±6.20
1.46±0.47
0.25
0.63±0.21**
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46.23±5.59**
0.55±0.28**
0.125
0.95±0.38**
49.34±3.98**
0.57±0.14**
0.0625
1.31±0.47**
34.14±6.72**
0.64±0.29*
0.03125
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23.51±6.41
0.87±0.30*
与对照组相比*P<0.05 **P<0.01
Fas基因表达检测方法：细胞用70%乙醇固定，调整细胞数为109/ml,分2管，每管加20μl细胞悬液，其中一管加鼠抗人Fas-FITC标记抗体，另一管加羊抗鼠IgG1-FITC作阴性对照。室温避光30min，上机待测。流式细胞仪检测：上机前用标准荧光微球调整仪器，使变异系数在2.0%以内。上机后收集1000个细胞，荧光强度以对数放大。光散射数据存软盘。测试完后在Macintosh650型计算机上用Cell Quest Plot软件(BD公司产)分析数据，由HP1200c/ps打印结果。Fas基因表达值用
±s表示。, 百拇医药
LN测定：采用放免法，严格按试剂盒要求操作。
统计学：采用F检验。
结 果
正常培养条件下成纤维细胞AgNOR计数为2.12±0.50个/核，Fas基因表达率为15.42%±6.20%，LN为1.46±0.47mg/L，复方汉防己培养的成纤维细胞AgNOR计数减少，Fas表达阳性率增加，合成LN能力受到抑制(见表1)。
讨 论
肝纤维化过程中成纤维细胞起着极其重要的作用，多数学者认为肝储脂细胞也是限定于特殊组织结构即肝窦周间隙的成纤维细胞[6]。目前成纤维细胞成为肝纤维化细胞学研究的热点。核仁组成区嗜银蛋白是位于人类第13、14、15、21及22号染色体短臂上的一些特殊区域，其中包含着编码为rRNA的基因。AgNOR计数的多少主要取决于转录的活性水平，因此AgNOR是核增殖活性的一个指标。本文结果显示复方汉防己能抑制成纤维细胞AgNOR计数，提示它能抑制成纤维细胞的增殖活性。其抑制作用随浓度增加而增强。
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细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，是一种生理性细胞自杀现象，其生理功能在于维持细胞正常数量在组织和器官中的生长与死亡之间的动态平衡。凋亡与细胞增殖是保持肌体相对稳定的对立统一体，它们共同决定组织器官的增生与退化。Fas基因蛋白是新发现的一种凋亡信息的细胞表面蛋白，它位于人类第10号染色体上臂，含在235个氨基酸，Fas基因蛋白表达的消长能够反映细胞凋亡的程度。本文结果提示复方汉防己能促进人成纤维细胞的凋亡。
LN是肝纤维化的重要的细胞外基质，在肝纤维化或肝硬化早期即明显升高，它主要来自于成纤维细胞[7]。复方汉防己能显著抑制LN的合成。
中医认为肝纤维化和肝硬化多属于血淤，但还有湿热、肝郁、脾虚、阴虚4个基本证型，肝硬化时同时存在气滞、湿遏、热蕴、痰阻表现者也很多，故单味中药难以起到全面效果，只有依赖于中药复方制剂[8]。动物实验及临床研究结果显示，汉防己提取物汉防己甲素具有抑制肝组织成纤维细胞增殖和转化，从而减轻肝组织细胞外基质和防治肝纤维化，丹参可改善肝脏微循环，抗脂质过氧化，增强网状内皮系统吞噬功能，促进肝再生和抗肝纤维化作用。黄芪则具有良好的免疫促进作用和抗肝纤维化作用。我们以汉防己、丹参、黄芪等组成活血化淤、软坚散结方治疗肝硬化取得良好疗效，但机理尚不清楚。本文结果提示复方汉防己能抑制人成纤维细胞的增殖活性、促进其凋亡并抑制合成细胞外基质成分如LN的能力，从而防治肝纤维化。这可能是复方汉防己抗肝纤维化的机理之一。
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参考文献
1，刘海林.桂利嗪、尼卡地平对人成纤维细胞胶原合成的影响.中国药理学通报，1994，10∶308-310.
2，王要军.活血化淤治疗失代偿期肝硬化的临床疗效及T细胞亚群观察.滨州医学院学报，1996，19∶441-444.
3，齐凤.EGTA、A23187对人成纤维细胞DNA合成的影响.上海第二医科大学学报，1994，14∶173-174.
4，王要军.良性与恶性疾病胃粘膜活检标本核仁组成区嗜银蛋白的研究.中国冶金工业医学杂志，1996，13∶1-2.
5，崔玉芳.地塞米松对成纤维细胞核仁组成区相关嗜银蛋白增生的抑制作用.中国病理生理杂志，1999，15∶57-59.
6，王要军.储脂细胞与肝纤维化.临床肝胆病杂志，1993，9∶182-183.
7，王要军.肝纤维化的细胞学和分子生物学研究进展.新消化病学杂志，1994，2∶244-247.
8，程明亮主编.肝纤维化的基础研究及临床.北京∶人民卫生出版社，1996.248-249., 百拇医药