一氧化氮合酶在门静脉高压大鼠胰腺功能异常中的作用
作者：王天才 谌辉 唐望先 梁扩寰
单位：王天才(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)； 谌辉(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)； 唐望先(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)； 梁扩寰(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)
关键词：一氧化氮合酶；门静脉高压；胰腺；动物实验；大鼠
医学新知杂志000102 摘 要：为探讨一氧化氮(Nitric Oxide,NO)在门静脉高压时胰腺功能异常中的可能作用，采用NADPH组织化学法和神经元性一氧化氮合酶(NOS)免疫组化方法，研究正常组、肝硬化组及肝前性门静脉高压组大鼠胰腺组织内NOS的分布。结果显示：NOS主要分布在胰腺的腺泡周围、胰管、血管和胰岛；其中肝硬化组及部分门静脉结扎组大鼠NOS阳性神经纤维较正常组明显增多，染色增强。结果表明一氧化氮合酶在门静脉高压时胰腺功能紊乱中可能具有一定作用。
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Nitric Oxide Synthase Distribution in Pancreas of Hypertensive Rats
Wang Tiancai, Chen Hui, Tang Wangxian, et al
(Department of Internal Medicine, Tongji Hospital,Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract：The aim of this study was to investigate the possible roles of nitric oxide in the functional disorder of cirrhotic pancreas. NADPH-diaphorase histochemical staining and neuronal nitric oxide synthase immunohistochemistry method were used to investigate the distribution of NOS in pancreas of normal, cirrhotic and prehepatic hypertensive rats. NOS was chiefly distributed in the exocrine pancreas close to acini, blood vesels and in islets. NOS-containing nerve fibers were more abundant in distribution and richer in color in pancreas of cirrhotic rats and prehepatic hypertensive rats than those of the control group. NO may play a role in the pancreatic function disorders in portal hypertension.
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Key word：Nitric oxide synthase; Portal hypertension; Pancreas; Animal test; Rats
已有研究发现哺乳动物和人的消化系统各部分包括胃肠道、肝、胆囊及胰腺等组织中均有NOS分布，NO与消化生理及疾病的关系日益受到人们的重视。然而对于门静脉高压时NOS在胰腺的分布及其与胰腺功能异常的关系尚未见报道。本实验采用依赖还原性辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(NADPH-diaphorase,NADPH-d)组化法和神经元性NOS免疫组化法对正常和门静脉高压大鼠胰腺组织NOS的分布进行了研究，旨在探讨NO与门静脉高压时胰腺功能异常的可能关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物 同批SD大鼠22只，雌雄各半，体重200～270 g，由同济医科大学实验动物学部提供。分三组：Ⅰ组为正常对照组(6只)；Ⅱ组为肝硬化组(8只)；Ⅲ组为肝前性门静脉高压组(8只)。肝硬化组皮下注射50%CCl4(四氯化碳)，2 ml/kg，3 d 1次，共计10周，经病理证实肝硬化形成。肝前性门静脉高压组采用部分静脉结扎术制作。麻醉大鼠，在无菌环境下，打开腹腔，游离门静脉，将一结扎线置于门静脉左右分支的汇合处。一尖端钝化的7号针头放在门静脉旁，结扎线绕过针头和静脉结扎，然后移去针头，关上腹腔，术后3周开始实验。
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1.2 标本制备 戊巴比妥纳(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，打开腹腔，对三组大鼠进行门静脉压测定。在胰头部分别切取两块约0.5 cm3的胰腺组织，迅速置于40 ml/L多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.6，温度4℃)中固定25～30 h，于AO恒冷箱内制作连续冰冻切片(厚约25μm)，置于0.01 mol/L(pH7.2)的磷酸缓冲液(PBS)中。
1.3 NADPH组织化学染色 取上述部分切片经0.1 mol/(pH7.6)的PBS液漂洗后，入NADPH孵育液内，在37℃温箱内反应30 min，该孵育成份：
1 mol/L NADPH，0.25 mol/L硝基四唑氮蓝(NBT)，PBS0.1 mol/L(pH7.6)，含2.5 ml/L Tritonx-100，然后将切片转入0.01 mol/L PBS(pH7.4)中停止反应。常规裱片，梯度脱水，透明和封片，光镜观察。
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1.4 神经元性NOS(nNOS)免疫组化染色 将上述部分切片放入3%过氧化氢孵育30 min后用蒸馏水和PBS冲洗， 入0.25%Tritonx-100中30 min，再加入5%～10%正常牛血清在室温下封闭10 min。倾去血清，用PBS冲洗，加入1∶80稀释的一抗(兔抗鼠nNOS)，4℃过夜。第二天滴加生物素标记的二抗(羊抗兔lgG)1∶100稀释，37℃孵育45 min；PBS冲洗后，加入辣根标记的链霉素1∶100稀释，37℃孵育45 min；PBS冲洗，显色剂(DAB)显色。然后蒸馏水充分冲洗，复染，封片。上述一抗、二抗、三抗均由武汉博士得生物工程有限公司提供。
1.5 观测指标 在Olympus光学显微镜下，以目测半定量法初步观察胰腺NOS的分布。NADPH组化染色阳性产物呈蓝色，nNOS免疫组化染色阳性产物呈棕黄色。深蓝色及深棕色为强阳性，蓝色及棕色为阳性，浅蓝色及浅棕色为弱阳性，与背景同色为阴性。用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统进行分析，计算机在面积为1.75X 105μm3固定窗口下，对每个标本随机取10个视野(胰腺的外分泌部)计算NOS阳性反应产物的面积与测量窗口面积的比值(面积比)及阳性反应产物平均灰度值。另外，对每个标本随机取10个胰岛，按同样方法计算面积比及灰度值，并进行各组间的统计学处理。图像分析仪灰度级为0～255，酶着色越深，其灰度值越小。因此，可用面积比及灰度值反映酶反应物的数量和反应的强度。
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2 结果
2.1 门静脉压测定 正常组、肝硬化组及肝前性门静脉高压组的门静脉压分别为17.2±2.8 kPa、32.3±4.1 kPa、33.7±6.2 kPa，后两组之间差异无显著性，但与正常组比较差异均有显著性(P<0.01)。
2.2 NADPH组化染色 胰腺内外分泌部都可见显色为蓝色的NOS阳性神经纤维。在外分泌部主要分布于腺泡周围、小叶内和小叶间的纤维连接组织，胰管也可见阳性着色。而内分泌部主要分布在胰岛，其间也可见阳性神经纤维，末梢及少量胞体呈蓝色或深蓝色。胰腺内动、静脉壁也呈阳性反应。
2.3 nNOS免疫组化染色 染色主要在胰腺外分泌部的腺泡周围、小叶间及血管。这些部位可见棕黄色的阳性神经纤维及胞体，胰岛也可见阳性产物分布。
2.4 正常组、肝硬化组及肝前性门静脉高压组之间的比较 三组大鼠胰腺NOS分布部位基本一致，但后两组胰腺的外分泌部和胰岛阳性产物的分布在数量上多于正常组，染色也较强。图像分析的两个参数(面积比值及平均灰度值)可定量反映各组间NOS分布的不同(表1)。
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表1 三组大鼠胰腺NOS分布的图像定量分析/
±s
组 别
外 分 泌 部
胰 岛
面 积 比
灰 度
面 积 比
灰 度
Ⅰ组
0.440±0.018
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136.000±0.848
1.297±0.132
163.800±0.988
Ⅱ组
0.920±0.048△
157.033±1.095△
2.630±0.222△
152.150±2.759△
Ⅲ组
1.078±0.092△*
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160.600±1.954△*
3.010±0.102△*
153.133±2.214△*
与Ⅰ组比较△P<0.05，与Ⅱ组比较*P<0.05。
3 讨论
大量研究证实，NO不仅是一种血管舒张因子，而且是一种消化系统神经递质。NO是由NOS介导L-精氨酸合成，以激活鸟苷酸环化酶(cGMP)的形式发挥作用。目前已知有二种NO合酶，一种为结构型，存在于神经元和血管内皮，另一种为诱导型，存在于巨噬细胞、中性粒细胞、肝细胞中。Hope等[1]研究认为NADPH黄递酶就是结构型NOS，故可直接用NADPH等染色来研究结构型NOS的分布。本实验发现NADPH黄递酶染色与nNOS免疫组化染色阳性显像的分布一致，支持上述观点。
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研究表明，某些动物胰腺内外分泌部都有NOS阳性神经纤维分布[2]。本实验通过NADPH染色及nNOS免疫组化染色方法，发现NOS主要分布在胰腺腺泡周围、小间纤维连接组织、胰管、血管壁及胰岛。所以对胰腺内分泌和外分泌，NO都显示有调节作用，其机制尚不清楚。有人认为NO对胰腺分泌的调节起双重作用。当给予NOS抑制剂L-NAME阻断NO合成时，可抑制胰腺基础分泌，此抑制效应可部分为L-精氨酸逆转[3]。如给予过量的铃蟾肽刺激则能启动NO介导的分泌抑制状态[4]。NO对胰腺内分泌的调节，目前认为是通过调节cGMP水平和D-葡萄糖阈值来影响胰岛素生物合成和释放。但在某些情况下NO活性过强可引起细胞破坏而导致糖尿病。
近年来普遍认为，门静脉高压时，循环中内源性NO合成增强，参与了门脉高压血流动力学紊乱及多种并发症的发生[5]。本实验发现，门静脉高压时NOS在胰腺的分布较正常组增多，染色增强。NOS阳性纤维成份的异常增多，就使得NO合成增强。在临床和动物实验中，我们可观察到肝硬化门静脉高压时，胰腺分泌功能障碍，易诱发糖尿病发生，考虑与肝硬化时生物体内NO大量合成有一定关系。
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本实验从形态学角度发现门静脉高压时胰腺NOS活性增强，但关于NO机制与胰腺分泌的关系有待于进一步研究。
作者简介：王天才，男，58岁，教授；武汉，同济医科大学同济医院消化内科(430030)
参考文献：
1 Hope B T, Michael G J, Knigge L M, et al. Neuronal NADPH-diaphorase is a nitric oxide synthase. Proc Natl Sci USA, 1991, 88(7):2811
2 Shimosegawa T, Abe T, Satol A, et al. NADPH-
diaphorase activity in neurons of mammalian pancreas: Co-expression with vasoactive intestinal polypeptide. Gastroenterology, 1993, 105(4):999
, 百拇医药
3 Konturek S J, Szlachcic A, Dembinski A, et al. Nitric oxide in pancreatic secretion and hormone-induced pancreatitis in rats. Int J Pancreatol, 1994, 15(1):19
4 Molero X, Guarner F, Salas A, et al. Nitric oxide mo-
dulates pancreatic basal secretion and response to cerulin in the rat: effects in acute pancreatitis. Gastroentero-
logy, 1995, 108(6):1855
5 Pizcueta M P, Pique J M, Bosch J, et al. Effects of inhibiting nitric oxide biosynthesis on the systemic and splanchnic circulation of rats with portal hypertension. Br J Pharmacol, 1992, 105(1):184
收稿日期：1999-01-18, 百拇医药
单位：王天才(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)； 谌辉(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)； 唐望先(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)； 梁扩寰(同济医科大学同济医院消化内科 武汉 430030)
关键词：一氧化氮合酶；门静脉高压；胰腺；动物实验；大鼠
医学新知杂志000102 摘 要：为探讨一氧化氮(Nitric Oxide,NO)在门静脉高压时胰腺功能异常中的可能作用，采用NADPH组织化学法和神经元性一氧化氮合酶(NOS)免疫组化方法，研究正常组、肝硬化组及肝前性门静脉高压组大鼠胰腺组织内NOS的分布。结果显示：NOS主要分布在胰腺的腺泡周围、胰管、血管和胰岛；其中肝硬化组及部分门静脉结扎组大鼠NOS阳性神经纤维较正常组明显增多，染色增强。结果表明一氧化氮合酶在门静脉高压时胰腺功能紊乱中可能具有一定作用。
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Nitric Oxide Synthase Distribution in Pancreas of Hypertensive Rats
Wang Tiancai, Chen Hui, Tang Wangxian, et al
(Department of Internal Medicine, Tongji Hospital,Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract：The aim of this study was to investigate the possible roles of nitric oxide in the functional disorder of cirrhotic pancreas. NADPH-diaphorase histochemical staining and neuronal nitric oxide synthase immunohistochemistry method were used to investigate the distribution of NOS in pancreas of normal, cirrhotic and prehepatic hypertensive rats. NOS was chiefly distributed in the exocrine pancreas close to acini, blood vesels and in islets. NOS-containing nerve fibers were more abundant in distribution and richer in color in pancreas of cirrhotic rats and prehepatic hypertensive rats than those of the control group. NO may play a role in the pancreatic function disorders in portal hypertension.
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Key word：Nitric oxide synthase; Portal hypertension; Pancreas; Animal test; Rats
已有研究发现哺乳动物和人的消化系统各部分包括胃肠道、肝、胆囊及胰腺等组织中均有NOS分布，NO与消化生理及疾病的关系日益受到人们的重视。然而对于门静脉高压时NOS在胰腺的分布及其与胰腺功能异常的关系尚未见报道。本实验采用依赖还原性辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(NADPH-diaphorase,NADPH-d)组化法和神经元性NOS免疫组化法对正常和门静脉高压大鼠胰腺组织NOS的分布进行了研究，旨在探讨NO与门静脉高压时胰腺功能异常的可能关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物 同批SD大鼠22只，雌雄各半，体重200～270 g，由同济医科大学实验动物学部提供。分三组：Ⅰ组为正常对照组(6只)；Ⅱ组为肝硬化组(8只)；Ⅲ组为肝前性门静脉高压组(8只)。肝硬化组皮下注射50%CCl4(四氯化碳)，2 ml/kg，3 d 1次，共计10周，经病理证实肝硬化形成。肝前性门静脉高压组采用部分静脉结扎术制作。麻醉大鼠，在无菌环境下，打开腹腔，游离门静脉，将一结扎线置于门静脉左右分支的汇合处。一尖端钝化的7号针头放在门静脉旁，结扎线绕过针头和静脉结扎，然后移去针头，关上腹腔，术后3周开始实验。
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1.2 标本制备 戊巴比妥纳(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，打开腹腔，对三组大鼠进行门静脉压测定。在胰头部分别切取两块约0.5 cm3的胰腺组织，迅速置于40 ml/L多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.6，温度4℃)中固定25～30 h，于AO恒冷箱内制作连续冰冻切片(厚约25μm)，置于0.01 mol/L(pH7.2)的磷酸缓冲液(PBS)中。
1.3 NADPH组织化学染色 取上述部分切片经0.1 mol/(pH7.6)的PBS液漂洗后，入NADPH孵育液内，在37℃温箱内反应30 min，该孵育成份：
1 mol/L NADPH，0.25 mol/L硝基四唑氮蓝(NBT)，PBS0.1 mol/L(pH7.6)，含2.5 ml/L Tritonx-100，然后将切片转入0.01 mol/L PBS(pH7.4)中停止反应。常规裱片，梯度脱水，透明和封片，光镜观察。
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1.4 神经元性NOS(nNOS)免疫组化染色 将上述部分切片放入3%过氧化氢孵育30 min后用蒸馏水和PBS冲洗， 入0.25%Tritonx-100中30 min，再加入5%～10%正常牛血清在室温下封闭10 min。倾去血清，用PBS冲洗，加入1∶80稀释的一抗(兔抗鼠nNOS)，4℃过夜。第二天滴加生物素标记的二抗(羊抗兔lgG)1∶100稀释，37℃孵育45 min；PBS冲洗后，加入辣根标记的链霉素1∶100稀释，37℃孵育45 min；PBS冲洗，显色剂(DAB)显色。然后蒸馏水充分冲洗，复染，封片。上述一抗、二抗、三抗均由武汉博士得生物工程有限公司提供。
1.5 观测指标 在Olympus光学显微镜下，以目测半定量法初步观察胰腺NOS的分布。NADPH组化染色阳性产物呈蓝色，nNOS免疫组化染色阳性产物呈棕黄色。深蓝色及深棕色为强阳性，蓝色及棕色为阳性，浅蓝色及浅棕色为弱阳性，与背景同色为阴性。用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统进行分析，计算机在面积为1.75X 105μm3固定窗口下，对每个标本随机取10个视野(胰腺的外分泌部)计算NOS阳性反应产物的面积与测量窗口面积的比值(面积比)及阳性反应产物平均灰度值。另外，对每个标本随机取10个胰岛，按同样方法计算面积比及灰度值，并进行各组间的统计学处理。图像分析仪灰度级为0～255，酶着色越深，其灰度值越小。因此，可用面积比及灰度值反映酶反应物的数量和反应的强度。
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2 结果
2.1 门静脉压测定 正常组、肝硬化组及肝前性门静脉高压组的门静脉压分别为17.2±2.8 kPa、32.3±4.1 kPa、33.7±6.2 kPa，后两组之间差异无显著性，但与正常组比较差异均有显著性(P<0.01)。
2.2 NADPH组化染色 胰腺内外分泌部都可见显色为蓝色的NOS阳性神经纤维。在外分泌部主要分布于腺泡周围、小叶内和小叶间的纤维连接组织，胰管也可见阳性着色。而内分泌部主要分布在胰岛，其间也可见阳性神经纤维，末梢及少量胞体呈蓝色或深蓝色。胰腺内动、静脉壁也呈阳性反应。
2.3 nNOS免疫组化染色 染色主要在胰腺外分泌部的腺泡周围、小叶间及血管。这些部位可见棕黄色的阳性神经纤维及胞体，胰岛也可见阳性产物分布。
2.4 正常组、肝硬化组及肝前性门静脉高压组之间的比较 三组大鼠胰腺NOS分布部位基本一致，但后两组胰腺的外分泌部和胰岛阳性产物的分布在数量上多于正常组，染色也较强。图像分析的两个参数(面积比值及平均灰度值)可定量反映各组间NOS分布的不同(表1)。
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表1 三组大鼠胰腺NOS分布的图像定量分析/
±s组 别
外 分 泌 部
胰 岛
面 积 比
灰 度
面 积 比
灰 度
Ⅰ组
0.440±0.018
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136.000±0.848
1.297±0.132
163.800±0.988
Ⅱ组
0.920±0.048△
157.033±1.095△
2.630±0.222△
152.150±2.759△
Ⅲ组
1.078±0.092△*
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160.600±1.954△*
3.010±0.102△*
153.133±2.214△*
与Ⅰ组比较△P<0.05，与Ⅱ组比较*P<0.05。
3 讨论
大量研究证实，NO不仅是一种血管舒张因子，而且是一种消化系统神经递质。NO是由NOS介导L-精氨酸合成，以激活鸟苷酸环化酶(cGMP)的形式发挥作用。目前已知有二种NO合酶，一种为结构型，存在于神经元和血管内皮，另一种为诱导型，存在于巨噬细胞、中性粒细胞、肝细胞中。Hope等[1]研究认为NADPH黄递酶就是结构型NOS，故可直接用NADPH等染色来研究结构型NOS的分布。本实验发现NADPH黄递酶染色与nNOS免疫组化染色阳性显像的分布一致，支持上述观点。
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研究表明，某些动物胰腺内外分泌部都有NOS阳性神经纤维分布[2]。本实验通过NADPH染色及nNOS免疫组化染色方法，发现NOS主要分布在胰腺腺泡周围、小间纤维连接组织、胰管、血管壁及胰岛。所以对胰腺内分泌和外分泌，NO都显示有调节作用，其机制尚不清楚。有人认为NO对胰腺分泌的调节起双重作用。当给予NOS抑制剂L-NAME阻断NO合成时，可抑制胰腺基础分泌，此抑制效应可部分为L-精氨酸逆转[3]。如给予过量的铃蟾肽刺激则能启动NO介导的分泌抑制状态[4]。NO对胰腺内分泌的调节，目前认为是通过调节cGMP水平和D-葡萄糖阈值来影响胰岛素生物合成和释放。但在某些情况下NO活性过强可引起细胞破坏而导致糖尿病。
近年来普遍认为，门静脉高压时，循环中内源性NO合成增强，参与了门脉高压血流动力学紊乱及多种并发症的发生[5]。本实验发现，门静脉高压时NOS在胰腺的分布较正常组增多，染色增强。NOS阳性纤维成份的异常增多，就使得NO合成增强。在临床和动物实验中，我们可观察到肝硬化门静脉高压时，胰腺分泌功能障碍，易诱发糖尿病发生，考虑与肝硬化时生物体内NO大量合成有一定关系。
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本实验从形态学角度发现门静脉高压时胰腺NOS活性增强，但关于NO机制与胰腺分泌的关系有待于进一步研究。
作者简介：王天才，男，58岁，教授；武汉，同济医科大学同济医院消化内科(430030)
参考文献：
1 Hope B T, Michael G J, Knigge L M, et al. Neuronal NADPH-diaphorase is a nitric oxide synthase. Proc Natl Sci USA, 1991, 88(7):2811
2 Shimosegawa T, Abe T, Satol A, et al. NADPH-
diaphorase activity in neurons of mammalian pancreas: Co-expression with vasoactive intestinal polypeptide. Gastroenterology, 1993, 105(4):999
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4 Molero X, Guarner F, Salas A, et al. Nitric oxide mo-
dulates pancreatic basal secretion and response to cerulin in the rat: effects in acute pancreatitis. Gastroentero-
logy, 1995, 108(6):1855
5 Pizcueta M P, Pique J M, Bosch J, et al. Effects of inhibiting nitric oxide biosynthesis on the systemic and splanchnic circulation of rats with portal hypertension. Br J Pharmacol, 1992, 105(1):184
收稿日期：1999-01-18, 百拇医药