原发性膀胱移行细胞癌中P16基因缺失与突变及临床意义
作者：邓远忠 谯体义 张科 胥飚
单位：重庆医科大学附属第一医院 400016
关键词：膀胱肿瘤 癌 P16基因 银染PCR-SSCP
重庆医学000104
摘 要：目的：为探讨P16基因的改变与膀胱移行细胞癌生物学行为的关系。方法：采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，对40例膀胱移行细胞癌组织P16基因纯合缺失、突变进行了研究。结果：膀胱移行细胞癌中P16纯合缺失与突变率在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿癌中分别为7.1%、18.8%、60%。在Tis～T1期和T2～T4期分别为5.6%及40.9%且与肿瘤细胞的分化程度、临床分期明显相关。结论：P16基因异常可能在膀胱移行细胞癌的发生发展中起作用。
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Homozygous Deletions and Mutations of P16 Gene in Transitional Cell Carcinoma of Bladder and Their Clinical Significance.
Deng Yuanzhong,Qiao Tiyi,Zhang Ke,et al.
(Department of Urology,The College of Clinical Medicine,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing,400016.)
Abstract：Objective: To elucidate the relationship between the alteration of P16 gene and the biological behavior of transitional cell carcinoma of bladder.Methods:The deletions and mutations of P16 gene in 40 cases of transitional cell caricinoma of bladder were studied by using PCR-SSCP. Results:The deletion and mutation rate of P16 gene in grade Ⅰ、Ⅱ and Ⅲtumors were 7.1%,18.8% and 60% respectively and in stage Tis～T1 and T2～T4tumors being 5.6% and 40.9%,which was markedly assosiated with the differentiation and clinical stage of the tumor.Conclusions:The alteration of P16 gene were likely to play an important role in the tumorigenisis and progression of transitional cell carcinoma of bladder.
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Kew words:bladder neoplasms Carcinoma P16 gene Silver-staining PCR-SSCP
原癌基因的激活和抑癌基因的失活，是近年来肿瘤分子生物学研究的热点，尤其是抑癌基因在参与细胞周期调控，维护细胞正常增殖方面起重要作用而倍受重视。因其突变、缺失可引起抑癌基因失活，致细胞周围调节失控，从而导致细胞异常增殖而癌变。继P53和Rb基因之后，1994年发现P16基因亦为一个直接参与细胞周期调控的一种抑癌基因，因它与多种人类肿瘤的发生、发展有关而受到高度重视。为研究P16基因在膀胱移行细胞癌发生发展中的临床意义，本研究采用银染PCR-SSCP检测了40例中国人膀胱移行细胞癌及40例相应癌旁组织标本中P16基因外显子1、外显子2的缺失及突变情况，以探讨P16基因缺失及突变与膀胱移行细胞癌的恶性程度、临床分期的关系。
1.材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 标本：收集我院泌尿外科1997～1998年手术切除标本，经病理检查证实为膀胱移行细胞癌者40例，其中男性28例，女性12例；年龄31～76.9岁，平均61.9岁；术后立即从癌块和癌旁组织中分别提取DNA。肿瘤分期按UICC-TNM标准，分为Tis～T1期共18例，T2～T4期22例；病理分级按WHO方法，Ⅰ级14例、Ⅱ级16例、Ⅲ级10例，淋巴结转移情况：N031例，N19例。
1.1.2 试剂：TaqNDA聚合酶、dNTPS、丙烯酰胺购自华美生物工程公司，蛋白酶K购自Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取：按常规方法将术中切除组织块碾碎，经蛋白酶K的消化，酚、氯仿抽提、乙醇沉淀、TE溶解后，经紫外分光光度计检测其浓度及纯度。OD260mm/OD280nm比值在1.8～1.9之间。
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1.2.2 PCR：本实验选用扩增P16基因外显子1、外显子2的三对引物(其中外显子2为两对引物)和作为内对照的β-肌动蛋白(β-actin)基因的1对引物，引物均于北京赛百盛生物工程公司合成并纯化，P16基因及β-actin)基因引物序列见表1，引物扩增片段的大小及相应部位见图1。
表1 P16基因及β-actin基因引物序列 外显子
引物序列
片段大小(bp)
P161A
5′
TCT GCG GAG AGG GGG AGA GCA G 3′
280
, 百拇医药
P161B
5′
GCG CTA CCT GAT TCC AAG TC 3′
P162A
5′
ACA AGC TTC CTT TCC GTC ATG CCG 3′
244
P162C
5′
CCA GGC ATC GCT CAC GTC CA 3′
P162B
, 百拇医药
5′
TTC CTG GAC ACG CTG GTG GT 3′
240
P162D
5′
TCT GAG CTT TGG AAG CTC TCA 3′
β-actin
A5′
CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C 3′
589
β-actin
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B5′
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C 3′
图1 筛查P16基因外显子1、外显子2缺失和突变所用引
物的相应部位及扩增片段大小示意图
25μι反应体系中，含模板DNA量5ng，Mg++1.5mM，TaqDNA聚合酶1μ、dNTPS0.2mmol、P16基因上、下游引物均为30pmol、β-actin上、下游引物各为20pmol。反应在PE公司PE-9600型基因扩增仪上进行。98℃变性5分钟后，加入TaqDNA聚合酶1μ，94℃变性45秒、52℃复性45秒、72℃延伸1分钟、循环40次，最后72℃延伸5分钟终止反应。
, 百拇医药
取10μlPCR产物直接经2%琼脂糖凝胶电泳、EB染色，电压100伏，电泳30分钟，紫外灯下观察结果并拍照。
图2 3例TCCB组织P16基因纯合缺失的PCR检测结果
E1、E2、E2b分别代表：外显子1、外显子2a、外显子2b
M表示Marker，标本1、2、3分别示外显子1、外显子2a、外显子2b纯合缺失
1.2.3 SSCP和银染：取10μlP16基因PCR产物与10μl变性剂(95%甲酰胺10mo1/L、10mo1/LEDTA、0.05%溴酚蓝)混合，沸水浴5分钟后，立即置于冰水浴中5分钟后上样，行非变性聚丙烯酰凝胶电泳。丙烯酰胺浓度为8%，交联剂浓度为2%，电压100伏，0.5×TBE缓冲液，80℃下电泳4小时。
, 百拇医药
图3 TCCB外显子1的PCR检测结果
图中示5、7号标本中外显子1纯合缺失
取胶，在10%乙酸浸泡固定20分钟，硝酸银染液染胶20分钟，去离子水洗20～30秒后放入显影液，显色5～15分钟，直到条带清晰可见，最后用10%乙酸固定5分钟，观察结果，照相。对发现有SSCP改变的样品，重复PCR-SSCP1～2次，以排除假阳性结果。
图4 TCCB外显子2的PCR检测结果
图中示2、6、7号标本外显子2a纯合缺失
1.2.4 统计学分析：用x2检验及确切概率计算法进行两组数据差异间的显著性比较。
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图5 P16基因外显子2a的PCR-SSCP分析
T：TCCB DNA N：癌旁正常组织DNA
图中T1、T2、T3标本中出现外显子2a的异常移动电泳带，提示有点突变
2.结 果
2.1 膀胱移行细胞癌P16基因外显子1、外显子2片段纯合缺失的确定。
经PCR扩增后，在40例癌旁正常组织中均观察到280bp、244bp、240bp及589bp的扩增产物，而膀胱移行细胞癌中，未见280bp2例、244bp3例、240bp2例，而上述7例标本均有589bp特异扩增带，从而确定该7例肿瘤组织中存在P16基因外显子1、外显子2共3个目的基因扩增片段的丢失或引物位置小片段的缺失。
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2.2 膀胱移行细胞癌P16基因外显子1、外显子2突变的SSCP分析。
在外显子1、外显子2a、外显子2b共三个目的因基扩增片段中，经PCR-SSCP技术，仅在外显子2a片段中检测到3例出现异常移行电泳带，而相应3例癌旁正常组织外显子2a未出现异常移动电泳带，故判断这3例为点突变。
2.3 P16在各级肿瘤间的纯合缺失与突变及比较。
本组病例中，P16基因在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤纯合缺失与突变，分别为1、3、6例，纯合缺失与突变率分别为7.1%、18.8%、60%，Ⅰ级肿瘤与Ⅲ级肿瘤比较差异不显著(P>0.05)。而Ⅰ级肿瘤与Ⅲ级肿瘤比较和Ⅱ级肿瘤与Ⅲ级肿瘤比较差异显著(P<0.05)。
2.4 P16基因纯合缺失与突变在各期肿瘤间的比较。
P16基因纯合缺失与突变率在Tis～T1期为5.6%，在T2～T4期为40.9%，Tis～T1期肿瘤与T2～T4期肿瘤相比差异显著，P<0.05。
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2.5 有、无淋巴结转移两组间P16基因缺失和突变的比较。
无淋巴结转移的肿瘤中，P16基因缺失与突变率为16.1%(5/31)，而有淋巴结转移肿瘤中，P16基因缺失与突变率为56%(5/9)，两组间相比差异显著，P<0.05。
3.讨 论
P16基因定位于人类第9号染色体短臂(9P21)上，全长8.5Kb，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子编码一个分子量为16KD的蛋白即P16蛋白。P16蛋白的生物学功能是与CyclinD竞争性地结合CDK4；与CDK4形成1：1的二聚体，抑制CDK4的催化活性，使CDK4失去对PRb蛋白磷酸化作用，阻滞细胞从G1→S期，使细胞生长分裂停滞[1，2]，已证实P16基因的失活与许多肿瘤的发生、发展有密切关系[3]。P16基因在多种肿瘤标本及细胞系中均有改变，改变形式有缺失、突变、重排及甲基化。P16基因最容易发生纯合缺失，且是其失活的主要方式。非浸润型或早期肿瘤P16基因纯合缺失及突变率明显低于浸润型或晚期肿瘤及有淋巴结转移的膀胱癌，表明P16纯合缺失与突变率与膀胱癌的发生、发展密切相关。
本研究中还发现有75%的膀胱移行细胞癌未发现有P16基因缺失与突变，国外的许多实验亦观察到这种现象。其原因可能有：(1)正常组织细胞的沾染；(2)P16基因5′CPG岛异常甲基化；(3)可能与有其它抑癌基因在9P21位点上有关。
总之，P16基因缺失与突变与膀胱移行细胞癌的病理分级和临床分期密切相关，可以作为判定膀胱肿瘤恶性程度及预后的重要指标之一。, 百拇医药
单位：重庆医科大学附属第一医院 400016
关键词：膀胱肿瘤 癌 P16基因 银染PCR-SSCP
重庆医学000104
摘 要：目的：为探讨P16基因的改变与膀胱移行细胞癌生物学行为的关系。方法：采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，对40例膀胱移行细胞癌组织P16基因纯合缺失、突变进行了研究。结果：膀胱移行细胞癌中P16纯合缺失与突变率在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿癌中分别为7.1%、18.8%、60%。在Tis～T1期和T2～T4期分别为5.6%及40.9%且与肿瘤细胞的分化程度、临床分期明显相关。结论：P16基因异常可能在膀胱移行细胞癌的发生发展中起作用。
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Homozygous Deletions and Mutations of P16 Gene in Transitional Cell Carcinoma of Bladder and Their Clinical Significance.
Deng Yuanzhong,Qiao Tiyi,Zhang Ke,et al.
(Department of Urology,The College of Clinical Medicine,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing,400016.)
Abstract：Objective: To elucidate the relationship between the alteration of P16 gene and the biological behavior of transitional cell carcinoma of bladder.Methods:The deletions and mutations of P16 gene in 40 cases of transitional cell caricinoma of bladder were studied by using PCR-SSCP. Results:The deletion and mutation rate of P16 gene in grade Ⅰ、Ⅱ and Ⅲtumors were 7.1%,18.8% and 60% respectively and in stage Tis～T1 and T2～T4tumors being 5.6% and 40.9%,which was markedly assosiated with the differentiation and clinical stage of the tumor.Conclusions:The alteration of P16 gene were likely to play an important role in the tumorigenisis and progression of transitional cell carcinoma of bladder.
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原癌基因的激活和抑癌基因的失活，是近年来肿瘤分子生物学研究的热点，尤其是抑癌基因在参与细胞周期调控，维护细胞正常增殖方面起重要作用而倍受重视。因其突变、缺失可引起抑癌基因失活，致细胞周围调节失控，从而导致细胞异常增殖而癌变。继P53和Rb基因之后，1994年发现P16基因亦为一个直接参与细胞周期调控的一种抑癌基因，因它与多种人类肿瘤的发生、发展有关而受到高度重视。为研究P16基因在膀胱移行细胞癌发生发展中的临床意义，本研究采用银染PCR-SSCP检测了40例中国人膀胱移行细胞癌及40例相应癌旁组织标本中P16基因外显子1、外显子2的缺失及突变情况，以探讨P16基因缺失及突变与膀胱移行细胞癌的恶性程度、临床分期的关系。
1.材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 标本：收集我院泌尿外科1997～1998年手术切除标本，经病理检查证实为膀胱移行细胞癌者40例，其中男性28例，女性12例；年龄31～76.9岁，平均61.9岁；术后立即从癌块和癌旁组织中分别提取DNA。肿瘤分期按UICC-TNM标准，分为Tis～T1期共18例，T2～T4期22例；病理分级按WHO方法，Ⅰ级14例、Ⅱ级16例、Ⅲ级10例，淋巴结转移情况：N031例，N19例。
1.1.2 试剂：TaqNDA聚合酶、dNTPS、丙烯酰胺购自华美生物工程公司，蛋白酶K购自Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取：按常规方法将术中切除组织块碾碎，经蛋白酶K的消化，酚、氯仿抽提、乙醇沉淀、TE溶解后，经紫外分光光度计检测其浓度及纯度。OD260mm/OD280nm比值在1.8～1.9之间。
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1.2.2 PCR：本实验选用扩增P16基因外显子1、外显子2的三对引物(其中外显子2为两对引物)和作为内对照的β-肌动蛋白(β-actin)基因的1对引物，引物均于北京赛百盛生物工程公司合成并纯化，P16基因及β-actin)基因引物序列见表1，引物扩增片段的大小及相应部位见图1。
表1 P16基因及β-actin基因引物序列 外显子
引物序列
片段大小(bp)
P161A
5′
TCT GCG GAG AGG GGG AGA GCA G 3′
280
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P161B
5′
GCG CTA CCT GAT TCC AAG TC 3′
P162A
5′
ACA AGC TTC CTT TCC GTC ATG CCG 3′
244
P162C
5′
CCA GGC ATC GCT CAC GTC CA 3′
P162B
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5′
TTC CTG GAC ACG CTG GTG GT 3′
240
P162D
5′
TCT GAG CTT TGG AAG CTC TCA 3′
β-actin
A5′
CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C 3′
589
β-actin
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B5′
AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C 3′
图1 筛查P16基因外显子1、外显子2缺失和突变所用引
物的相应部位及扩增片段大小示意图
25μι反应体系中，含模板DNA量5ng，Mg++1.5mM，TaqDNA聚合酶1μ、dNTPS0.2mmol、P16基因上、下游引物均为30pmol、β-actin上、下游引物各为20pmol。反应在PE公司PE-9600型基因扩增仪上进行。98℃变性5分钟后，加入TaqDNA聚合酶1μ，94℃变性45秒、52℃复性45秒、72℃延伸1分钟、循环40次，最后72℃延伸5分钟终止反应。
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取10μlPCR产物直接经2%琼脂糖凝胶电泳、EB染色，电压100伏，电泳30分钟，紫外灯下观察结果并拍照。
图2 3例TCCB组织P16基因纯合缺失的PCR检测结果
E1、E2、E2b分别代表：外显子1、外显子2a、外显子2b
M表示Marker，标本1、2、3分别示外显子1、外显子2a、外显子2b纯合缺失
1.2.3 SSCP和银染：取10μlP16基因PCR产物与10μl变性剂(95%甲酰胺10mo1/L、10mo1/LEDTA、0.05%溴酚蓝)混合，沸水浴5分钟后，立即置于冰水浴中5分钟后上样，行非变性聚丙烯酰凝胶电泳。丙烯酰胺浓度为8%，交联剂浓度为2%，电压100伏，0.5×TBE缓冲液，80℃下电泳4小时。
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图3 TCCB外显子1的PCR检测结果
图中示5、7号标本中外显子1纯合缺失
取胶，在10%乙酸浸泡固定20分钟，硝酸银染液染胶20分钟，去离子水洗20～30秒后放入显影液，显色5～15分钟，直到条带清晰可见，最后用10%乙酸固定5分钟，观察结果，照相。对发现有SSCP改变的样品，重复PCR-SSCP1～2次，以排除假阳性结果。
图4 TCCB外显子2的PCR检测结果
图中示2、6、7号标本外显子2a纯合缺失
1.2.4 统计学分析：用x2检验及确切概率计算法进行两组数据差异间的显著性比较。
, http://www.100md.com
图5 P16基因外显子2a的PCR-SSCP分析
T：TCCB DNA N：癌旁正常组织DNA
图中T1、T2、T3标本中出现外显子2a的异常移动电泳带，提示有点突变
2.结 果
2.1 膀胱移行细胞癌P16基因外显子1、外显子2片段纯合缺失的确定。
经PCR扩增后，在40例癌旁正常组织中均观察到280bp、244bp、240bp及589bp的扩增产物，而膀胱移行细胞癌中，未见280bp2例、244bp3例、240bp2例，而上述7例标本均有589bp特异扩增带，从而确定该7例肿瘤组织中存在P16基因外显子1、外显子2共3个目的基因扩增片段的丢失或引物位置小片段的缺失。
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2.2 膀胱移行细胞癌P16基因外显子1、外显子2突变的SSCP分析。
在外显子1、外显子2a、外显子2b共三个目的因基扩增片段中，经PCR-SSCP技术，仅在外显子2a片段中检测到3例出现异常移行电泳带，而相应3例癌旁正常组织外显子2a未出现异常移动电泳带，故判断这3例为点突变。
2.3 P16在各级肿瘤间的纯合缺失与突变及比较。
本组病例中，P16基因在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤纯合缺失与突变，分别为1、3、6例，纯合缺失与突变率分别为7.1%、18.8%、60%，Ⅰ级肿瘤与Ⅲ级肿瘤比较差异不显著(P>0.05)。而Ⅰ级肿瘤与Ⅲ级肿瘤比较和Ⅱ级肿瘤与Ⅲ级肿瘤比较差异显著(P<0.05)。
2.4 P16基因纯合缺失与突变在各期肿瘤间的比较。
P16基因纯合缺失与突变率在Tis～T1期为5.6%，在T2～T4期为40.9%，Tis～T1期肿瘤与T2～T4期肿瘤相比差异显著，P<0.05。
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2.5 有、无淋巴结转移两组间P16基因缺失和突变的比较。
无淋巴结转移的肿瘤中，P16基因缺失与突变率为16.1%(5/31)，而有淋巴结转移肿瘤中，P16基因缺失与突变率为56%(5/9)，两组间相比差异显著，P<0.05。
3.讨 论
P16基因定位于人类第9号染色体短臂(9P21)上，全长8.5Kb，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子编码一个分子量为16KD的蛋白即P16蛋白。P16蛋白的生物学功能是与CyclinD竞争性地结合CDK4；与CDK4形成1：1的二聚体，抑制CDK4的催化活性，使CDK4失去对PRb蛋白磷酸化作用，阻滞细胞从G1→S期，使细胞生长分裂停滞[1，2]，已证实P16基因的失活与许多肿瘤的发生、发展有密切关系[3]。P16基因在多种肿瘤标本及细胞系中均有改变，改变形式有缺失、突变、重排及甲基化。P16基因最容易发生纯合缺失，且是其失活的主要方式。非浸润型或早期肿瘤P16基因纯合缺失及突变率明显低于浸润型或晚期肿瘤及有淋巴结转移的膀胱癌，表明P16纯合缺失与突变率与膀胱癌的发生、发展密切相关。
本研究中还发现有75%的膀胱移行细胞癌未发现有P16基因缺失与突变，国外的许多实验亦观察到这种现象。其原因可能有：(1)正常组织细胞的沾染；(2)P16基因5′CPG岛异常甲基化；(3)可能与有其它抑癌基因在9P21位点上有关。
总之，P16基因缺失与突变与膀胱移行细胞癌的病理分级和临床分期密切相关，可以作为判定膀胱肿瘤恶性程度及预后的重要指标之一。, 百拇医药