人类K-562细胞系实验条件的稳定性研究
作者：黄艳红 谢祁阳 蒋德昭 徐有恒
单位：黄艳红(血液生理研究室 长沙 410078)；谢祁阳(血液生理研究室 长沙 410078)；蒋德昭(血液生理研究室 长沙 410078)；徐有恒(血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：K-562细胞*；细胞；培养的；集落形成单位测定；染色体；人
湖南医科大学学报000107 摘 要：对人类CML-K-562细胞系生长状态的测定、集落培养、细胞形态学进行观察及染色体分析。结果表明：所用的K-562细胞系与建系时的报道基本一致，证实本室所用的K562细胞生长状态和有关实验条件均较稳定。
分类号：Q343.6 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0021-02
, 百拇医药
Study on the optimum experimental conditions for the stea dy growth
of human K-562 cell line
HUANG Yan-hong, XIE Qi-yang, JIANG De-zhao, XU You-heng
(Laboratory of Blood Physiology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Abstract：The results of the assays of growth state, semisoli d colony culture, cytomorphological and chromosome analysis for K-562 cell line showed that the cells had the similar biological characteristics with the cells which were originally established. It suggests that the growth state of K-562 cells under the experimental conditions in our laboratory are steady.
, 百拇医药
Key words：cells,cultured;colony forming unit assay;chro mosomes,human; experimental condition▲
慢性髓源性白血病K-562细胞系为Lozzio CB等 人 在1957年建立的人类慢性髓源性白血病细胞系[1]。该细胞系已广泛用作高度未分 化的慢性髓源性白血病实验研究的细胞模型。因其建系时间久远，传代次数较多，故在其传 代过程中，若实验条件不稳定，误被电离辐射或误入一些染色体致断剂，可能导致染色体变 异[2]，使其生物学特征发生改变。另一方面，不同的培养条件也会影响细胞系的 生长和发育。故有必要研究、稳定和优化本室培养情况下K-562细胞系的各种实验条件。
1 材料与方法
1.1 材料 CML-K-562细胞由本校分子生物学研究室提供；RPMI 1640 ，琼脂及Giemsa染料均为美国Sigma公司产品；小牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所 生产；秋水仙素为北京化学制药厂产品；KCl由湖南试剂厂生产；甲醇与冰醋酸为北京化工 厂产品；胰酶系新疆伊犁肉联厂生化制药厂产品。
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1.2 K-562细胞的液体培养 将1×106个K-562细胞接种于10ml含10% 新生牛血清的RPMI 1640培养体系的50ml玻璃培养瓶中，置37℃，5% CO2，饱和湿度的 培养箱培养，每周换液1～3次。
1.3 K-562细胞的集落培养和克隆效率的测定 K-562细胞的集落培养采 用琼脂半固体集落培养法。培养体系中均含10%的小牛血清和0.3%的琼脂，分别含不同浓度 的K-562细胞。将1ml的培养体系接种于直径为30mm的玻璃培养皿中，按不同细胞浓度 分组，每组种3皿。K-562细胞的接种浓度范围为500～5000个.ml-1，置37℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱培养7d后，于倒置显微镜下计数集落。>40个细胞者算一个集 落。
1.4 K-562细胞生长状态的测定 将终浓度为1×104个.ml-1的K -562细胞接种于含10%的新生牛血清的RPMI 1640培养体系中，常规培养条件下培养，连续6 d计数K-562细胞的绝对数，将K-562细胞数输入计算机处理，求得生长曲线和倍增时间 参数。
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1.5 K-562细胞形态学观察 离心收集指数增殖期K-562细胞，经涂片、 干燥、甲醇固定后，Giemsa染色，显微镜下观察K-562细胞形态并分类计数。
1.6 K-562细胞的染色体分析 取液体培养24h的K-562细胞10ml，按 常规染色体制备方法[3]，加终浓度为0.4μg.ml-1的秋水仙素，37℃ 继续培养2h后离心，去上清液，加0.075mol.L-1 KCl低渗处理，以3∶1的甲醇 /冰醋酸固定，制备染色体，胰酶显带，Giemsa染色后油镜下观察。
1.7 统计学分析 结果以
±s表示。数据处理、直线回归和指 数曲线拟合均在计算机上进行。
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2 结 果
2.1 K-562集落生成数与种入细胞浓度的关系 K-562细胞在琼脂半固体 集落培养中，长成大的葡萄串状细胞集落，较大的集落中细胞数多于1000个。接种的K-5 62细胞数为5×103个.ml-1时，克隆效率为(15.64±1.21)%。K-562细胞接种数 为0.5×103个～5×103个.ml-1时，其生成的集落数与接种的细胞数之间呈良 好的线性关系(r=0.978,P<0.01)(图1)。
图1 K-562集落 生成数与种入细胞浓度的关系
Fig. 1 Relationship between colony nu mbers of K-562 cells and inoculated K-562 cells. Each point indicates the mean s±s of three experiments
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2.2 K-562细胞生长的动态观察 K-562细胞种植密度为1×105.ml -1，每周换液1～3次。细胞从换液后的第1～5d呈指数增殖。测得K-562细胞指数增 殖方程为
=36659e0.779X，其倍增时间为30.96h，相关系数r=0. 9991,P<0.01(图2)。
图2 K-562细胞的生长曲线
Fig. 2 Growth curve of K-562 cells. Each point indicates the means±s of three experiments
2.3 K-562细胞形态学观察 呈指数增殖的K-562细胞绝大多数系高度未 分化细胞，形态为圆形或椭圆形，细胞核与细胞浆无明显界限，胞浆为强嗜碱性，缺乏颗粒 ，并含有少数空泡。极少数非典型早幼粒细胞核偏向一侧，胞浆含浅蓝色颗粒，不易找到分 化成熟的细胞。
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2.4 K-562细胞染色体观察 应用染色体显带技术，所测得的K-562细胞 均呈费城染色体(ph′)阳性(图3)。
图3 K-562细胞的染色体 箭头所示为费城(ph ′)染色体
Fig. 3 Chromosomes of a K-562 cell(Th e arrow shows ph′ chromosome)
3 讨 论
K-562细胞系作为未分化的慢性髓源性白血病细胞模型至今仍广泛应用于白血病的研究 [4，5]，其主要特征之一是具有费城染色体(ph′)[1，6]。在长期传代过 程中，若实验条件不稳定，将会引起生物学特征及染色体特征的改变。本室所用的K-562细 胞经检测，均具有典型的费城染色体(ph′)；细胞形态学观察结果绝大部分仍为高度未分化 的髓系细胞。此等结果均与建系时基本一致[1]。在培养的1～5d细胞呈指数生 长，其倍增时间为30.96h；半固体培养的K-562细胞接种浓度为(0.5×103～5×10 3)个.ml-1时，其生成的集落数与接种的细胞数之间呈良好的线性关系；其最佳接种浓度为5×103个.ml-1。上述实验证实本室所用的K-562细胞生长状态和有关的实验条件均较稳定，表明我室所用K-562细胞系与建系时的报道基本一致，仍可用于实验研究。
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基金项目：湖南省科委社会发展科研基金[02-961-06-1(4)]
作者简介：黄艳红(1968-)，女，助理实验师
参考文献：
[1]Lozzio CB, Lozzio BB. Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive philadelphia chromosome[J]. Blood, 1975,45(3):321-334 .
[2]周焕庚.环境因素诱发的染色体变化.见：周焕庚，夏家辉，张思仲，编著.人类染色体[M].北京：科学出版社，1987：350-375.
[3]杨景山.细胞遗传学技术及其应用.见：杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术[M].北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990：345-380.
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[4]钟理，蒋德昭，王绮如.灵芝复方对K-562白血病细胞增殖、分化的影响[J].湖南医科大学学报，1999，24(6)：29-32.
[5]Nagy K, Pasti G, Bene L, et al. Involvement of fenton reaction products in differentiation induction of K-562 human leukemia cells[J]. Leuk Res, 1995,19(3):203-212.
[6]Whang-peng J, Lee EC, Knutsen TA. Genesis of the ph′chromosome[J]. J Nat Cancer Inst, 1974,52(4):1035-1036.
收稿日期：1999-01-29, 百拇医药
单位：黄艳红(血液生理研究室 长沙 410078)；谢祁阳(血液生理研究室 长沙 410078)；蒋德昭(血液生理研究室 长沙 410078)；徐有恒(血液生理研究室 长沙 410078)
关键词：K-562细胞*；细胞；培养的；集落形成单位测定；染色体；人
湖南医科大学学报000107 摘 要：对人类CML-K-562细胞系生长状态的测定、集落培养、细胞形态学进行观察及染色体分析。结果表明：所用的K-562细胞系与建系时的报道基本一致，证实本室所用的K562细胞生长状态和有关实验条件均较稳定。
分类号：Q343.6 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0021-02
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Study on the optimum experimental conditions for the stea dy growth
of human K-562 cell line
HUANG Yan-hong, XIE Qi-yang, JIANG De-zhao, XU You-heng
(Laboratory of Blood Physiology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Abstract：The results of the assays of growth state, semisoli d colony culture, cytomorphological and chromosome analysis for K-562 cell line showed that the cells had the similar biological characteristics with the cells which were originally established. It suggests that the growth state of K-562 cells under the experimental conditions in our laboratory are steady.
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Key words：cells,cultured;colony forming unit assay;chro mosomes,human; experimental condition▲
慢性髓源性白血病K-562细胞系为Lozzio CB等 人 在1957年建立的人类慢性髓源性白血病细胞系[1]。该细胞系已广泛用作高度未分 化的慢性髓源性白血病实验研究的细胞模型。因其建系时间久远，传代次数较多，故在其传 代过程中，若实验条件不稳定，误被电离辐射或误入一些染色体致断剂，可能导致染色体变 异[2]，使其生物学特征发生改变。另一方面，不同的培养条件也会影响细胞系的 生长和发育。故有必要研究、稳定和优化本室培养情况下K-562细胞系的各种实验条件。
1 材料与方法
1.1 材料 CML-K-562细胞由本校分子生物学研究室提供；RPMI 1640 ，琼脂及Giemsa染料均为美国Sigma公司产品；小牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所 生产；秋水仙素为北京化学制药厂产品；KCl由湖南试剂厂生产；甲醇与冰醋酸为北京化工 厂产品；胰酶系新疆伊犁肉联厂生化制药厂产品。
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1.2 K-562细胞的液体培养 将1×106个K-562细胞接种于10ml含10% 新生牛血清的RPMI 1640培养体系的50ml玻璃培养瓶中，置37℃，5% CO2，饱和湿度的 培养箱培养，每周换液1～3次。
1.3 K-562细胞的集落培养和克隆效率的测定 K-562细胞的集落培养采 用琼脂半固体集落培养法。培养体系中均含10%的小牛血清和0.3%的琼脂，分别含不同浓度 的K-562细胞。将1ml的培养体系接种于直径为30mm的玻璃培养皿中，按不同细胞浓度 分组，每组种3皿。K-562细胞的接种浓度范围为500～5000个.ml-1，置37℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱培养7d后，于倒置显微镜下计数集落。>40个细胞者算一个集 落。
1.4 K-562细胞生长状态的测定 将终浓度为1×104个.ml-1的K -562细胞接种于含10%的新生牛血清的RPMI 1640培养体系中，常规培养条件下培养，连续6 d计数K-562细胞的绝对数，将K-562细胞数输入计算机处理，求得生长曲线和倍增时间 参数。
, 百拇医药
1.5 K-562细胞形态学观察 离心收集指数增殖期K-562细胞，经涂片、 干燥、甲醇固定后，Giemsa染色，显微镜下观察K-562细胞形态并分类计数。
1.6 K-562细胞的染色体分析 取液体培养24h的K-562细胞10ml，按 常规染色体制备方法[3]，加终浓度为0.4μg.ml-1的秋水仙素，37℃ 继续培养2h后离心，去上清液，加0.075mol.L-1 KCl低渗处理，以3∶1的甲醇 /冰醋酸固定，制备染色体，胰酶显带，Giemsa染色后油镜下观察。
1.7 统计学分析 结果以
±s表示。数据处理、直线回归和指 数曲线拟合均在计算机上进行。, 百拇医药
2 结 果
2.1 K-562集落生成数与种入细胞浓度的关系 K-562细胞在琼脂半固体 集落培养中，长成大的葡萄串状细胞集落，较大的集落中细胞数多于1000个。接种的K-5 62细胞数为5×103个.ml-1时，克隆效率为(15.64±1.21)%。K-562细胞接种数 为0.5×103个～5×103个.ml-1时，其生成的集落数与接种的细胞数之间呈良 好的线性关系(r=0.978,P<0.01)(图1)。
图1 K-562集落 生成数与种入细胞浓度的关系
Fig. 1 Relationship between colony nu mbers of K-562 cells and inoculated K-562 cells. Each point indicates the mean s±s of three experiments
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2.2 K-562细胞生长的动态观察 K-562细胞种植密度为1×105.ml -1，每周换液1～3次。细胞从换液后的第1～5d呈指数增殖。测得K-562细胞指数增 殖方程为
=36659e0.779X，其倍增时间为30.96h，相关系数r=0. 9991,P<0.01(图2)。图2 K-562细胞的生长曲线
Fig. 2 Growth curve of K-562 cells. Each point indicates the means±s of three experiments
2.3 K-562细胞形态学观察 呈指数增殖的K-562细胞绝大多数系高度未 分化细胞，形态为圆形或椭圆形，细胞核与细胞浆无明显界限，胞浆为强嗜碱性，缺乏颗粒 ，并含有少数空泡。极少数非典型早幼粒细胞核偏向一侧，胞浆含浅蓝色颗粒，不易找到分 化成熟的细胞。
, http://www.100md.com
2.4 K-562细胞染色体观察 应用染色体显带技术，所测得的K-562细胞 均呈费城染色体(ph′)阳性(图3)。
图3 K-562细胞的染色体 箭头所示为费城(ph ′)染色体
Fig. 3 Chromosomes of a K-562 cell(Th e arrow shows ph′ chromosome)
3 讨 论
K-562细胞系作为未分化的慢性髓源性白血病细胞模型至今仍广泛应用于白血病的研究 [4，5]，其主要特征之一是具有费城染色体(ph′)[1，6]。在长期传代过 程中，若实验条件不稳定，将会引起生物学特征及染色体特征的改变。本室所用的K-562细 胞经检测，均具有典型的费城染色体(ph′)；细胞形态学观察结果绝大部分仍为高度未分化 的髓系细胞。此等结果均与建系时基本一致[1]。在培养的1～5d细胞呈指数生 长，其倍增时间为30.96h；半固体培养的K-562细胞接种浓度为(0.5×103～5×10 3)个.ml-1时，其生成的集落数与接种的细胞数之间呈良好的线性关系；其最佳接种浓度为5×103个.ml-1。上述实验证实本室所用的K-562细胞生长状态和有关的实验条件均较稳定，表明我室所用K-562细胞系与建系时的报道基本一致，仍可用于实验研究。
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基金项目：湖南省科委社会发展科研基金[02-961-06-1(4)]
作者简介：黄艳红(1968-)，女，助理实验师
参考文献：
[1]Lozzio CB, Lozzio BB. Human chronic myelogenous leukemia cell line with positive philadelphia chromosome[J]. Blood, 1975,45(3):321-334 .
[2]周焕庚.环境因素诱发的染色体变化.见：周焕庚，夏家辉，张思仲，编著.人类染色体[M].北京：科学出版社，1987：350-375.
[3]杨景山.细胞遗传学技术及其应用.见：杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术[M].北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990：345-380.
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[4]钟理，蒋德昭，王绮如.灵芝复方对K-562白血病细胞增殖、分化的影响[J].湖南医科大学学报，1999，24(6)：29-32.
[5]Nagy K, Pasti G, Bene L, et al. Involvement of fenton reaction products in differentiation induction of K-562 human leukemia cells[J]. Leuk Res, 1995,19(3):203-212.
[6]Whang-peng J, Lee EC, Knutsen TA. Genesis of the ph′chromosome[J]. J Nat Cancer Inst, 1974,52(4):1035-1036.
收稿日期：1999-01-29, 百拇医药