新型重组人肿瘤坏死因子对大鼠肝细胞及小鼠肝组织中钙稳度的影响颜天华 袁伯俊 刘俊平
作者：张淑英 吴浩
单位：袁伯俊(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；刘俊平(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；张淑英(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；吴浩(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；颜天华(南京军医学院药理学教研室，南京 210049)
关键词：肿瘤坏死因子；肝损伤；钙稳度
第二军医大学学报000107 摘 要：目的：研究新型重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-NC)对培养大鼠肝细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)及小鼠肝组织中Ca2+含量的影响。方法：以 Fura-2/AM为Ca2+荧光检测，荧光分光光度法测定培养大鼠肝细胞内[Ca2+]i；原子吸收分光光度法测定小鼠肝组织中Ca2+含量。结果：在加入rhTNF-NC 3 h后，可剂量依赖性地引起培养大鼠肝细胞内[Ca2+]i显著升高；rhTNF-NC可使D-GalN致敏小鼠出现严重肝损伤，肝组织中Ca2+ 含量明显增加，钙通道阻滞剂维拉帕米、硝苯地平能显著降低肝组织中Ca2+含量，同时减轻肝损伤程度。 结论：rhTNF-NC可引起培养大鼠肝细胞及小鼠肝组织中钙稳度失调，钙通道阻滞剂通过减少Ca2+超载而减轻rhTNF-NC的肝损伤作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 575 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0020-04
Effect of rhTNF-NC on calcium homeostasis in cultured rat hepatocytes and mouse livers
YUAN Bo-Jun
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
LIU Jun-Ping
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
, 百拇医药
ZHANG Shu-Ying
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
WU Hao
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
YAN Tian-Hua
(Department of Pharmacology, Nanjing Military Medical College, Nanjing 210049, China)
, 百拇医药
ABSTRACT：Objective: To investigate the effect of rhTNF-NC on free cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in cultured rat hepatocytes and Ca2+ contents in mouse livers. Methods: [Ca2+]i was measured by fluorescence spectrophotometer with Ca2+ detector Fura-2/AM and Ca2+ contents in mouse livers were examined by atomic absorption spectrophotometer. Results: rhTNF-NC dose-dependently and significantly increased [Ca2+]i 3 h after it was added into culture medium. rhTNF-NC also dramatically increased Ca2+ contents in mouse livers and induced serious liver injury in mice previously sensitized with D-GalN. Calcium antagonists verapamil and nifedipine obviously decreased Ca2+ contents and attenuated liver injury. Conclusion: Ca2+ homeostasis in cultured rat hepatocytes and mouse livers is disordered by rhTNF-NC. Verapamil and nifedipine can attenuate liver injury induced by rhTNF-NC by decreasing Ca2+ accumulation.
, 百拇医药
KEY WORDS：tumor necrosis factor; liver injuries; calcium homeostasis▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 20-23]
Ca2+是细胞内第二信使之一，参与众多细胞功能的调节，介导一系列病理生理过程，钙超载是细胞死亡的最后关键步骤，且与氧化应激损伤有十分密切的联系[1]。在以TNF-α为主要介质的内毒素所致多器官损伤中，也存在细胞内钙稳态失调，脓毒血症患者有20%出现低血钙，且预后较差，患者中的淋巴细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i比正常人高[2]，单核、中性粒细胞对刺激的钙反应能力下降。钙通道阻滞剂能减少内毒素血症、败血症动物的死亡率及逆转或阻止肝等重要器官的病理改变。内质网钙释放抑制剂通过使细胞内钙恢复正常，也显示出保护作用，这些均表明细胞内钙参与了内毒素的肝损伤过程[3]。
, 百拇医药
N,C-terminal mutant recombinant human tumor necrosis factor(rhTNF-NC)是人TNF-α经氨基酸改造后的突变体，具有高效、低毒的特点，但我室毒理学研究表明其仍存在较明显的肝毒性。本实验应用荧光分光光度法及原子吸收分光光度法测定培养大鼠肝细胞[Ca2+]i和小鼠肝组织中Ca2+含量，以探讨Ca2+在rhTNF-NC肝损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠24只，体质量200～250 g，雌性。 ICR小鼠，64只，体质量18～22 g，雌雄各半，大鼠和小鼠均购自第二军医大学实验动物中心。
1.2 试剂及药品 rhTNF-NC由本校神经生物学教研室提供，比活性为8×108 U/mg，用生理盐水配成1×108 U/ml，临用前稀释至所需浓度。无钙灌流液含NaCl 142 mmol/L，KCl 6.7 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，NaOH 5.5 mmol/L，pH 7.4。酶灌流液含NaCl 67 mmol/L，KCl 6.7 mmol/L，CaCl2。2H2O 5 mmol/L ，HEPES 100 mmol/L，NaOH 66 mmol/L， 胶原酶Ⅳ (Sigma公司产品) 0.05%，pH 7.6，现配现用。 DMEM培养液为Gibco公司产品。 新生小牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所产品。Fura-2/AM，中科院生理所产品，用二甲亚砜溶解成1 mmol/L储备液。 Ethylene glycol bis(2-aminoethyl) tetracetic acid (EGTA)为Amresco产品。Triton X-100，美国进口分装。(D-Galactos-amine， D-GalN)， 北京精细化工厂产品。维拉帕米，上海黄河利亚制药有限公司产品，批号 960801。硝苯地平，南京第二制药厂产品，批号960702。GPT测定试剂盒，上海长征医学科学有限公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
1.3 大鼠肝细胞的分离与培养[4] 雌性Wistar大鼠，20%乌拉坦麻醉，消毒腹部，在门静脉及下腔静脉近肾处各穿一线备用，沿下腔静脉插管，以37℃预温的无钙灌流液灌注肝脏，速度12 ml/min，至肝脏表面呈光滑均一土黄色，此时剪开膈肌，结扎近心处下腔静脉，无钙灌流液从门静脉插管流出，再转接37℃预温的50 ml 0.05%胶原酶灌流液，循环灌注10～15 min后，肝脏表面柔软无弹性，停止灌注，取下肝脏至无菌平皿中，以PBS冲洗2遍，撕开肝包膜，肝细胞自行流出。以100目尼龙网过滤，500 r/min，离心2 min，弃去上清，沉淀细胞以PBS洗3次，即为肝细胞。将肝细胞悬浮于DMEM培养液中，锥虫蓝染色，计数，排斥率应在85%以上；以1×106 个/ml接种于鼠胶原包被的培养皿内，培养液中加10%小牛血清，置37℃ 5% CO2孵箱内培养，4 h后换液，弃去未贴壁细胞，继续培养。
1.4 培养大鼠肝细胞内[Ca2+]i的测定[5] 轻轻吹落贴壁的肝细胞(1×106个/ml) ，加入rhTNF-NC，终质量浓度分别为5×107，1×107，2×106 U/L ，对照组加等体积的生理盐水，2 h后加入Fura-2/AM (终浓度为5 nmol/L) ，37℃恒温振荡1 h。负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hank液洗2次，最后调整细胞悬液为1×106个/ml，测定前细胞预先于37℃ 复温约2～3 min。荧光测定应用日立RF-510荧光分光光度计，测定条件：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，观察340 nm处不同实验条件下荧光强度的变化。 由下式计算出[Ca2+]i：
, 百拇医药
其中，Kd为Fura-2/AM与Ca2+反应的解离常数，值为224 nmol/L，F为不同实验条件下的荧光强度：Fmax为最大荧光值，由加入Triton X-100(终浓度为0.1%)测得；Fmin为最小荧光值，由加入EGTA(终浓度至少大于Ca2+浓度2～3倍，pH>8.5)测得，在计算前，对细胞自发荧光的影响进行校正，即式中F，Fmax，Fmin取分别减去未负载Fura-2/AM细胞的F，Fmax，Fmin值后进行计算。
1.5 小鼠肝组织中Ca2+含量的测定 (1)取64只小鼠，雌雄各半，随机分8组，每组8只，前4组分别是生理盐水对照组D-GalN (0.7 g/kg, ip)组、rHTNF-NC (1×108 U/m2, iv)组和D-GalN+rhTNF-NC组(剂量同前)；后4组为钙拮抗剂保护组：分别是维拉帕米0.05 g/kg和0.1 g/kg组，硝苯地平0.04 g/kg和0.08 g/kg组。(2)后4组给药顺序如下：分别按各组剂量灌胃给药
按各组剂量分别灌胃
处死小鼠，取肝组织0.2 g于25 ml锥形瓶中，加入2 ml HCl∶HNO3 (3∶1)，加热至200℃消化，直至溶液成无色，蒸发后体积减少，然后用超纯水稀释至1 ml，应用岛津AA-670原子吸收分光光度计测定Ca2+含量，由下式计算出每克湿肝组织中含Ca2+的量(μg)：Ca2+＝测定浓度(1×10-3 g/L)×稀释倍数/湿肝质量。
, 百拇医药
1.6 血清中GPT活性的测定 长征公司试剂盒(常规赖氏法)。
1.7 统计学处理 数据均以
±s表示，组间差异采用t检验。
2 结果
2.1 rhTNF-NC对培养大鼠肝细胞[Ca2+]i的影响 与对照组相比，高、中剂量rhTNF-NC均可使肝细胞[Ca2+]i非常显著升高(P<0.01)，加入低剂量rhTNF-NC 3 h后，也可使肝细胞[Ca2+]i显著升高(P<0.05)，结果见表1。
表1 rhTNF-NC对培养大鼠肝细胞[Ca2+]i的影响
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Tab 1 Effect of rhTNF-NC on free cytosolic Ca2+
in cultured rat hepatocytes
(n=6，±s) Group
[Ca2+]i (cB/nmol。L-1)
Control
165.41±36.23
rhTNF-NC
, 百拇医药 (z/U。L-1)
5×107
439.81±93.44**
1×107
310.99±82.34**
2×106
223.92±50.53*
*P<0.05，**P<0.01 vs control
2.2 rhTNF-NC对小鼠肝组织中Ca2+含量的影响 与对照组相比，单独ip 700 mg/kg D-GalN 不能使小鼠出现肝损伤，肝组织中Ca2+含量、血浆中GPT活性未见明显升高(P>0.05)；iv rhTNF-NC 8 h后，肝组织中Ca2+含量、血浆中GPT活性增加非常显著 (P<0.01)，rhTNF-NC+D-GalN使小鼠出现严重肝损伤，肝组织中钙含量、血浆中GPT活性增加极其明显(P<0.001)。0.05， 0.1 g/kg维拉帕米； 0.04，0.08 g/kg 硝苯地平能剂量依赖性地显著减少 rhTNF-NC+D-GalN所致小鼠肝组织中钙含量增加及降低血浆中GPT活性， 结果见表2。
, 百拇医药
表2 rh TNF-NC对小鼠肝组织中Ca2+含量
的影响及钙拮抗剂的保护作用
Tab 2 Effect of rhTNF-NC on the Ca2+ contents in mouse
livers and the protective effect of calcium antagonists
(n=8，±s) Group
Ca2+
(wB/μg。g-1)
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GTP
(zB/U。L-1)
Control
88.54±7.01
36.0±18.6
D-GalN(0.7 g/kg)
92.10±7.24
34.8±19.8
rhTNF-NC(1×108 U/m2)
110.70±10.47**
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110.2±31.8**
rhTNF-NC+D-GalN
(1×108 U/m2+0.7 g/kg)
180.96±21.56***
782.1±128.2***
Verapamil(0.05 g/kg)
144.07±13.62△△
453.3±101.2△△
Verapamil(0.1 g/kg)
, 百拇医药
120.19±15.46△△
222.3±80.6△△
Nifedipine(0.04 g/kg)
159.07±11.05△△
619.3±91.5△
Nifedipine(0.08 mg/kg)
139.24±17.43△△
415.3±76.4△△
**P<0.01，***P<0.001 vs control；△P<0.05, △△P<0.01 vs rhTNF-NC+D-GalN
, 百拇医药
3 讨论
正常情况下，细胞外Ca2+浓度比胞内Ca2+浓度高103～104倍，这种浓度梯度的维持有赖于耗能的钙泵及钙通道等。外界病理刺激可通过外钙内流或内钙释放使胞内Ca2+浓度升高，影响钙稳态[1]。在实验中我们发现各种剂量的rhTNF-NC均可导致肝细胞[Ca2+]i明显升高，这种[Ca2+]i升高发生在给rhTNF-NC后3 h，此时肝细胞未见明显损伤，培养液上清中LDH活性未见明显升高(另文发表)，但由高钙激发的病理生理过程已启动，导致6 h后培养肝细胞坏死。这一结果与TNF-α能引起其他一些细胞[Ca2+]i升高的实验相一致[6]。rhTNF-NC与TNF-α的结构有所不同，但他们的生物学活性由相同受体介导，结构的改变可能引起与受体亲和力的变化，由TNF-α的许多研究结果推断，rhTNF-NC引起肝细胞[Ca2+]i升高可能通过激活电压依赖性钙通道，促外钙内流，使膜去极化，继而引起内钙释放；也可能通过诱导肝细胞产生LTD4。LTD4作用于受体，影响抑制性G蛋白功能，引起Cl-通道开放，进而使[Ca2+]i升高[7]。
, 百拇医药
我们在另一部分研究中发现，rhTNF-NC能引起培养大鼠肝细胞氧自由基的大量产生，肝细胞膜出现脂质过氧化性损伤，这与胞内钙稳态失调有重要关系[1]。
在整体动物实验中，我们预先注射非毒性剂量 0.7 g/kg D-GalN致敏小鼠后，再iv rhTNF-NC，发现小鼠肝脏出现严重坏死，血清中GPT活性及肝组织中的Ca2+含量非常明显升高。D-GalN可以抑制肝中一些保护性蛋白质的合成，如MnSOD，所以可加重rhTNF-NC的肝损伤作用。钙拮抗剂维拉帕米、硝苯地平能有效减少肝组织中Ca2+含量及损伤程度，说明Ca2+超载在rhTNF-NC肝损伤中起重要的作用，钙拮抗剂显示出较好的保肝作用。维拉帕米、硝苯地平为电压敏感性钙通道阻滞剂，它们降低肝脏中Ca2+可能与阻断rhTNF-NC对Ca2+通道的激活有关，同时它们还有膜稳定作用，一定程度减轻自由基对膜的损伤，维持细胞内Ca2+的稳态。
, 百拇医药
rhTNF-NC不仅直接损伤肝脏，同时还可能诱导小鼠肝组织释放内源性炎症因子，如TNF-α，IL-1，IL-8，这更加重肝损伤。巨噬细胞、肝库普弗细胞是这些炎症因子的主要来源[8]，它们合成分泌这些细胞因子需要胞内Ca2+浓度的升高。阻止钙信号传导过程，如钙通道阻滞剂、胞内钙释放抑制剂、PKC激活抑制剂、钙调素抑制剂均能有效减少内毒素血症动物血浆中的细胞因子含量，降低动物死亡率及减轻肝、肾等器官的损伤程度[9]。本实验中维拉帕米、硝苯地平的肝保护作用也可能与减少rhTNF-NC诱导的肝组织中内源性炎症因子的释放有关。■
基金项目：国家新药研究基金资助项目(96-90145)
作者简介：颜天华(1969～)，男(汉族)，硕士，讲师
参考文献：
[1]Trump BF, Berezesky IK. Calcium mediated cell injury and cell death[J]. FASEB J, 1995,9(2):219-228.
, 百拇医药
[2]Zaloga GP, Washburn D, Black KW, et al . Human sepsis increases lymphocyte intracellular calcium[J]. Crit Care Med, 1993,21(2):196-202.
[3]Song SK, Karl IE, Ackerman JJ, et al. Increased intracellular Ca2+: a critical link in the pathophysiology of sepsis?[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1993, 90(9): 3933-3937.
[4]张 蒙,苏映军,陈 璧,等. 大鼠肝细胞原代长期培养的形态学观察[J]. 第四军医大学学报, 1995,16(6):418-422.
[5]李 明 ,王峻峰, 韩济生, 等. 应用Fura-2/AM检测分离 的神经细胞内游离钙及其变化[J]. 药学学报,1991,26(12):890-894.
, 百拇医药
[6]Koller H, Thiem K, Siebler M. Tumor necrosis factor alpha increases intracellular Ca2+ and induces a depolarization in cultured astroglial cells[J]. Brain, 1996,119(pt 6):2021-2027.
[7]Meng XJ, Carruth MW, Weinman SA. Leukotriene D4 activates a chloride conductance in hepatocytes from lipopolysaccharide-treated rats[J]. J Clin Invest, 1997,99(12):2915-2922.
[8]Lichtman SN, Wang J, Zhang C, et al. Endocytosis and Ca2+ are required for endotoxin-stimulated TNF-alpha release by rat Kupffer cells[J]. Am J Physiol, 1996,271(5 pt 1):G920-G928.
[9]Hotchkiss RS, Osborne DF, Lappas GD, et al. Calcium antagonists decrease plasma and tissue concentrations of tumor necrosis factor-alpha,interleukin-1 beta,and interleukin-1 alpha in a mouse model of endotoxin[J]. Shock,1995,3(5):337-342.
收稿日期：1999-07-06
修回日期：1999-09-02, 百拇医药
单位：袁伯俊(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；刘俊平(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；张淑英(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；吴浩(第二军医大学基础医学部卫生毒理教研室，上海 200433)；颜天华(南京军医学院药理学教研室，南京 210049)
关键词：肿瘤坏死因子；肝损伤；钙稳度
第二军医大学学报000107 摘 要：目的：研究新型重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-NC)对培养大鼠肝细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)及小鼠肝组织中Ca2+含量的影响。方法：以 Fura-2/AM为Ca2+荧光检测，荧光分光光度法测定培养大鼠肝细胞内[Ca2+]i；原子吸收分光光度法测定小鼠肝组织中Ca2+含量。结果：在加入rhTNF-NC 3 h后，可剂量依赖性地引起培养大鼠肝细胞内[Ca2+]i显著升高；rhTNF-NC可使D-GalN致敏小鼠出现严重肝损伤，肝组织中Ca2+ 含量明显增加，钙通道阻滞剂维拉帕米、硝苯地平能显著降低肝组织中Ca2+含量，同时减轻肝损伤程度。 结论：rhTNF-NC可引起培养大鼠肝细胞及小鼠肝组织中钙稳度失调，钙通道阻滞剂通过减少Ca2+超载而减轻rhTNF-NC的肝损伤作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 575 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0020-04
Effect of rhTNF-NC on calcium homeostasis in cultured rat hepatocytes and mouse livers
YUAN Bo-Jun
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
LIU Jun-Ping
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
, 百拇医药
ZHANG Shu-Ying
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
WU Hao
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
YAN Tian-Hua
(Department of Pharmacology, Nanjing Military Medical College, Nanjing 210049, China)
, 百拇医药
ABSTRACT：Objective: To investigate the effect of rhTNF-NC on free cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in cultured rat hepatocytes and Ca2+ contents in mouse livers. Methods: [Ca2+]i was measured by fluorescence spectrophotometer with Ca2+ detector Fura-2/AM and Ca2+ contents in mouse livers were examined by atomic absorption spectrophotometer. Results: rhTNF-NC dose-dependently and significantly increased [Ca2+]i 3 h after it was added into culture medium. rhTNF-NC also dramatically increased Ca2+ contents in mouse livers and induced serious liver injury in mice previously sensitized with D-GalN. Calcium antagonists verapamil and nifedipine obviously decreased Ca2+ contents and attenuated liver injury. Conclusion: Ca2+ homeostasis in cultured rat hepatocytes and mouse livers is disordered by rhTNF-NC. Verapamil and nifedipine can attenuate liver injury induced by rhTNF-NC by decreasing Ca2+ accumulation.
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KEY WORDS：tumor necrosis factor; liver injuries; calcium homeostasis▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 20-23]
Ca2+是细胞内第二信使之一，参与众多细胞功能的调节，介导一系列病理生理过程，钙超载是细胞死亡的最后关键步骤，且与氧化应激损伤有十分密切的联系[1]。在以TNF-α为主要介质的内毒素所致多器官损伤中，也存在细胞内钙稳态失调，脓毒血症患者有20%出现低血钙，且预后较差，患者中的淋巴细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i比正常人高[2]，单核、中性粒细胞对刺激的钙反应能力下降。钙通道阻滞剂能减少内毒素血症、败血症动物的死亡率及逆转或阻止肝等重要器官的病理改变。内质网钙释放抑制剂通过使细胞内钙恢复正常，也显示出保护作用，这些均表明细胞内钙参与了内毒素的肝损伤过程[3]。
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N,C-terminal mutant recombinant human tumor necrosis factor(rhTNF-NC)是人TNF-α经氨基酸改造后的突变体，具有高效、低毒的特点，但我室毒理学研究表明其仍存在较明显的肝毒性。本实验应用荧光分光光度法及原子吸收分光光度法测定培养大鼠肝细胞[Ca2+]i和小鼠肝组织中Ca2+含量，以探讨Ca2+在rhTNF-NC肝损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠24只，体质量200～250 g，雌性。 ICR小鼠，64只，体质量18～22 g，雌雄各半，大鼠和小鼠均购自第二军医大学实验动物中心。
1.2 试剂及药品 rhTNF-NC由本校神经生物学教研室提供，比活性为8×108 U/mg，用生理盐水配成1×108 U/ml，临用前稀释至所需浓度。无钙灌流液含NaCl 142 mmol/L，KCl 6.7 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，NaOH 5.5 mmol/L，pH 7.4。酶灌流液含NaCl 67 mmol/L，KCl 6.7 mmol/L，CaCl2。2H2O 5 mmol/L ，HEPES 100 mmol/L，NaOH 66 mmol/L， 胶原酶Ⅳ (Sigma公司产品) 0.05%，pH 7.6，现配现用。 DMEM培养液为Gibco公司产品。 新生小牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所产品。Fura-2/AM，中科院生理所产品，用二甲亚砜溶解成1 mmol/L储备液。 Ethylene glycol bis(2-aminoethyl) tetracetic acid (EGTA)为Amresco产品。Triton X-100，美国进口分装。(D-Galactos-amine， D-GalN)， 北京精细化工厂产品。维拉帕米，上海黄河利亚制药有限公司产品，批号 960801。硝苯地平，南京第二制药厂产品，批号960702。GPT测定试剂盒，上海长征医学科学有限公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
1.3 大鼠肝细胞的分离与培养[4] 雌性Wistar大鼠，20%乌拉坦麻醉，消毒腹部，在门静脉及下腔静脉近肾处各穿一线备用，沿下腔静脉插管，以37℃预温的无钙灌流液灌注肝脏，速度12 ml/min，至肝脏表面呈光滑均一土黄色，此时剪开膈肌，结扎近心处下腔静脉，无钙灌流液从门静脉插管流出，再转接37℃预温的50 ml 0.05%胶原酶灌流液，循环灌注10～15 min后，肝脏表面柔软无弹性，停止灌注，取下肝脏至无菌平皿中，以PBS冲洗2遍，撕开肝包膜，肝细胞自行流出。以100目尼龙网过滤，500 r/min，离心2 min，弃去上清，沉淀细胞以PBS洗3次，即为肝细胞。将肝细胞悬浮于DMEM培养液中，锥虫蓝染色，计数，排斥率应在85%以上；以1×106 个/ml接种于鼠胶原包被的培养皿内，培养液中加10%小牛血清，置37℃ 5% CO2孵箱内培养，4 h后换液，弃去未贴壁细胞，继续培养。
1.4 培养大鼠肝细胞内[Ca2+]i的测定[5] 轻轻吹落贴壁的肝细胞(1×106个/ml) ，加入rhTNF-NC，终质量浓度分别为5×107，1×107，2×106 U/L ，对照组加等体积的生理盐水，2 h后加入Fura-2/AM (终浓度为5 nmol/L) ，37℃恒温振荡1 h。负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hank液洗2次，最后调整细胞悬液为1×106个/ml，测定前细胞预先于37℃ 复温约2～3 min。荧光测定应用日立RF-510荧光分光光度计，测定条件：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，观察340 nm处不同实验条件下荧光强度的变化。 由下式计算出[Ca2+]i：
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其中，Kd为Fura-2/AM与Ca2+反应的解离常数，值为224 nmol/L，F为不同实验条件下的荧光强度：Fmax为最大荧光值，由加入Triton X-100(终浓度为0.1%)测得；Fmin为最小荧光值，由加入EGTA(终浓度至少大于Ca2+浓度2～3倍，pH>8.5)测得，在计算前，对细胞自发荧光的影响进行校正，即式中F，Fmax，Fmin取分别减去未负载Fura-2/AM细胞的F，Fmax，Fmin值后进行计算。
1.5 小鼠肝组织中Ca2+含量的测定 (1)取64只小鼠，雌雄各半，随机分8组，每组8只，前4组分别是生理盐水对照组D-GalN (0.7 g/kg, ip)组、rHTNF-NC (1×108 U/m2, iv)组和D-GalN+rhTNF-NC组(剂量同前)；后4组为钙拮抗剂保护组：分别是维拉帕米0.05 g/kg和0.1 g/kg组，硝苯地平0.04 g/kg和0.08 g/kg组。(2)后4组给药顺序如下：分别按各组剂量灌胃给药
按各组剂量分别灌胃处死小鼠，取肝组织0.2 g于25 ml锥形瓶中，加入2 ml HCl∶HNO3 (3∶1)，加热至200℃消化，直至溶液成无色，蒸发后体积减少，然后用超纯水稀释至1 ml，应用岛津AA-670原子吸收分光光度计测定Ca2+含量，由下式计算出每克湿肝组织中含Ca2+的量(μg)：Ca2+＝测定浓度(1×10-3 g/L)×稀释倍数/湿肝质量。, 百拇医药
1.6 血清中GPT活性的测定 长征公司试剂盒(常规赖氏法)。
1.7 统计学处理 数据均以
±s表示，组间差异采用t检验。2 结果
2.1 rhTNF-NC对培养大鼠肝细胞[Ca2+]i的影响 与对照组相比，高、中剂量rhTNF-NC均可使肝细胞[Ca2+]i非常显著升高(P<0.01)，加入低剂量rhTNF-NC 3 h后，也可使肝细胞[Ca2+]i显著升高(P<0.05)，结果见表1。
表1 rhTNF-NC对培养大鼠肝细胞[Ca2+]i的影响
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Tab 1 Effect of rhTNF-NC on free cytosolic Ca2+
in cultured rat hepatocytes
(n=6，
±s) Group[Ca2+]i (cB/nmol。L-1)
Control
165.41±36.23
rhTNF-NC
, 百拇医药 (z/U。L-1)
5×107
439.81±93.44**
1×107
310.99±82.34**
2×106
223.92±50.53*
*P<0.05，**P<0.01 vs control
2.2 rhTNF-NC对小鼠肝组织中Ca2+含量的影响 与对照组相比，单独ip 700 mg/kg D-GalN 不能使小鼠出现肝损伤，肝组织中Ca2+含量、血浆中GPT活性未见明显升高(P>0.05)；iv rhTNF-NC 8 h后，肝组织中Ca2+含量、血浆中GPT活性增加非常显著 (P<0.01)，rhTNF-NC+D-GalN使小鼠出现严重肝损伤，肝组织中钙含量、血浆中GPT活性增加极其明显(P<0.001)。0.05， 0.1 g/kg维拉帕米； 0.04，0.08 g/kg 硝苯地平能剂量依赖性地显著减少 rhTNF-NC+D-GalN所致小鼠肝组织中钙含量增加及降低血浆中GPT活性， 结果见表2。
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表2 rh TNF-NC对小鼠肝组织中Ca2+含量
的影响及钙拮抗剂的保护作用
Tab 2 Effect of rhTNF-NC on the Ca2+ contents in mouse
livers and the protective effect of calcium antagonists
(n=8，
±s) GroupCa2+
(wB/μg。g-1)
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GTP
(zB/U。L-1)
Control
88.54±7.01
36.0±18.6
D-GalN(0.7 g/kg)
92.10±7.24
34.8±19.8
rhTNF-NC(1×108 U/m2)
110.70±10.47**
, http://www.100md.com
110.2±31.8**
rhTNF-NC+D-GalN
(1×108 U/m2+0.7 g/kg)
180.96±21.56***
782.1±128.2***
Verapamil(0.05 g/kg)
144.07±13.62△△
453.3±101.2△△
Verapamil(0.1 g/kg)
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120.19±15.46△△
222.3±80.6△△
Nifedipine(0.04 g/kg)
159.07±11.05△△
619.3±91.5△
Nifedipine(0.08 mg/kg)
139.24±17.43△△
415.3±76.4△△
**P<0.01，***P<0.001 vs control；△P<0.05, △△P<0.01 vs rhTNF-NC+D-GalN
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3 讨论
正常情况下，细胞外Ca2+浓度比胞内Ca2+浓度高103～104倍，这种浓度梯度的维持有赖于耗能的钙泵及钙通道等。外界病理刺激可通过外钙内流或内钙释放使胞内Ca2+浓度升高，影响钙稳态[1]。在实验中我们发现各种剂量的rhTNF-NC均可导致肝细胞[Ca2+]i明显升高，这种[Ca2+]i升高发生在给rhTNF-NC后3 h，此时肝细胞未见明显损伤，培养液上清中LDH活性未见明显升高(另文发表)，但由高钙激发的病理生理过程已启动，导致6 h后培养肝细胞坏死。这一结果与TNF-α能引起其他一些细胞[Ca2+]i升高的实验相一致[6]。rhTNF-NC与TNF-α的结构有所不同，但他们的生物学活性由相同受体介导，结构的改变可能引起与受体亲和力的变化，由TNF-α的许多研究结果推断，rhTNF-NC引起肝细胞[Ca2+]i升高可能通过激活电压依赖性钙通道，促外钙内流，使膜去极化，继而引起内钙释放；也可能通过诱导肝细胞产生LTD4。LTD4作用于受体，影响抑制性G蛋白功能，引起Cl-通道开放，进而使[Ca2+]i升高[7]。
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我们在另一部分研究中发现，rhTNF-NC能引起培养大鼠肝细胞氧自由基的大量产生，肝细胞膜出现脂质过氧化性损伤，这与胞内钙稳态失调有重要关系[1]。
在整体动物实验中，我们预先注射非毒性剂量 0.7 g/kg D-GalN致敏小鼠后，再iv rhTNF-NC，发现小鼠肝脏出现严重坏死，血清中GPT活性及肝组织中的Ca2+含量非常明显升高。D-GalN可以抑制肝中一些保护性蛋白质的合成，如MnSOD，所以可加重rhTNF-NC的肝损伤作用。钙拮抗剂维拉帕米、硝苯地平能有效减少肝组织中Ca2+含量及损伤程度，说明Ca2+超载在rhTNF-NC肝损伤中起重要的作用，钙拮抗剂显示出较好的保肝作用。维拉帕米、硝苯地平为电压敏感性钙通道阻滞剂，它们降低肝脏中Ca2+可能与阻断rhTNF-NC对Ca2+通道的激活有关，同时它们还有膜稳定作用，一定程度减轻自由基对膜的损伤，维持细胞内Ca2+的稳态。
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rhTNF-NC不仅直接损伤肝脏，同时还可能诱导小鼠肝组织释放内源性炎症因子，如TNF-α，IL-1，IL-8，这更加重肝损伤。巨噬细胞、肝库普弗细胞是这些炎症因子的主要来源[8]，它们合成分泌这些细胞因子需要胞内Ca2+浓度的升高。阻止钙信号传导过程，如钙通道阻滞剂、胞内钙释放抑制剂、PKC激活抑制剂、钙调素抑制剂均能有效减少内毒素血症动物血浆中的细胞因子含量，降低动物死亡率及减轻肝、肾等器官的损伤程度[9]。本实验中维拉帕米、硝苯地平的肝保护作用也可能与减少rhTNF-NC诱导的肝组织中内源性炎症因子的释放有关。■
基金项目：国家新药研究基金资助项目(96-90145)
作者简介：颜天华(1969～)，男(汉族)，硕士，讲师
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收稿日期：1999-07-06
修回日期：1999-09-02, 百拇医药