ZIP1和ZIP2不同程度激活PKC对钾离子通道的磷酸化
作者：龚剑平 徐嘉 Magda lena Bezanilla Rika van Huizen Rechel Derin 利民
单位：龚剑平(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；徐嘉(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；Magda lena Bezanilla(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；Rika van Huizen(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；Rechel Derin(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；利民(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)
关键词：蛋白修饰酶；蛋白激酶；钾离子通道；磷酸化
第一军医大学学报000101 摘要：蛋白修饰酶的定向修饰反应是蛋白合成后进行特异、有效修饰的一个关键步骤。ZIP1和ZIP2是两个互为剪切异构体的蛋白，它们既与钾离子通道的Kvb 2亚基结合，又与蛋白激酶c(pkcζ )结合。由于它们的联结作用，使三者形成一个复合物。而ZIP1和ZIP2可不同程度激活pkcζ 对钾离子通道的磷酸化，且二者可以相互结合，形成异型多聚体，这就使它们对pkcζ 的刺激复杂多变。另外，ZIP1和ZIP2共存于同一种细胞中，并且经神经生长因子刺激后，升高的程度各不相同。这些实验结果提示了pkcζ 定向磷酸化的特异性和调控性的分子机理。
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中图分类号：Q7 文献标识码：A 文章编号：1000–2588(2000)01–0001-06
蛋白磷酸化无论对于调节神经兴奋还是其他非神经过程，都是非常重要的。离子通道的磷酸化能够改变通道蛋白的表达和动力学特性，是调节膜兴奋性的关键[1]。生化和电生理研究提示了含离子通道以及密切相关的蛋白激酶和蛋白去磷酸化酶的信号复合物的存在[2]。这种离子通道 磷酸激酶/去磷酸化酶复合物，为信号传递的特异性和调控性提供了必要的生物大分子结构基础[3,4]。丝氨酸-苏氨酸磷激酶(如PKC和PKA)可使许多离子通道磷酸化[5]。但PKC和PKA对离子通道蛋白进行修饰，特异定向和活性调控的分子机制尚不十分清楚。
钾离子通道对调节神经兴奋性是十分重要的。在模型系统中，Shaker型钾离子通道被认为与联想记忆有关[7]。钾离子通道的辅助性亚基Kvβ 与钾离子通道的Kvα 亚基特异性结合后有时会产生调控效应[8~10]。哺乳类的Kvβ 2亚基广泛分布于有兴奋活性和无兴奋活性的细胞中，神经细胞中的Shaker钾离子通道的分子构成比为(Kvα)4 (Kvβ)4[11]。
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1 ZIP1和ZIP2基因的分子克隆
为了寻找具有与钾离子通道结合功能的蛋白，我们用全序列的Kvβ 2在酵母双杂交文库(源自大鼠海马的mRNA)中进行筛选。与Kvβ 2结合的克隆包括若干不同长短的Kvβ 2 cDNA片段[12]。此外，我们发现两个cDNA片段，B20和B24，编码了两个以前未知的Kvβ 2结合蛋白。全长cDNA的序列比较显示，除了B24有一段81个碱基(相当于27个氨基酸)的缺失外，B20和B24的序列完全相同。尽管B24从未见报道，但B20与一个以前报道，称为ZIP(PKC-zetα interacting protein)的蛋白完全相同，它可与非典型的pkcζ 同切蛋白结合而被发现[13]，而且它的人同源蛋白，称为A170或p62，已经找到[14]。因此，我们称B20和B24为ZIP1和ZIP2。
我们参照缺失片段两侧的序列设计了引物，用PCR扩增，使源自ZIP1和ZIP2的DNA产物大小不同[15]。以大鼠小脑mRNA作RT-PCR扩增得到两种DNA片段(图1C，带5)。此两片段的泳动性和以ZIP1和ZIP2为模板克隆得到的PCR产物的泳动性相同，并分别对应ZIP1和ZIP2的编码序列(图1C，带2至带4)。由此证明，ZIP1和ZIP2互为剪切异构体，且均存在于脑组织内。两者的结构均含有几个蛋白结构域，提示它们的生化特性(图1A和B)。氨基末端的酸性结构簇是一新的结构域，与酵母中的CDC24片段相似，且在许多蛋白中均有发现，这些蛋白源自在进化上相距甚远的生物，从细菌到哺乳类动物皆有。所有这些蛋白都含有一个特征性的序列模式(Y/W)XDXXGD(L/F)(V/I)。锌指结构域含有三个CXXC结构簇和一个DYDL讯号[16,17]。PEST和UBA结构域参与调控蛋白的更新，其方式为编码蛋白稳定性和引导蛋白降解。另外，PEST序列还可与钙调节蛋白结合。
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ZIP是从大鼠脑cDNA文库中找到的，但它的表达却并不仅限于神经系统。在所有组织中，均可检测到一个相对分子质量为69 000的多肽(图1D)。与大多数组织不同的是，在中枢神经系统的组织中都检测到两条带，相对分子质量分别为69 000和66 000。如将检测纯化的GST-ZIP1融合蛋白先结合，则检测不到这两条带[19]。这两条多肽链的大小与ZIP1和ZIP2完全一致，但并不排除这两条带是蛋白合成后不同修饰的产物。我们用RT-PCR检测了 ZIP1和ZIP2的表达量和相对比例。在非可兴奋组织中，ZIP1的量比ZIP2明显要高，而在中枢神经系统组织中，ZIP1/ ZIP2的比例却接近1(图1D)。ZIP蛋白的表达量也因时而变。小脑是ZIP蛋白表达水平较高的区域(图2C)，ZIP蛋白的表达在出生后第13天达到高峰(图1E)。在出生后发育过程中，两个ZIP多肽的表达水平和相对比例都各不相同，RT-PCR也检测到ZIP1在出生后有所增加(图1E)。
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图1 A ZIP 蛋白结构域组成的示意图
B ZIP1 和 ZIP2 的一级结构推测的蛋
白磷酸激酶C 反应部位标以*蛋白结构域
和ZIP2 中缺失的27 个氨基酸区域以黑底白
字显示C 以RT-PCR 检测ZIP1 和 ZIP2
的转录产物[15]用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
RT-PCR 产物PCR 的DNA 模板为克隆的
ZIP1 带2 和 ZIP2 带3 的cDNA ZIP1
和 ZIP2 的c DNA 的1:1 混合带4 及
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源自小脑mRNA 的RT-PCR 产物带5
D 免疫印迹实验从各种组织中检测到一
种或多种ZIP 蛋白从所标示的各种组织中
制备了总蛋白匀浆用100 mg 的蛋白加样
以兔抗- ZIP 的抗体检测ZIP 多肽[8~26]在大
部分组织中检测到一个相对分子质量为69
000 的多肽该信号可由纯化的GST- ZIP1
蛋白特异性阻断将抗体先GST- ZIP1 孵
温则检测不到此69 000 多肽下图
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RT-PCR 检测来自所示组织中的mRNA 方
法详见15 ZIP1/ZIP2 之比列在图的下方
E 以出生后不同天数的大鼠小脑制备匀
浆用SDS-PAGE 分离等量匀浆再用抗- ZIP
抗体作免疫印迹检测出生后的天数标在上
方ZIP1/ZIP2 之比标在下方
2 ZIP蛋白与钾离子通道和磷酸激酶Cz 的结合
我们用酵母双杂交方法检测了ZIP和钾离子通道各亚基的结合。钾离子通道a -β复合物的形成是由Kva 亚基的T1结构域和Kvβ亚基的保留核心区域所介导的[8~10]。ZIP1和ZIP2，既与Kvβ1结合，又与pkcζ 结合，但不与ShB的Kva 亚基的氨基末端结构域结合，而这个氨基末端的结构域可与Kvβ结合。由此可见，ZIP是通过Kvβ亚基而与钾离子通道相联的。ZIP1和ZIP2可自联或互联为同型多聚体或异型多聚体(图2A)。在不加去垢剂的大鼠脑浆中，其可溶性蛋白复合物含有ZIP多聚体，相对分子质量640 000，半径大于6.1×10-9 m的球蛋白复合物[20]。纯化的ZIP GST-cdc结构域本身也为多聚体[13]。
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为了直接证明Kvβ2和ZIP之间的结合，我们将GST ZIP蛋白在大肠杆菌中表达后纯化，并与Affigel树脂加入过量HA标记的表达于哺乳动物细胞中的Kvβ2，将二者在一起孵温，以检测二者的结合[15]。GST-ZIP1-Affigel树脂和GST-ZIP2-Affigel树脂，均将HA标记的Kvβ2沉淀(带7和11，图2B)，而对照组GST-PDZ3-Affigel树脂却未见沉淀(带6和10，图2B)。
ZIP 既能与pkcζ 结合，又能与Kvβ2结合，这使我们设想，在pkcζ -ZIP-Kvβ2复合物中，ZIP发挥的是联结物的作用。以大鼠全脑作连续水平切片，再以Kvβ2，ZIP1和 pkcζ 的正链(右列)和负链(左列)探针作原位杂交，结果发现这三者的mRNA分布区域是重迭的，尤其是在海马的锥体细胞和小脑的浦肯野氏细胞中，它们的分布远较脑的其它部位为高。
以成年大鼠小脑制备加入去垢剂的蛋白匀浆，进行免疫共沉淀实验。用Kvβ2， ZIP和pkcζ 的特异性抗体沉淀蛋白复合物，三种抗体均可沉淀含有Kvβ2，ZIP和pkcζ 的蛋白复合物，然而，在小脑中富含的另一无关蛋白Translin, 存在于粗制可溶性匀浆中，上述三种抗体无一能使之沉淀。据认为ZIP与pkcζ可特异结合[13]。与此结果一致，上述三种抗体无一能够沉淀PKCβII(图2D)。尽管Kvβ2-ZIP-pkcζ 复合物分子构成比尚未不清楚，但在小脑可溶性提取物中，69 000多肽被更为有效地免疫共沉淀，提示两种ZIP多肽对 Kvβ2和pkcζ 的结合有潜在差异。
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3 ZIP 蛋白介导的对Kvβ2磷酸化的刺激
以无磷的培养液培养哺乳动物cos7细胞，将编码Kvβ2和pkcζ 的DNA表达为与HA连接的融合蛋白[21]。用pkcζ 或Kvβ2转染的cos7细胞制备可溶性蛋白匀浆，将二者混匀，再以抗HA的单克隆抗体沉淀这两种蛋白。加入[33p]-r-ATP后，pkcζ 导致了Kvβ2亚基的基础磷酸化。当纯化的重组GST-ZIP1加入反应物中后，Kvβ2的磷酸化被激活提高了9倍以上，而GST-ZIP2的激活只提高了不足2倍(n=5, 图3A)。以pkcζ 酶的常用底物髓鞘基本蛋白(MBP)实验，无论在有无GST-ZIP1，GST-ZIP2或GST-PDZ3(对照)的情况下，MBP的磷酸化水平相差无几。因此，ZIP 介导的对pkcζ 的刺激对底物是有选择的，似乎仅限于与ZIP 结合的蛋白如Kvβ2。ZIP1和ZIP2之比因组织而异，有显著差别，提示ZIP1和ZIP2有不同的功能，的确，GST-ZIP1刺激Kvβ2磷酸化的活力较GST-ZIP2明显为强，它们的时程曲线可由两个指数参数模拟(图3c)。
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图2 (A)酵母双杂交实验结果综览。实验筛选出兼有GAL4-DB和GAL4-TA质粒的转化体，并让它们在组氨酸培养基上生长。(+)为生长，(- )为不长。用´ -Gal检测β-半乳糖苷酶，在前30 min呈现蓝色为(+++)，在前2 h呈现蓝色为(++)。(B)GST-ZIP1或GST-ZIP2与HA- Kvβ2的亲和性结合。将GST–ZIP1，GST-ZIP2，或PSD95的GST-PDZ3与Affigel交联，再与来自HA-Kvβ2转染的细胞的可溶性匀浆孵温[27]。未结合物(带4、5、8、9)和结合物(带6、7、10、11)均以SDS-PAGE分离，并用抗-HA抗体检测。样品标示在胶的上方。(C)原位杂交检测编码Kvβ2，ZIP1/2和pkcζ 的mRNA(28)。成年大鼠小脑水平面切片，以地高辛标记的负链(左列)和正链(右列)探针杂交。各种核酸探针以全序列cDNA反转录而成。(D)以GST- Kvβ2和GST-ZIP1制备抗血清，并用亲和层折法纯化，在免疫印渍检测中，这两种抗体和市售的抗-pkcζ 抗体均检测到Kvβ2，ZIP1/ZIP2和pkcζ 多肽，大小与预测相符。免疫印渍的信号可由相应的抗原阻断[29]。用成年大鼠小脑可溶性提取物作免疫共沉淀实验[30]。抗体沉淀的复合物以SDS-PAGE分离，再用免疫印迹检测。各列所用作免疫沉淀的抗体示于上方，小脑可溶性提取物作为原料，并列作为对照比较，右侧所示为用于免疫印迹的抗体，左侧所示为相对分子质量大小的标记。
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以定量的Kvβ2和pkcζ ，加入浓度递增的纯化GST-ZIP1或GST- ZIP2，测定Kvβ2的磷酸化，GST-ZIP1和GST- ZIP2的EC50值较接近，分别为(1.3± 0.4)μmol/L(n=4)和(2.1± 0.4) μmol/L(n=4)。然而，GST-ZIP1的最大刺激值比GST- ZIP2大7.4倍(图4)。在酵母双杂交系统中，ZIP1 和ZIP2对Kvβ2和pkcζ 的结合力相近(图2A)[13]。共免疫沉淀实验提示这种刺激的差异可能缘于它们结合力的潜在差异，这种差异是由于蛋白翻译后的不同修饰所致，实验结果如图2D。
图3 ZIP对Kvβ2亚基pkcζ 磷酸化的刺激 。(A)Kvβ2的体外磷酸化。以抗-HA沉淀Kvβ2 和pkcζ ，加入1 μmol的GST融合蛋白后，检测磷酸化[21]。磷酸化的蛋白以放射自显影来显示，反应所加入的蛋白列于胶的上方，Kvβ2的信号由磷酸显影计量，以不加pkcζ 和GST融合蛋白时Kvβ2的信号为标准，列于下方。(B)髓鞘基本蛋白(MBP)的磷酸化，以同样方法进行测定[29]。(C)ZIP介导的pkcζ 对Kvβ2不同程度刺激的磷酸化。Kvβ2磷酸化的时程测定如[21]，但反应在加入1 μmol纯化的ZIP1 和ZIP2后在4°C进行。数据以方程A[1-exp(- t/Υ1 )]+B[1-exp(- t/Υ2)]得到最佳回归，g 1 和g 2为两个不同的时间常数。对GST-ZIP1(n=3)而言，A=0.33±0.040，B=0.69±0.037，Υ1 =(1.3±0.35)min，Υ2=(2.6±3.9)min；对GST-ZIP2而言，A=0.12±0.037， B=0.10±0.059，Υ1=(40±34)min，Υ2=(4.3±3.0)min。
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在高浓度的GST-ZIP达到刺激高峰后，ZIP介导的刺激呈现一个可重复的下降相(图4)。加入相同或高浓度的对照GST融合蛋白如PSD-95的GST-PDZ3，ZIP介导的最大刺激不变，表明下降相并非因过量的GST所致。另外，改变pkcζ 或Kvβ2的加入量，可导致ZIP最大刺激Kvβ2磷酸化时浓度的变化[22]。因此，ZIP介导的刺激是通过形成一个包含pkcζ 、ZIP和Kvβ2，分子构成比固定的反应复合物而实现的。以上结果都支持这一观点。因此，高浓度的ZIP，不仅不能达到最大刺激，可能反而破坏了具有功能作用的pkcζ -ZIP-Kvβ2 的最佳比例，例如，组合成低活性的ZIP多聚体。
4 神经生长因子诱导PC12细胞中ZIP1和ZIP2 的不同程度表达
ZIP1和ZIP2是两个剪切异构体，它们刺激Kvβ2磷酸化的能力大不相同。二者的比例或许可由激素刺激来调节，这也许是调控细胞内磷酸化水平的一种方式。神经因子，如神经生长因子(NGF)与调节突触的可塑性和离子通道的活性有关[23]。PC12细胞对NGF的刺激的反应[24]为验证这一假设提供了一个模型系统。
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图4 GST-ZIP刺激pkcζ 对Kvβ2磷酸化的剂量依赖关系。以递增浓度的GST-ZIP1(A)或GST-ZIP2(B)进行体外磷酸化实验。第1至13列分别表示在0，0.0020，0.010，0.020，0.060，0.140，0.200，0.600，1.000，1.400，2.000，3.000和4.000 μmol/L GST-ZIP1或 GST-ZIP2存在时的反应，对Kvβ2磷酸化信号强度进行计量，并以GST-ZIP1的最大刺激值为标准进行规范化(C)。
在没有加NGF时，ZIP1和ZIP2的mRNA都可以检测到。在加入NGF后不到24 h，ZIP1/ZIP2之比从0.2升至1.0(图5A)，ZIP蛋白表达增加了大约30倍。经NGF刺激，66 000的ZIP2信号增强，同时69 000的ZIP1也增加(图5B)。在NGF刺激后72 h，69 000与66 000之比从没有NGF时的0.1增至0.8，这与ZIP1/ZIP2 mRNA比例的变化相一致。然而，在NGF刺激下，Kvp2 蛋白几乎没有变化；pkcζ 蛋白有轻微变化(图5B)。这些结果表明，ZIP1和ZIP2，均存在于同一种细胞内，并可形成异型多聚体，而且这种异型多聚体的分子构成比可被调控。
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以递增浓度的纯化GST-ZIP1加入固定浓度的GST- ZIP2，我们测定了Kvβ2 的磷酸化。在GST-ZIP2存在时，整个EC50值逐渐移向低浓度的GST-ZIP1(图5C)。例如，当加入定量的1 μmol GST-ZIP2时，GST-ZIP1的EC50值降低了大约10倍，从(1.3± 0.4)μmol (n=4)降到(0.18± 0.05)μmol(n=4)(图 5C)。尽管GST–ZIP2本身的确也有刺激活性，但水平相当低。不同浓度GST-ZIP1+1.0 μmol GST- ZIP2刺激Kvβ2磷酸化的实验数据所得曲线和不同浓度GST-ZIP1和1.0 μmol GST-ZIP2各自分别刺激Kvβ2磷酸化的数据相加所得的虚拟曲线(图5D)。EC50值的降低和剂量反应曲线的形状改变，均表明二者联合的刺激活性并非由二者单独的刺激活性线性相加而成。由酵母双杂交实验检测到的 ZIP1和ZIP2之间的异型多聚体结合(图2A)，支持GST-ZIP1和GST-ZIP2之间存在功能性结合的观点。
我们的结果揭示，ZIP作为一个联结蛋白，将pkcζ 定向至Kvβ2。ZIP1和 ZIP2，两个剪切异构体蛋白，具有不同活力以刺激pkcζ 对Kvβ2的磷酸化。它们自身及相互结合，形成同型多聚体和异型多聚体的能力，可解释只有在ZIP1和 ZIP2都存在的情况下才出现的协同刺激活性(图5C)。在各种组织和细胞中，对ZIP1活力的调控，并不仅仅局限于不同的时间和空间表达，ZIP1/ZIP2之比也具有组织特异性。而且，在同种细胞中，由于神经因子的刺激，ZIP1/ ZIP2之比被动态地调控。
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图5 (A)从未受刺激和经神经生长因子刺激的PC12细胞中提取的DNA作RT-PCR的结果。分别在神经生长因子刺激后24，48，72 h收集细胞[31]。ZIP1/ZIP2之比列于下方。(B)Kvβ2 ，ZIP1/2和pkcζ 蛋白的免疫印渍实验，从未受刺激和经神经生长因子刺激后不同时间收集的PC12细胞中提取蛋白，以等量蛋白(100 μg)上胶，用于检测的第一抗体列于下方。(C)定量GST-ZIP1对Kvβ2磷酸化的刺激作用(n=4)。(D)将1 μmol GST-ZIP1对Kvβ2的磷酸化值，与不同浓度GST-ZIP1对Kvβ2的磷酸化值分别相加，产生一条虚拟曲线(实线)，与根据相同条件下实验数据绘制的曲线进行比较。
在激素刺激下，PKC蛋白的再分布，是关系PKC特异性和活性的一个关键步骤[25]。我们的结果提示，在PKC分布改变后，随之而来的一个步骤也许涉及蛋白复合的特异和动态聚合，以便准确无误地传递激素的信号给特定的蛋白以进行共价键修饰。两个ZIP蛋白和它们生化功能的发现，为此提供了一个分子机制。据此机制，PKC对离子通道蛋白的磷酸化，可以在转录时和翻译后，进行调控和精细调节。
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参考文献和注释
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[15] 用PGEX4T2载体(Pharmacia Biotech, Indianapolis, IN), 参照标准步骤，表达GST-ZIP1和GST-ZIP2融合蛋白。用包含12CA5(抗原决定簇与氨基末端相连的PCMV载体表达HA标记蛋白。除非特别指出，一般均从第二个氨基酸开始表达完整的编码序列。用所示来源的组织或细胞进行RT-PCR实验。用TRIZOL(GIBCO-BRL，RocKville, MD)，以50 mg的组织(或从3.5-cm培养皿中收集的PC12细胞)制备RNA，按厂商提供的操作步骤，以2 m g RNA合成cDNA，用下列4种引物进行PCR扩增：ML1654，ML1659，ML1653和ML1553。如有需要，我们可提供所有引物序列。以ML1654/ML1659配对的引物进行扩增，ZIP1的产物片段为303 bp，ZIP2的产物片段为222 bp；而以ML1653/ML1553配对的引物进行扩增，ZIP1的产物片段为473 bp，ZIP2的产物片段为392 bp。从两对引物得到的结果是相同的，以ML1653/ML1553得到的结果没有在此发表。PCR的操作步骤包括在92oC变性1 min，在55 oC退火1 min，在68℃扩增30 s，共循环20次。
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[18]Single-letter abbreviations for the amino acid residues are as follows: A, Ala; C, Cys; D, A7p; e, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; l, lle; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P,Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; and Y, Tyyr. X indicates any residue.
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[21] 体外磷酸化：用在哺乳类表达的质粒转染cos7细胞，24 h后换成无磷酸培养液，48 h后收集细胞，细胞以Hepes缓冲生理盐水(140 mmol Nac1，2.7 mmol KC1和15 mmol Hepes，pH7.4)和1% Triton X-100制成匀浆后，以10 000 g离心5 min。加10 m l蛋白G琼脂糖颗粒于提取物中，这种颗粒已与抗HA抗体交联。收集颗粒并用Hepes缓冲生理盐水洗三次，然后将沉淀物溶解在20 m l激酶缓冲液内(35 mmol Tris-Hc1, pH7.5, 10 mmol MgCl2, 0.5 mmol EDTA, 0.1mol CaCl2, 和1 mmol phenyl phosphate)。向反应中加入所示剂量的GST-ZIP蛋白或对照物蛋白后，以5 m l磷脂酰丝氨酸 (1 mg/ml)和0.5 m l 33 p-r-ATP(10 370MBq) 激活磷酸化反应，除非特别指出，所有的磷酸化反应是在30 ℃进行30 min。以SDS上样缓冲液终止反应。将样品煮沸5 min后，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用柯达科学成像胶片检测磷酸化蛋白的放射自显影，用磷光成像仪(FUJIX BAS 1000，Fuji, Tokyo)检测放射性的相对剂量。
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[26] 将大鼠ZIP1和Kvb 2的全长序列cDNA表达为GST融合蛋白，以兔子进行免疫，制备抗-ZIP和抗-Kvb 2的抗体。抗–pkcζ 和抗-pkcb II抗体购于Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)公司。
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[27] 参照于等人[10]的操作步骤，将HA标记的Kvb 2暂时转染，用HA- Kvb 2和空白对照质粒转染的细胞制作匀浆，用Affi-Gel10 (Bio-Rad, CA)和GST对照，GST-ZIP1和GST-ZIP2蛋白连接，在含有20 mmol Hepes(pH7.5), 150 mmol NaCl, 1 mmol EDTA, 1 mmol 2-mercaptoethanol的缓冲液中，用20 m l 的颗粒和100 m l细胞匀将进行结合反应实验。在冰上反应1 h后，把颗粒洗三次，在SDS上样缓冲液中煮沸颗粒，以解离它上面的结合物，将结合物在SDS胶上分离后，再以抗-HA抗体作免疫印迹检测Kvb 2的结合。
[28] 用地高辛-RNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim, Indianapolis, 1N)进行原位杂交实验。简而言之，酶切含有全序列大鼠Kvb 2，ZIP1和pkcζ 的cDNA克隆，以制备核酸探针合成的DNA模板。质粒切成线状后，用体外转录的方法制备地高辛标记的RNA探针。用成年SD大鼠检测Kvb 2，ZIP1/2和pkcζ 的mRNA的表达。动物麻醉后处死，立即将全脑移出，用4%多聚甲醛固定2 h，用冷冻切片机切成12 m m 的冷冻切片，复温贴附在Saperfrost Plus的载玻片上，空气干燥。配制各种溶液的水均为去离子H2o 加0.1%(V/V)焦碳酸二乙酯，并高温消毒。切片浸入4%多聚甲醛(PBS配制， pH7.4)固定，然后用PBS洗2次。在经蛋白酶K处理后，切片再用4%多聚甲醛固定。将切片浸入含有0.25%乙酐的0.1 mol三乙醇胺溶液，进行乙酰化。用1% Triton X-100渗透，再用PBS洗两次。用预杂交液(50%甲酰胺，5XSSC, 5X Denhardt’s溶液，, 250 m g/ml酵母tRNA,和500 m g/ml Salmon精子DNA)在4℃过夜进行预杂交。将切片与含有1 m g/ml cDNA探针的杂交液在65 oC的潮湿盒内过夜，杂交后再按先后顺序浸入0.2XSSC两次，缓冲液 1(0.1mol Tris pH7.5, 0.15mol Nacl)两次。用缓冲液2(含1%失活的正常羊血清的缓冲液1)配制1:2 000抗一地高辛抗体溶液，与切片在4 oC反应过夜。切片用缓冲液1和缓冲液3(0.1mol Tris pH9.5, 0.1mol NaCl和50 mmol MgCl2)洗后，用5 ml显色缓冲液(0.1mol Tris pH9.5, 0.1mol NaCl和50 mmol MgCl2)配制含 1.2 mg Levamisole和300 m l NBT/Bclp的溶液，用以显色。
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[29] J. Gong et al., unpublished data.
[30] 用成年大鼠小脑提取液作免疫沉淀实验，以大鼠小脑在匀浆缓冲液[10 mmol Tris HCI pH8.0, 1% Triton X-100, 0.15mol NaCl, 1 mmol EDTA, 10 mmol NaN3和混合蛋白酶抑制剂(1 mmol phenyl methyl sulfonyl fluoride, 1 m g/ml leapetin, 2 m g/ml aprotinin,和1 m g/ml pepstatin)]中，用Dounce匀浆器在4%匀浆，缓冲液和组织之比为每克组织加入8 ml缓冲液，在研磨20次后，以10 000 g离心5 min，收集上清液。在1 ml(PBS溶液中，用40 m l蛋白A颗粒(Sigma Chemical, St . Louis, Mo)和20 m l抗血清在4%反应过夜，以便将抗体和蛋白A颗粒连接。移去未结合物后，用PBS洗琼脂糖颗粒3次，悬浮于500 m l 0.2 mol/L硼酸钠(pH9.0)中，加入 dimethyloime limidate至 20 mmol/L的终浓度，启动交联反应。在室温下反应30 min后，加入500 m l 0.2 mol/L乙醇胺终止交联反应。与乙醇胺反应2 h后，用PBS洗交联后的蛋白A-琼脂糖颗粒3次。用200 m l可溶性匀浆与10 m l抗体-蛋白A琼脂糖颗粒孵温以进行抗体结合实验。在4oC过夜反应后，从5 000 g 离心2 min，收集琼脂糖颗粒，并用PBS洗3次，将10 m l 2XSDS上样缓冲液加入各蛋白A沉淀物中，在100 oC煮沸5 min，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中可溶性蛋白。用所标示的相应抗体作免疫印渍，检测免疫沉淀的多肽。
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[31]PC12细胞培养和神经生长因子的刺激，基本按照(24)所述进行，简单地说，把105细胞种于3.5 cm的培养皿内，让细胞在含10%(V/V)小牛血清和5%(V/V)热失活马血清的培养液中生长24 h，加入纯化的神经生长因子至终浓度为0.1 m g/ml，以启动神经生长因子的刺激。让细胞生长72 h，收集细胞，进行实验。
[32] We thank D. Ginty for providing purified NGF, a. Lanahan and P. Worley for Cdna libraries, J. Baraban for anti-translin antibody, Y. Ono for rat pkcζ Cdna, l, Roman for in situ hybridization technique, M. Regan for RT-PCR technique, S. Wang for the control GST FUSION PROTEIN AND R. Butzner for help with manuscript preparation. We also thank C. Montell, P. Gillespie, and members of the Li Lab for comments on this manuscript. M.B. was a NSF predoctoral fellow. R.H. is supported in part by a postdoctoral fellowship from American Heart Association. M.L. is supported by a grant from NIH (NS33324) and an American Heart Association-Pfizer award.
[33] This is not an official Chinese translation by the staff of SCINECE, nor is it endorsed by SCIENCE as accurate. Rather, this translation is entirely that of the publisher. In crucial matters please refer to the official English-language Version originally printed in SCIENCE., http://www.100md.com
单位：龚剑平(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；徐嘉(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；Magda lena Bezanilla(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；Rika van Huizen(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；Rechel Derin(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)；利民(约翰。霍普金斯大学医学院生理神经科学系)
关键词：蛋白修饰酶；蛋白激酶；钾离子通道；磷酸化
第一军医大学学报000101 摘要：蛋白修饰酶的定向修饰反应是蛋白合成后进行特异、有效修饰的一个关键步骤。ZIP1和ZIP2是两个互为剪切异构体的蛋白，它们既与钾离子通道的Kvb 2亚基结合，又与蛋白激酶c(pkcζ )结合。由于它们的联结作用，使三者形成一个复合物。而ZIP1和ZIP2可不同程度激活pkcζ 对钾离子通道的磷酸化，且二者可以相互结合，形成异型多聚体，这就使它们对pkcζ 的刺激复杂多变。另外，ZIP1和ZIP2共存于同一种细胞中，并且经神经生长因子刺激后，升高的程度各不相同。这些实验结果提示了pkcζ 定向磷酸化的特异性和调控性的分子机理。
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中图分类号：Q7 文献标识码：A 文章编号：1000–2588(2000)01–0001-06
蛋白磷酸化无论对于调节神经兴奋还是其他非神经过程，都是非常重要的。离子通道的磷酸化能够改变通道蛋白的表达和动力学特性，是调节膜兴奋性的关键[1]。生化和电生理研究提示了含离子通道以及密切相关的蛋白激酶和蛋白去磷酸化酶的信号复合物的存在[2]。这种离子通道 磷酸激酶/去磷酸化酶复合物，为信号传递的特异性和调控性提供了必要的生物大分子结构基础[3,4]。丝氨酸-苏氨酸磷激酶(如PKC和PKA)可使许多离子通道磷酸化[5]。但PKC和PKA对离子通道蛋白进行修饰，特异定向和活性调控的分子机制尚不十分清楚。
钾离子通道对调节神经兴奋性是十分重要的。在模型系统中，Shaker型钾离子通道被认为与联想记忆有关[7]。钾离子通道的辅助性亚基Kvβ 与钾离子通道的Kvα 亚基特异性结合后有时会产生调控效应[8~10]。哺乳类的Kvβ 2亚基广泛分布于有兴奋活性和无兴奋活性的细胞中，神经细胞中的Shaker钾离子通道的分子构成比为(Kvα)4 (Kvβ)4[11]。
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1 ZIP1和ZIP2基因的分子克隆
为了寻找具有与钾离子通道结合功能的蛋白，我们用全序列的Kvβ 2在酵母双杂交文库(源自大鼠海马的mRNA)中进行筛选。与Kvβ 2结合的克隆包括若干不同长短的Kvβ 2 cDNA片段[12]。此外，我们发现两个cDNA片段，B20和B24，编码了两个以前未知的Kvβ 2结合蛋白。全长cDNA的序列比较显示，除了B24有一段81个碱基(相当于27个氨基酸)的缺失外，B20和B24的序列完全相同。尽管B24从未见报道，但B20与一个以前报道，称为ZIP(PKC-zetα interacting protein)的蛋白完全相同，它可与非典型的pkcζ 同切蛋白结合而被发现[13]，而且它的人同源蛋白，称为A170或p62，已经找到[14]。因此，我们称B20和B24为ZIP1和ZIP2。
我们参照缺失片段两侧的序列设计了引物，用PCR扩增，使源自ZIP1和ZIP2的DNA产物大小不同[15]。以大鼠小脑mRNA作RT-PCR扩增得到两种DNA片段(图1C，带5)。此两片段的泳动性和以ZIP1和ZIP2为模板克隆得到的PCR产物的泳动性相同，并分别对应ZIP1和ZIP2的编码序列(图1C，带2至带4)。由此证明，ZIP1和ZIP2互为剪切异构体，且均存在于脑组织内。两者的结构均含有几个蛋白结构域，提示它们的生化特性(图1A和B)。氨基末端的酸性结构簇是一新的结构域，与酵母中的CDC24片段相似，且在许多蛋白中均有发现，这些蛋白源自在进化上相距甚远的生物，从细菌到哺乳类动物皆有。所有这些蛋白都含有一个特征性的序列模式(Y/W)XDXXGD(L/F)(V/I)。锌指结构域含有三个CXXC结构簇和一个DYDL讯号[16,17]。PEST和UBA结构域参与调控蛋白的更新，其方式为编码蛋白稳定性和引导蛋白降解。另外，PEST序列还可与钙调节蛋白结合。
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ZIP是从大鼠脑cDNA文库中找到的，但它的表达却并不仅限于神经系统。在所有组织中，均可检测到一个相对分子质量为69 000的多肽(图1D)。与大多数组织不同的是，在中枢神经系统的组织中都检测到两条带，相对分子质量分别为69 000和66 000。如将检测纯化的GST-ZIP1融合蛋白先结合，则检测不到这两条带[19]。这两条多肽链的大小与ZIP1和ZIP2完全一致，但并不排除这两条带是蛋白合成后不同修饰的产物。我们用RT-PCR检测了 ZIP1和ZIP2的表达量和相对比例。在非可兴奋组织中，ZIP1的量比ZIP2明显要高，而在中枢神经系统组织中，ZIP1/ ZIP2的比例却接近1(图1D)。ZIP蛋白的表达量也因时而变。小脑是ZIP蛋白表达水平较高的区域(图2C)，ZIP蛋白的表达在出生后第13天达到高峰(图1E)。在出生后发育过程中，两个ZIP多肽的表达水平和相对比例都各不相同，RT-PCR也检测到ZIP1在出生后有所增加(图1E)。
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图1 A ZIP 蛋白结构域组成的示意图
B ZIP1 和 ZIP2 的一级结构推测的蛋
白磷酸激酶C 反应部位标以*蛋白结构域
和ZIP2 中缺失的27 个氨基酸区域以黑底白
字显示C 以RT-PCR 检测ZIP1 和 ZIP2
的转录产物[15]用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
RT-PCR 产物PCR 的DNA 模板为克隆的
ZIP1 带2 和 ZIP2 带3 的cDNA ZIP1
和 ZIP2 的c DNA 的1:1 混合带4 及
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源自小脑mRNA 的RT-PCR 产物带5
D 免疫印迹实验从各种组织中检测到一
种或多种ZIP 蛋白从所标示的各种组织中
制备了总蛋白匀浆用100 mg 的蛋白加样
以兔抗- ZIP 的抗体检测ZIP 多肽[8~26]在大
部分组织中检测到一个相对分子质量为69
000 的多肽该信号可由纯化的GST- ZIP1
蛋白特异性阻断将抗体先GST- ZIP1 孵
温则检测不到此69 000 多肽下图
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RT-PCR 检测来自所示组织中的mRNA 方
法详见15 ZIP1/ZIP2 之比列在图的下方
E 以出生后不同天数的大鼠小脑制备匀
浆用SDS-PAGE 分离等量匀浆再用抗- ZIP
抗体作免疫印迹检测出生后的天数标在上
方ZIP1/ZIP2 之比标在下方
2 ZIP蛋白与钾离子通道和磷酸激酶Cz 的结合
我们用酵母双杂交方法检测了ZIP和钾离子通道各亚基的结合。钾离子通道a -β复合物的形成是由Kva 亚基的T1结构域和Kvβ亚基的保留核心区域所介导的[8~10]。ZIP1和ZIP2，既与Kvβ1结合，又与pkcζ 结合，但不与ShB的Kva 亚基的氨基末端结构域结合，而这个氨基末端的结构域可与Kvβ结合。由此可见，ZIP是通过Kvβ亚基而与钾离子通道相联的。ZIP1和ZIP2可自联或互联为同型多聚体或异型多聚体(图2A)。在不加去垢剂的大鼠脑浆中，其可溶性蛋白复合物含有ZIP多聚体，相对分子质量640 000，半径大于6.1×10-9 m的球蛋白复合物[20]。纯化的ZIP GST-cdc结构域本身也为多聚体[13]。
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为了直接证明Kvβ2和ZIP之间的结合，我们将GST ZIP蛋白在大肠杆菌中表达后纯化，并与Affigel树脂加入过量HA标记的表达于哺乳动物细胞中的Kvβ2，将二者在一起孵温，以检测二者的结合[15]。GST-ZIP1-Affigel树脂和GST-ZIP2-Affigel树脂，均将HA标记的Kvβ2沉淀(带7和11，图2B)，而对照组GST-PDZ3-Affigel树脂却未见沉淀(带6和10，图2B)。
ZIP 既能与pkcζ 结合，又能与Kvβ2结合，这使我们设想，在pkcζ -ZIP-Kvβ2复合物中，ZIP发挥的是联结物的作用。以大鼠全脑作连续水平切片，再以Kvβ2，ZIP1和 pkcζ 的正链(右列)和负链(左列)探针作原位杂交，结果发现这三者的mRNA分布区域是重迭的，尤其是在海马的锥体细胞和小脑的浦肯野氏细胞中，它们的分布远较脑的其它部位为高。
以成年大鼠小脑制备加入去垢剂的蛋白匀浆，进行免疫共沉淀实验。用Kvβ2， ZIP和pkcζ 的特异性抗体沉淀蛋白复合物，三种抗体均可沉淀含有Kvβ2，ZIP和pkcζ 的蛋白复合物，然而，在小脑中富含的另一无关蛋白Translin, 存在于粗制可溶性匀浆中，上述三种抗体无一能使之沉淀。据认为ZIP与pkcζ可特异结合[13]。与此结果一致，上述三种抗体无一能够沉淀PKCβII(图2D)。尽管Kvβ2-ZIP-pkcζ 复合物分子构成比尚未不清楚，但在小脑可溶性提取物中，69 000多肽被更为有效地免疫共沉淀，提示两种ZIP多肽对 Kvβ2和pkcζ 的结合有潜在差异。
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3 ZIP 蛋白介导的对Kvβ2磷酸化的刺激
以无磷的培养液培养哺乳动物cos7细胞，将编码Kvβ2和pkcζ 的DNA表达为与HA连接的融合蛋白[21]。用pkcζ 或Kvβ2转染的cos7细胞制备可溶性蛋白匀浆，将二者混匀，再以抗HA的单克隆抗体沉淀这两种蛋白。加入[33p]-r-ATP后，pkcζ 导致了Kvβ2亚基的基础磷酸化。当纯化的重组GST-ZIP1加入反应物中后，Kvβ2的磷酸化被激活提高了9倍以上，而GST-ZIP2的激活只提高了不足2倍(n=5, 图3A)。以pkcζ 酶的常用底物髓鞘基本蛋白(MBP)实验，无论在有无GST-ZIP1，GST-ZIP2或GST-PDZ3(对照)的情况下，MBP的磷酸化水平相差无几。因此，ZIP 介导的对pkcζ 的刺激对底物是有选择的，似乎仅限于与ZIP 结合的蛋白如Kvβ2。ZIP1和ZIP2之比因组织而异，有显著差别，提示ZIP1和ZIP2有不同的功能，的确，GST-ZIP1刺激Kvβ2磷酸化的活力较GST-ZIP2明显为强，它们的时程曲线可由两个指数参数模拟(图3c)。
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图2 (A)酵母双杂交实验结果综览。实验筛选出兼有GAL4-DB和GAL4-TA质粒的转化体，并让它们在组氨酸培养基上生长。(+)为生长，(- )为不长。用´ -Gal检测β-半乳糖苷酶，在前30 min呈现蓝色为(+++)，在前2 h呈现蓝色为(++)。(B)GST-ZIP1或GST-ZIP2与HA- Kvβ2的亲和性结合。将GST–ZIP1，GST-ZIP2，或PSD95的GST-PDZ3与Affigel交联，再与来自HA-Kvβ2转染的细胞的可溶性匀浆孵温[27]。未结合物(带4、5、8、9)和结合物(带6、7、10、11)均以SDS-PAGE分离，并用抗-HA抗体检测。样品标示在胶的上方。(C)原位杂交检测编码Kvβ2，ZIP1/2和pkcζ 的mRNA(28)。成年大鼠小脑水平面切片，以地高辛标记的负链(左列)和正链(右列)探针杂交。各种核酸探针以全序列cDNA反转录而成。(D)以GST- Kvβ2和GST-ZIP1制备抗血清，并用亲和层折法纯化，在免疫印渍检测中，这两种抗体和市售的抗-pkcζ 抗体均检测到Kvβ2，ZIP1/ZIP2和pkcζ 多肽，大小与预测相符。免疫印渍的信号可由相应的抗原阻断[29]。用成年大鼠小脑可溶性提取物作免疫共沉淀实验[30]。抗体沉淀的复合物以SDS-PAGE分离，再用免疫印迹检测。各列所用作免疫沉淀的抗体示于上方，小脑可溶性提取物作为原料，并列作为对照比较，右侧所示为用于免疫印迹的抗体，左侧所示为相对分子质量大小的标记。
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以定量的Kvβ2和pkcζ ，加入浓度递增的纯化GST-ZIP1或GST- ZIP2，测定Kvβ2的磷酸化，GST-ZIP1和GST- ZIP2的EC50值较接近，分别为(1.3± 0.4)μmol/L(n=4)和(2.1± 0.4) μmol/L(n=4)。然而，GST-ZIP1的最大刺激值比GST- ZIP2大7.4倍(图4)。在酵母双杂交系统中，ZIP1 和ZIP2对Kvβ2和pkcζ 的结合力相近(图2A)[13]。共免疫沉淀实验提示这种刺激的差异可能缘于它们结合力的潜在差异，这种差异是由于蛋白翻译后的不同修饰所致，实验结果如图2D。
图3 ZIP对Kvβ2亚基pkcζ 磷酸化的刺激 。(A)Kvβ2的体外磷酸化。以抗-HA沉淀Kvβ2 和pkcζ ，加入1 μmol的GST融合蛋白后，检测磷酸化[21]。磷酸化的蛋白以放射自显影来显示，反应所加入的蛋白列于胶的上方，Kvβ2的信号由磷酸显影计量，以不加pkcζ 和GST融合蛋白时Kvβ2的信号为标准，列于下方。(B)髓鞘基本蛋白(MBP)的磷酸化，以同样方法进行测定[29]。(C)ZIP介导的pkcζ 对Kvβ2不同程度刺激的磷酸化。Kvβ2磷酸化的时程测定如[21]，但反应在加入1 μmol纯化的ZIP1 和ZIP2后在4°C进行。数据以方程A[1-exp(- t/Υ1 )]+B[1-exp(- t/Υ2)]得到最佳回归，g 1 和g 2为两个不同的时间常数。对GST-ZIP1(n=3)而言，A=0.33±0.040，B=0.69±0.037，Υ1 =(1.3±0.35)min，Υ2=(2.6±3.9)min；对GST-ZIP2而言，A=0.12±0.037， B=0.10±0.059，Υ1=(40±34)min，Υ2=(4.3±3.0)min。
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在高浓度的GST-ZIP达到刺激高峰后，ZIP介导的刺激呈现一个可重复的下降相(图4)。加入相同或高浓度的对照GST融合蛋白如PSD-95的GST-PDZ3，ZIP介导的最大刺激不变，表明下降相并非因过量的GST所致。另外，改变pkcζ 或Kvβ2的加入量，可导致ZIP最大刺激Kvβ2磷酸化时浓度的变化[22]。因此，ZIP介导的刺激是通过形成一个包含pkcζ 、ZIP和Kvβ2，分子构成比固定的反应复合物而实现的。以上结果都支持这一观点。因此，高浓度的ZIP，不仅不能达到最大刺激，可能反而破坏了具有功能作用的pkcζ -ZIP-Kvβ2 的最佳比例，例如，组合成低活性的ZIP多聚体。
4 神经生长因子诱导PC12细胞中ZIP1和ZIP2 的不同程度表达
ZIP1和ZIP2是两个剪切异构体，它们刺激Kvβ2磷酸化的能力大不相同。二者的比例或许可由激素刺激来调节，这也许是调控细胞内磷酸化水平的一种方式。神经因子，如神经生长因子(NGF)与调节突触的可塑性和离子通道的活性有关[23]。PC12细胞对NGF的刺激的反应[24]为验证这一假设提供了一个模型系统。
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图4 GST-ZIP刺激pkcζ 对Kvβ2磷酸化的剂量依赖关系。以递增浓度的GST-ZIP1(A)或GST-ZIP2(B)进行体外磷酸化实验。第1至13列分别表示在0，0.0020，0.010，0.020，0.060，0.140，0.200，0.600，1.000，1.400，2.000，3.000和4.000 μmol/L GST-ZIP1或 GST-ZIP2存在时的反应，对Kvβ2磷酸化信号强度进行计量，并以GST-ZIP1的最大刺激值为标准进行规范化(C)。
在没有加NGF时，ZIP1和ZIP2的mRNA都可以检测到。在加入NGF后不到24 h，ZIP1/ZIP2之比从0.2升至1.0(图5A)，ZIP蛋白表达增加了大约30倍。经NGF刺激，66 000的ZIP2信号增强，同时69 000的ZIP1也增加(图5B)。在NGF刺激后72 h，69 000与66 000之比从没有NGF时的0.1增至0.8，这与ZIP1/ZIP2 mRNA比例的变化相一致。然而，在NGF刺激下，Kvp2 蛋白几乎没有变化；pkcζ 蛋白有轻微变化(图5B)。这些结果表明，ZIP1和ZIP2，均存在于同一种细胞内，并可形成异型多聚体，而且这种异型多聚体的分子构成比可被调控。
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以递增浓度的纯化GST-ZIP1加入固定浓度的GST- ZIP2，我们测定了Kvβ2 的磷酸化。在GST-ZIP2存在时，整个EC50值逐渐移向低浓度的GST-ZIP1(图5C)。例如，当加入定量的1 μmol GST-ZIP2时，GST-ZIP1的EC50值降低了大约10倍，从(1.3± 0.4)μmol (n=4)降到(0.18± 0.05)μmol(n=4)(图 5C)。尽管GST–ZIP2本身的确也有刺激活性，但水平相当低。不同浓度GST-ZIP1+1.0 μmol GST- ZIP2刺激Kvβ2磷酸化的实验数据所得曲线和不同浓度GST-ZIP1和1.0 μmol GST-ZIP2各自分别刺激Kvβ2磷酸化的数据相加所得的虚拟曲线(图5D)。EC50值的降低和剂量反应曲线的形状改变，均表明二者联合的刺激活性并非由二者单独的刺激活性线性相加而成。由酵母双杂交实验检测到的 ZIP1和ZIP2之间的异型多聚体结合(图2A)，支持GST-ZIP1和GST-ZIP2之间存在功能性结合的观点。
我们的结果揭示，ZIP作为一个联结蛋白，将pkcζ 定向至Kvβ2。ZIP1和 ZIP2，两个剪切异构体蛋白，具有不同活力以刺激pkcζ 对Kvβ2的磷酸化。它们自身及相互结合，形成同型多聚体和异型多聚体的能力，可解释只有在ZIP1和 ZIP2都存在的情况下才出现的协同刺激活性(图5C)。在各种组织和细胞中，对ZIP1活力的调控，并不仅仅局限于不同的时间和空间表达，ZIP1/ZIP2之比也具有组织特异性。而且，在同种细胞中，由于神经因子的刺激，ZIP1/ ZIP2之比被动态地调控。
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图5 (A)从未受刺激和经神经生长因子刺激的PC12细胞中提取的DNA作RT-PCR的结果。分别在神经生长因子刺激后24，48，72 h收集细胞[31]。ZIP1/ZIP2之比列于下方。(B)Kvβ2 ，ZIP1/2和pkcζ 蛋白的免疫印渍实验，从未受刺激和经神经生长因子刺激后不同时间收集的PC12细胞中提取蛋白，以等量蛋白(100 μg)上胶，用于检测的第一抗体列于下方。(C)定量GST-ZIP1对Kvβ2磷酸化的刺激作用(n=4)。(D)将1 μmol GST-ZIP1对Kvβ2的磷酸化值，与不同浓度GST-ZIP1对Kvβ2的磷酸化值分别相加，产生一条虚拟曲线(实线)，与根据相同条件下实验数据绘制的曲线进行比较。
在激素刺激下，PKC蛋白的再分布，是关系PKC特异性和活性的一个关键步骤[25]。我们的结果提示，在PKC分布改变后，随之而来的一个步骤也许涉及蛋白复合的特异和动态聚合，以便准确无误地传递激素的信号给特定的蛋白以进行共价键修饰。两个ZIP蛋白和它们生化功能的发现，为此提供了一个分子机制。据此机制，PKC对离子通道蛋白的磷酸化，可以在转录时和翻译后，进行调控和精细调节。
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参考文献和注释
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[10]S. Sewing, J. Roeper, O. Pongs, Neuron 16, 455(1996).
[11]D.N. Parcej, V.E.S. Scott, J.O. Dolly, Biochemistry 31, 11084(1992).
[12]J. Xu and M. Li, J. Biol. Chemm. 272, 11728(1997); J. Xu, W. Yu, J. Wright, R. Raab, M. Li, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1846(1998); P. M. Chevray and D.Nathans, ibid. 89, 5789(1992); S. Fields and O. Song, Nature 340, 245(1989); J. Xu and M. Li, Methods Enymol. 293, 1(1998).
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[13]A. Puls, S. Schmidt, F. Grawe, S. Stabel, Proc. Natl. Acad. Sce. U.S.A. 94, 6191(1997).
[14]L. Joung, J. L. Shin, ibid. 93, 5991(1996); T. Lshii et al., Biochem. Biochem. Biophys. RES. Commun. 226, 456(1996).
[15] 用PGEX4T2载体(Pharmacia Biotech, Indianapolis, IN), 参照标准步骤，表达GST-ZIP1和GST-ZIP2融合蛋白。用包含12CA5(抗原决定簇与氨基末端相连的PCMV载体表达HA标记蛋白。除非特别指出，一般均从第二个氨基酸开始表达完整的编码序列。用所示来源的组织或细胞进行RT-PCR实验。用TRIZOL(GIBCO-BRL，RocKville, MD)，以50 mg的组织(或从3.5-cm培养皿中收集的PC12细胞)制备RNA，按厂商提供的操作步骤，以2 m g RNA合成cDNA，用下列4种引物进行PCR扩增：ML1654，ML1659，ML1653和ML1553。如有需要，我们可提供所有引物序列。以ML1654/ML1659配对的引物进行扩增，ZIP1的产物片段为303 bp，ZIP2的产物片段为222 bp；而以ML1653/ML1553配对的引物进行扩增，ZIP1的产物片段为473 bp，ZIP2的产物片段为392 bp。从两对引物得到的结果是相同的，以ML1653/ML1553得到的结果没有在此发表。PCR的操作步骤包括在92oC变性1 min，在55 oC退火1 min，在68℃扩增30 s，共循环20次。
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[16]C.P. Ponting, D. J. Blake, K. E. Davies, J. Kendrick-jones, S. J. Winder, Trends Biochem. Sci. 21, 11(1996).
[18]Single-letter abbreviations for the amino acid residues are as follows: A, Ala; C, Cys; D, A7p; e, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; l, lle; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P,Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; and Y, Tyyr. X indicates any residue.
[18]K. K. Wang. A. Villalobo. B. D. Roufogalis, Biochem. J.263(1989).
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[19] J. Gong et al., unpublished data.
[20] 无去污剂的细胞匀浆的制备，参照(30)所述的缓冲液条件和步骤进行，只是没有加入去污剂。依照发表过的操作方法[J.Biol.Chem.272, 705(1997)], 做凝胶过滤层折。
[21] 体外磷酸化：用在哺乳类表达的质粒转染cos7细胞，24 h后换成无磷酸培养液，48 h后收集细胞，细胞以Hepes缓冲生理盐水(140 mmol Nac1，2.7 mmol KC1和15 mmol Hepes，pH7.4)和1% Triton X-100制成匀浆后，以10 000 g离心5 min。加10 m l蛋白G琼脂糖颗粒于提取物中，这种颗粒已与抗HA抗体交联。收集颗粒并用Hepes缓冲生理盐水洗三次，然后将沉淀物溶解在20 m l激酶缓冲液内(35 mmol Tris-Hc1, pH7.5, 10 mmol MgCl2, 0.5 mmol EDTA, 0.1mol CaCl2, 和1 mmol phenyl phosphate)。向反应中加入所示剂量的GST-ZIP蛋白或对照物蛋白后，以5 m l磷脂酰丝氨酸 (1 mg/ml)和0.5 m l 33 p-r-ATP(10 370MBq) 激活磷酸化反应，除非特别指出，所有的磷酸化反应是在30 ℃进行30 min。以SDS上样缓冲液终止反应。将样品煮沸5 min后，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用柯达科学成像胶片检测磷酸化蛋白的放射自显影，用磷光成像仪(FUJIX BAS 1000，Fuji, Tokyo)检测放射性的相对剂量。
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[22] J. Cong et al., unpublished data.
[23] M. Bothwell, Annu. Rev. Neurosci. 18, 223(1995).
[24] L. A. Greene and A. S. Tischler, Proc,Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 2424(1976).
[25] D. Mochly-Rosen, Science 268, 247(1995).
[26] 将大鼠ZIP1和Kvb 2的全长序列cDNA表达为GST融合蛋白，以兔子进行免疫，制备抗-ZIP和抗-Kvb 2的抗体。抗–pkcζ 和抗-pkcb II抗体购于Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)公司。
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[27] 参照于等人[10]的操作步骤，将HA标记的Kvb 2暂时转染，用HA- Kvb 2和空白对照质粒转染的细胞制作匀浆，用Affi-Gel10 (Bio-Rad, CA)和GST对照，GST-ZIP1和GST-ZIP2蛋白连接，在含有20 mmol Hepes(pH7.5), 150 mmol NaCl, 1 mmol EDTA, 1 mmol 2-mercaptoethanol的缓冲液中，用20 m l 的颗粒和100 m l细胞匀将进行结合反应实验。在冰上反应1 h后，把颗粒洗三次，在SDS上样缓冲液中煮沸颗粒，以解离它上面的结合物，将结合物在SDS胶上分离后，再以抗-HA抗体作免疫印迹检测Kvb 2的结合。
[28] 用地高辛-RNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim, Indianapolis, 1N)进行原位杂交实验。简而言之，酶切含有全序列大鼠Kvb 2，ZIP1和pkcζ 的cDNA克隆，以制备核酸探针合成的DNA模板。质粒切成线状后，用体外转录的方法制备地高辛标记的RNA探针。用成年SD大鼠检测Kvb 2，ZIP1/2和pkcζ 的mRNA的表达。动物麻醉后处死，立即将全脑移出，用4%多聚甲醛固定2 h，用冷冻切片机切成12 m m 的冷冻切片，复温贴附在Saperfrost Plus的载玻片上，空气干燥。配制各种溶液的水均为去离子H2o 加0.1%(V/V)焦碳酸二乙酯，并高温消毒。切片浸入4%多聚甲醛(PBS配制， pH7.4)固定，然后用PBS洗2次。在经蛋白酶K处理后，切片再用4%多聚甲醛固定。将切片浸入含有0.25%乙酐的0.1 mol三乙醇胺溶液，进行乙酰化。用1% Triton X-100渗透，再用PBS洗两次。用预杂交液(50%甲酰胺，5XSSC, 5X Denhardt’s溶液，, 250 m g/ml酵母tRNA,和500 m g/ml Salmon精子DNA)在4℃过夜进行预杂交。将切片与含有1 m g/ml cDNA探针的杂交液在65 oC的潮湿盒内过夜，杂交后再按先后顺序浸入0.2XSSC两次，缓冲液 1(0.1mol Tris pH7.5, 0.15mol Nacl)两次。用缓冲液2(含1%失活的正常羊血清的缓冲液1)配制1:2 000抗一地高辛抗体溶液，与切片在4 oC反应过夜。切片用缓冲液1和缓冲液3(0.1mol Tris pH9.5, 0.1mol NaCl和50 mmol MgCl2)洗后，用5 ml显色缓冲液(0.1mol Tris pH9.5, 0.1mol NaCl和50 mmol MgCl2)配制含 1.2 mg Levamisole和300 m l NBT/Bclp的溶液，用以显色。
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[29] J. Gong et al., unpublished data.
[30] 用成年大鼠小脑提取液作免疫沉淀实验，以大鼠小脑在匀浆缓冲液[10 mmol Tris HCI pH8.0, 1% Triton X-100, 0.15mol NaCl, 1 mmol EDTA, 10 mmol NaN3和混合蛋白酶抑制剂(1 mmol phenyl methyl sulfonyl fluoride, 1 m g/ml leapetin, 2 m g/ml aprotinin,和1 m g/ml pepstatin)]中，用Dounce匀浆器在4%匀浆，缓冲液和组织之比为每克组织加入8 ml缓冲液，在研磨20次后，以10 000 g离心5 min，收集上清液。在1 ml(PBS溶液中，用40 m l蛋白A颗粒(Sigma Chemical, St . Louis, Mo)和20 m l抗血清在4%反应过夜，以便将抗体和蛋白A颗粒连接。移去未结合物后，用PBS洗琼脂糖颗粒3次，悬浮于500 m l 0.2 mol/L硼酸钠(pH9.0)中，加入 dimethyloime limidate至 20 mmol/L的终浓度，启动交联反应。在室温下反应30 min后，加入500 m l 0.2 mol/L乙醇胺终止交联反应。与乙醇胺反应2 h后，用PBS洗交联后的蛋白A-琼脂糖颗粒3次。用200 m l可溶性匀浆与10 m l抗体-蛋白A琼脂糖颗粒孵温以进行抗体结合实验。在4oC过夜反应后，从5 000 g 离心2 min，收集琼脂糖颗粒，并用PBS洗3次，将10 m l 2XSDS上样缓冲液加入各蛋白A沉淀物中，在100 oC煮沸5 min，以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中可溶性蛋白。用所标示的相应抗体作免疫印渍，检测免疫沉淀的多肽。
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[31]PC12细胞培养和神经生长因子的刺激，基本按照(24)所述进行，简单地说，把105细胞种于3.5 cm的培养皿内，让细胞在含10%(V/V)小牛血清和5%(V/V)热失活马血清的培养液中生长24 h，加入纯化的神经生长因子至终浓度为0.1 m g/ml，以启动神经生长因子的刺激。让细胞生长72 h，收集细胞，进行实验。
[32] We thank D. Ginty for providing purified NGF, a. Lanahan and P. Worley for Cdna libraries, J. Baraban for anti-translin antibody, Y. Ono for rat pkcζ Cdna, l, Roman for in situ hybridization technique, M. Regan for RT-PCR technique, S. Wang for the control GST FUSION PROTEIN AND R. Butzner for help with manuscript preparation. We also thank C. Montell, P. Gillespie, and members of the Li Lab for comments on this manuscript. M.B. was a NSF predoctoral fellow. R.H. is supported in part by a postdoctoral fellowship from American Heart Association. M.L. is supported by a grant from NIH (NS33324) and an American Heart Association-Pfizer award.
[33] This is not an official Chinese translation by the staff of SCINECE, nor is it endorsed by SCIENCE as accurate. Rather, this translation is entirely that of the publisher. In crucial matters please refer to the official English-language Version originally printed in SCIENCE., http://www.100md.com