细胞因子体外扩增脐血CD+34细胞移植SCID鼠人类免疫功能的建立
作者：仇志根 范华骅 高峰
单位：仇志根(上海市血液中心输血研究所(上海市，200051))；范华骅(上海市血液中心输血研究所(上海市，200051))；高峰(上海市血液中心输血研究所(上海市，200051))
关键词：脐血；体外扩增；移植；SCID鼠
临床血液学杂志000105 摘要：目的：探讨扩增的脐血CD34细胞体内造血功能。方法：FLT3配体联合血小板生成素体外培养脐血CD+34细胞2～3周后移植SCID鼠，采用FCM检测SCID鼠骨髓、外周血、脾脏中的人类CD45、CD3、CD19抗原。结果：脐血CD+34细胞扩增10～37倍，移植6.6×104～6.9×105脐血CD+34细胞于SCID鼠，6周后10只SCID鼠骨髓中均检测到人类CD45抗原(0.2%～4.0%)，6只SCID鼠外周血、脾脏中检测到人类CD3抗原(0.1%～2.3%)，3只SCID鼠中外周血、脾脏中检测到人类CD19抗原(0.3%～1.3%)。结论：FLT3配体联合血小板生成素体外扩增的脐血CD+34细胞能重建SCID鼠人类免疫功能。
, 百拇医药
Engraftment of severe combined immunodeficient mice transplanted with ex vivo-expanded human CD+34 cord blood cells
QIU Zhi-gen FANG Hua-hua GAO Feng
(Shanghai Institute of Blood Transfusion of Shanghai Blood Center,200051)
Abstract：Objective：To explore the hematopoietic function of cytokine-expanding CD+34 cells from umbilical cord blood in vitro.Method：Cord blood cells expanded with FLT3(FMS-like tyrosine kinase 3)-ligand and thrombopoietin were transplanted in SCID(severe combined immune-deficient)mice. Human mature cell surface markers were detected with flow cytometry and used as indicator of succeeding transplantation.Result：After 2 and 3 weeks culture,the number of CD+34 cells increased approximately 10 and 37 folds. After transplantation with 6.6×104 to 6.9×105 CD+34 cells,respectively the percentage of human CD+45 cells in the bone marrow of all 10 SCID mice is 0.2%～4.0%. The percentage of human CD+3 cells in the peripheral blood and spleen of 6 SCID mice is 0.1%～2.3%. The percentage of human CD+19 cells in the peripheral blood and spleen of 3 SCID mice are 0.3%～1.3%.Conclusion：CD+34 cells expanded with FLT3-ligand and thrombopoietin are potential engraft used for reconstitution of both hematopoietic and immunologic function of SCID mice.
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Key words：Umbilical cord blood Expanion in vitro Transplantation SCID mice▲
脐血中含有丰富的造血干细胞。脐血移植已成功地应用于临床治疗白血病等病人。由于脐血量较少，造血干细胞绝对数少，成人移植成功的机会较儿童低，移植后中性粒细胞的恢复较慢〔1〕。因此，脐血造血干细胞的体外扩增已成为研究热点。近年来，国外许多学者采用FLT3配体(FL)，血小板生成素(TPO)，干细胞生长因子(SCF)等体外培养脐血CD+34细胞，结果使CD+34细胞得到了不同程度的扩增〔2，3〕。本课题采用SCID鼠作模型，探讨扩增的脐血CD+34的体内造血功能。
1 材料与方法
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1.1 细胞和动物来源
无菌采集正常足月新生儿脐血，肝素抗凝，Ficoll-Hypaque分离单核细胞，洗涤备用。SCID鼠来自中国科学院上海药物研究所，鼠龄6周，雌性，饲养于无菌层流室内，饲料、饮水及垫料均经高压灭菌。
1.2 CD+34细胞分离纯化
利用吸附单克隆抗体——磁珠分离系统(MACS，德国Miltenyi Biotec Inc产品)。抗CD34抗体为QBENO-10，磁珠为羊抗鼠IgG1免疫磁珠，标记细胞通过置于磁场中的分离柱，洗涤去除CD-34细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD+34细胞，流式细胞仪(COULTER EPICS ELITE ESP)检测CD+34细胞。
, 百拇医药
1.3 CD+34细胞体外培养
IMDM培养基中含有10%新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)，rhu TPO 4万U/L(Stem Cell产品)，rhu FL 100 μg/L(Stem Cell产品)，接种细胞浓度为5×107/L，置37℃ CO2孵箱中培养，每周半量换液2次，取非粘附细胞计数。FCM检测细胞表面标记。
1.4 移植
取SCID鼠10只，经尾静脉注入0.1 ml扩增的脐血CD34细胞，观察6周，7周，8周，9周，10周后处死，取骨髓、外周血、脾脏(经压片后用Ficoll-Hypaque分离成单核细胞)，FCM检测CD45，CD3，CD19。
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1.5 细胞表面标志的流式细胞仪分析
结合有PE或FITC的鼠抗人单克隆抗体CD34，CD45，CD3，CD19，CD4/CD8(均为IgG1，Immunotech产品)，标记方法按产品说明书，FCM检测。
2 结果
2.1 输入扩增的造血干细胞数量
2份脐血经MACS分离纯化后，CD+34细胞纯度分别为78.1%和74.0%，FL联合TPO体外无基质培养2周和3周，非粘附细胞扩增44倍和256倍，CD+34细胞扩增11倍和37倍，CD+34CD-38细胞扩增7.5倍和34倍，CD+34细胞占非粘附细胞中的比例分别为19.6%和10.7%，CD+34CD-38细胞占非粘附细胞中的比例分别为13.4%和10.1%。移植SCID鼠CD+34细胞量见表1。
, 百拇医药
表1 移植SCID鼠的脐血CD+34细胞数量 脐血
CD+34细胞
扩增倍数
CD+34
细胞
CD+34
CD-38
非粘附
细胞数
1
, 百拇医药
11
6.9×105
4.8×105
3.5×106
2
37
6.6×104
6×104
6×105
2.2 CD+34细胞的植入
, 百拇医药
移植10只SCID鼠6，7，8，9，10周后，在每只SCID鼠骨髓、外周血、脾脏中均可检测到人类CD45细胞，说明扩增的脐血CD+34细胞已在SCID鼠中植活。见表2。表2 不同移植时间SCID鼠骨髓、外周血、脾脏中人类CD45抗原的检测结果 周次
编号
骨髓
外周血
脾脏
周次
编号
骨髓
外周血
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脾脏
6
1
2
0.2
2.0
ND1)
0.1
ND
1.4
9
1
2
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0.3
0.8
0
ND
0.2
0.3
7
1
2
3.3
1.1
ND
1.7
ND
, 百拇医药
2.5
10
1
2
4.0
0.8
2.2
ND
0.7
1.4
8
1
2
0.9
, 百拇医药
0.2
ND
1.2
ND
0
1)ND未测
2.3 移植后SCID鼠中人类免疫功能的建立
移植10只SCID鼠中，5只SCID鼠外周血、脾脏中检测到人类T细胞CD3抗原(0.1%～2.3%)，3只SCID鼠外周血、脾脏中检测到人类B细胞CD19抗原(0.3%～1.3%)，说明扩增的脐血造血干细胞已在SCID鼠中建立了人类免疫系统。
3 讨论
, 百拇医药
SCID鼠是C、B-17纯系小鼠16号染色体上的SCID基因突变引起的T、B细胞功能联合缺陷，但骨髓造血微环境和胸腺基质完整无损，故该鼠可接受人造血细胞和淋巴组织植入并生长〔4，5〕。国外学者报道，每只SCID鼠移植的CD+34细胞数量为2.74×104～5×105〔6〕，本实验采用扩增的脐血CD+34细胞数量为6×104～6.6×105，移植未经照射的SCID鼠，FCM检测到人类CD45，CD3，CD19抗原，说明SCID鼠植入了扩增的人脐血CD+34细胞。■
参考文献：
[1]Rubinstein P,Carrier L, Scarcdauou A, et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Eng J Med，1998,339：1565～1577
, 百拇医药
[2]Koller M R, Manchel I, Maher R J,et al. Clinical-scale human umbilical cord blood cell expansion in a novel automated perfusion culture system. Bone Marrow Transplantation，1998,21：653～663
[3]Almici C, Carlo-Stella C, Wagner J E, et al. Clonogenic capacity ex vivo expansion potential of umbilical cord blood progenitor cells are not impaired by cryopreservation. Bone Marrow Transplantation，1997,19：1079～1084
[4]Bosma G C, Davisson M T, Ruetsch N R, et al. The mouse mutation severe combined immunodeficiency(scid) is a chromosome 16. Immunogenetics，1989,29：54～57
, http://www.100md.com
[5]Fulop G M,Philips R A. The scid mutation in mice cause general defect in DNA repair. Nature,1990,47：479～482
[6]Hogan C J, Shpall E J, McNulty O, et al. Engraftment and development of human CD+34-enriched cells from umbilical cord blood in NOD/Ltszscid/scid mice. Blood,1997,90：85～96
收稿 1999-04-15
修回 1999-08-09, http://www.100md.com
单位：仇志根(上海市血液中心输血研究所(上海市，200051))；范华骅(上海市血液中心输血研究所(上海市，200051))；高峰(上海市血液中心输血研究所(上海市，200051))
关键词：脐血；体外扩增；移植；SCID鼠
临床血液学杂志000105 摘要：目的：探讨扩增的脐血CD34细胞体内造血功能。方法：FLT3配体联合血小板生成素体外培养脐血CD+34细胞2～3周后移植SCID鼠，采用FCM检测SCID鼠骨髓、外周血、脾脏中的人类CD45、CD3、CD19抗原。结果：脐血CD+34细胞扩增10～37倍，移植6.6×104～6.9×105脐血CD+34细胞于SCID鼠，6周后10只SCID鼠骨髓中均检测到人类CD45抗原(0.2%～4.0%)，6只SCID鼠外周血、脾脏中检测到人类CD3抗原(0.1%～2.3%)，3只SCID鼠中外周血、脾脏中检测到人类CD19抗原(0.3%～1.3%)。结论：FLT3配体联合血小板生成素体外扩增的脐血CD+34细胞能重建SCID鼠人类免疫功能。
, 百拇医药
Engraftment of severe combined immunodeficient mice transplanted with ex vivo-expanded human CD+34 cord blood cells
QIU Zhi-gen FANG Hua-hua GAO Feng
(Shanghai Institute of Blood Transfusion of Shanghai Blood Center,200051)
Abstract：Objective：To explore the hematopoietic function of cytokine-expanding CD+34 cells from umbilical cord blood in vitro.Method：Cord blood cells expanded with FLT3(FMS-like tyrosine kinase 3)-ligand and thrombopoietin were transplanted in SCID(severe combined immune-deficient)mice. Human mature cell surface markers were detected with flow cytometry and used as indicator of succeeding transplantation.Result：After 2 and 3 weeks culture,the number of CD+34 cells increased approximately 10 and 37 folds. After transplantation with 6.6×104 to 6.9×105 CD+34 cells,respectively the percentage of human CD+45 cells in the bone marrow of all 10 SCID mice is 0.2%～4.0%. The percentage of human CD+3 cells in the peripheral blood and spleen of 6 SCID mice is 0.1%～2.3%. The percentage of human CD+19 cells in the peripheral blood and spleen of 3 SCID mice are 0.3%～1.3%.Conclusion：CD+34 cells expanded with FLT3-ligand and thrombopoietin are potential engraft used for reconstitution of both hematopoietic and immunologic function of SCID mice.
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Key words：Umbilical cord blood Expanion in vitro Transplantation SCID mice▲
脐血中含有丰富的造血干细胞。脐血移植已成功地应用于临床治疗白血病等病人。由于脐血量较少，造血干细胞绝对数少，成人移植成功的机会较儿童低，移植后中性粒细胞的恢复较慢〔1〕。因此，脐血造血干细胞的体外扩增已成为研究热点。近年来，国外许多学者采用FLT3配体(FL)，血小板生成素(TPO)，干细胞生长因子(SCF)等体外培养脐血CD+34细胞，结果使CD+34细胞得到了不同程度的扩增〔2，3〕。本课题采用SCID鼠作模型，探讨扩增的脐血CD+34的体内造血功能。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞和动物来源
无菌采集正常足月新生儿脐血，肝素抗凝，Ficoll-Hypaque分离单核细胞，洗涤备用。SCID鼠来自中国科学院上海药物研究所，鼠龄6周，雌性，饲养于无菌层流室内，饲料、饮水及垫料均经高压灭菌。
1.2 CD+34细胞分离纯化
利用吸附单克隆抗体——磁珠分离系统(MACS，德国Miltenyi Biotec Inc产品)。抗CD34抗体为QBENO-10，磁珠为羊抗鼠IgG1免疫磁珠，标记细胞通过置于磁场中的分离柱，洗涤去除CD-34细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD+34细胞，流式细胞仪(COULTER EPICS ELITE ESP)检测CD+34细胞。
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1.3 CD+34细胞体外培养
IMDM培养基中含有10%新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)，rhu TPO 4万U/L(Stem Cell产品)，rhu FL 100 μg/L(Stem Cell产品)，接种细胞浓度为5×107/L，置37℃ CO2孵箱中培养，每周半量换液2次，取非粘附细胞计数。FCM检测细胞表面标记。
1.4 移植
取SCID鼠10只，经尾静脉注入0.1 ml扩增的脐血CD34细胞，观察6周，7周，8周，9周，10周后处死，取骨髓、外周血、脾脏(经压片后用Ficoll-Hypaque分离成单核细胞)，FCM检测CD45，CD3，CD19。
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1.5 细胞表面标志的流式细胞仪分析
结合有PE或FITC的鼠抗人单克隆抗体CD34，CD45，CD3，CD19，CD4/CD8(均为IgG1，Immunotech产品)，标记方法按产品说明书，FCM检测。
2 结果
2.1 输入扩增的造血干细胞数量
2份脐血经MACS分离纯化后，CD+34细胞纯度分别为78.1%和74.0%，FL联合TPO体外无基质培养2周和3周，非粘附细胞扩增44倍和256倍，CD+34细胞扩增11倍和37倍，CD+34CD-38细胞扩增7.5倍和34倍，CD+34细胞占非粘附细胞中的比例分别为19.6%和10.7%，CD+34CD-38细胞占非粘附细胞中的比例分别为13.4%和10.1%。移植SCID鼠CD+34细胞量见表1。
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表1 移植SCID鼠的脐血CD+34细胞数量 脐血
CD+34细胞
扩增倍数
CD+34
细胞
CD+34
CD-38
非粘附
细胞数
1
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11
6.9×105
4.8×105
3.5×106
2
37
6.6×104
6×104
6×105
2.2 CD+34细胞的植入
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移植10只SCID鼠6，7，8，9，10周后，在每只SCID鼠骨髓、外周血、脾脏中均可检测到人类CD45细胞，说明扩增的脐血CD+34细胞已在SCID鼠中植活。见表2。表2 不同移植时间SCID鼠骨髓、外周血、脾脏中人类CD45抗原的检测结果 周次
编号
骨髓
外周血
脾脏
周次
编号
骨髓
外周血
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脾脏
6
1
2
0.2
2.0
ND1)
0.1
ND
1.4
9
1
2
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0.3
0.8
0
ND
0.2
0.3
7
1
2
3.3
1.1
ND
1.7
ND
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2.5
10
1
2
4.0
0.8
2.2
ND
0.7
1.4
8
1
2
0.9
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0.2
ND
1.2
ND
0
1)ND未测
2.3 移植后SCID鼠中人类免疫功能的建立
移植10只SCID鼠中，5只SCID鼠外周血、脾脏中检测到人类T细胞CD3抗原(0.1%～2.3%)，3只SCID鼠外周血、脾脏中检测到人类B细胞CD19抗原(0.3%～1.3%)，说明扩增的脐血造血干细胞已在SCID鼠中建立了人类免疫系统。
3 讨论
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SCID鼠是C、B-17纯系小鼠16号染色体上的SCID基因突变引起的T、B细胞功能联合缺陷，但骨髓造血微环境和胸腺基质完整无损，故该鼠可接受人造血细胞和淋巴组织植入并生长〔4，5〕。国外学者报道，每只SCID鼠移植的CD+34细胞数量为2.74×104～5×105〔6〕，本实验采用扩增的脐血CD+34细胞数量为6×104～6.6×105，移植未经照射的SCID鼠，FCM检测到人类CD45，CD3，CD19抗原，说明SCID鼠植入了扩增的人脐血CD+34细胞。■
参考文献：
[1]Rubinstein P,Carrier L, Scarcdauou A, et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Eng J Med，1998,339：1565～1577
, 百拇医药
[2]Koller M R, Manchel I, Maher R J,et al. Clinical-scale human umbilical cord blood cell expansion in a novel automated perfusion culture system. Bone Marrow Transplantation，1998,21：653～663
[3]Almici C, Carlo-Stella C, Wagner J E, et al. Clonogenic capacity ex vivo expansion potential of umbilical cord blood progenitor cells are not impaired by cryopreservation. Bone Marrow Transplantation，1997,19：1079～1084
[4]Bosma G C, Davisson M T, Ruetsch N R, et al. The mouse mutation severe combined immunodeficiency(scid) is a chromosome 16. Immunogenetics，1989,29：54～57
, http://www.100md.com
[5]Fulop G M,Philips R A. The scid mutation in mice cause general defect in DNA repair. Nature,1990,47：479～482
[6]Hogan C J, Shpall E J, McNulty O, et al. Engraftment and development of human CD+34-enriched cells from umbilical cord blood in NOD/Ltszscid/scid mice. Blood,1997,90：85～96
收稿 1999-04-15
修回 1999-08-09, http://www.100md.com