定量聚合酶链式反应技术检测溃疡创面纤维连接蛋白表达水平的变化
作者：杨银辉 傅小兵 王亚平 孙同柱 盛志勇
单位：王亚平(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037)； 孙同柱(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037)；盛志勇(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037))
关键词：糖尿病溃疡；纤维连接蛋白；定量聚合酶链式反应
中国修复重建外科杂志000107 摘 要：目的 研究纤维连接蛋白在糖尿病患者足溃疡组织中的表达特征与规律，探讨纤维连接蛋白表达量的变化与糖尿病足溃疡发生的关系。方法 取患者溃疡创面及创缘组织为实验组，以患者正常皮肤为对照组，采用定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测纤维连接蛋白mRNA表达水平的变化。结果 在正常皮肤组织和溃疡组织中均存在纤维连接蛋白mRNA的表达，但其表达水平在溃疡组织中显著低于正常皮肤，表达量约为正常皮肤的34%。结论 糖尿病患者足溃疡组织中纤维连接蛋白mRNA表达水平降低，这种转录水平的下调可能是慢性难愈合溃疡发生的机制之一。
, 百拇医药
DETERMINATION OF FIBRONECTIN mRNA EXPRESSION IN PATIENTS WITH DIABETIC ULCERS BY QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTION TECHNIQUE
YANG Yin-hui FU Xiao-bing WANG Ya-ping et al
(Trauma Center, the 304th Hospital of PLA. Beijing, P.R.China 100037)
Abstract：Objective To determine the characteristics and regularity of fibronectin mRNA expression in diabetic ulcers, and to investigate the relationship between the changes of fibronectin mRNA expression and pathogenesis of diabetic ulcer. Methods Biopsies were removed from the margins of diabetic foot ulcers, included surrounding skin as experimental group, and the biopsies from normal skin of the same patients as control group. The mRNA expression of fibronectin was measured by quantitative RT-PCR technique. Results The mRNA expression of fibronectin could be detected in both normal skin and diabetic foot ulcers, but the level of expression in diabetic ulcers was lower than that of normal skin. Conclusion The level of mRNA expression of fibronectin in diabetic ulcers is decreased, which suggest that the down-regulation of transcription may be one of the mechanisms of chronic impaired ulcers.
, 百拇医药
Key words：Diabetic ulcer Fibronectin Quantitative polymerase chain reaction
Foundation item：National Science Foundation of Outstanding Youth of China (39525024)▲
纤维连接蛋白(fibronectin,FN)是存在于血浆和多种组织中起粘附作用的一种糖蛋白，是创伤修复过程中一种重要的细胞基质成份。它能加速血液凝固，对单核细胞和中性粒细胞具有化学趋化作用，能吸引成纤维细胞和内皮细胞向损伤区域移动。临床上应用FN能促进慢性角膜溃疡和静脉溃疡的上皮化[1、2]。我们应用定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检测糖尿病溃疡与正常皮肤中FN mRNA的表达水平，探讨FN mRNA表达水平的变化与糖尿病慢性溃疡发生的关系，为进一步研究慢性难愈合创面发生的分子生物学机制提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验标本选择
糖尿病伴有足慢性溃疡患者5例，其中男3例，女2例。年龄52～68岁。取患者溃疡组织作为标本，包括溃疡创面、创缘及部分周围皮肤组织为实验组；同时取患者正常皮肤作为对照组。
1.2 组织总RNA提取
利用总RNA提取试剂盒(美国Promega公司)，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取组织总RNA，实验操作按试剂盒说明书进行。用变性电泳鉴定RNA未被降解，并用DU-7型可见紫外分光光度计(美国Beckman公司)对RNA进行纯度分析及定量。
1.3 PCR引物序列
依照人FN、β-actin序列，采用以下PCR扩增引物，序列为FN[3]：5′-TGGGAATTCCGGAAGA-
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CAGGA-3′，5′-TTCGGATCCTTCTTGGAGGGC-TGA-3′；β-actin[4]:5′-GAGGGGGAA-ATCGTGCGTGACATCAA-3′,5′-GGAACCGCTCGTTGCC-AATAGTGA-3′。由中国科学院微生物研究所合成，经PAGE纯化。
1.4 定量PCR方法[5～7]
取总RNA 1.6 μg，在反应体系中加入AMV逆转录酶200 nmol/s,42 ℃进行逆转录反应。取逆转录产物cDNA 1.5 μl加入到PCR反应体系中进行PCR扩增。每一反应体系加入FN和β-actin的引物终浓度分别为0.2 μmol/L和0.05 μmol/L,PCR扩增条件为：94 ℃变性1分钟，53 ℃退火1分钟，72 ℃延伸1分钟，共32个循环。最后72 ℃延伸10分钟，4 ℃保存。
1.5 PCR电泳鉴定及产物定量
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取PCR产物10 μl在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察、照相。然后用CS-930薄层扫描仪(SHIMADZU)扫描各条带的吸收峰面积，所得数据以均数±标准差表示，并计算FN与β-actin吸收峰面积比。
2 结果
2.1 引物浓度的选择
在同一反应体系中同时扩增两种基因，由于编码两种物质的mRNA水平不同，因此扩增效率也不同。β-actin在组织中的含量高，在同时扩增FN与β-actin时，主要扩增β-actin，而FN的带很弱。根据FN与β-actin的mRNA含量及其扩增片段大小，将FN与β-actin的引物浓度选择为4∶1，使PCR产物与其基因表达水平之间呈线性关系。
2.2 最适循环数的选择
循环数的正确选择是PCR技术成功与否的重要条件。循环数在合适的范围内时，PCR产物才与循环数之间有较好的线性关系，对产物进行定量才有意义。我们研究了不同循环数与FN及β-actin表达量的关系，分别在循环数为26、28、30、32及34时取样，产物在2%琼脂糖凝胶进行电泳(图1)，并进行扫描定量，结果见图2。从图2中可知，在循环数小于32时，PCR产物与循环数之间呈线性关系。因此，我们选择PCR循环数为32。
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图1 不同循环数PCR产物电泳图
1：PCR Markers 2～6:循环数分别为26、28、30、32及34
Fig. 1 PCR products amplified from different number of cycles lane
1:PCR Markers lane 2～6:26、28、30、32、34 cycles of amplification
图2 不同循环数对PCR产物的影响
Fig. 2 The effect of different number of cycles on PCR products
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2.3 最适模板量的选择
与循环数一样，模板量只有在一定的范围内，PCR产物与基因的表达量才成正比，定量才有意义。为了避免RNA降解造成的影响，我们采用同一反应体系的RT产物作模板。分别取逆转录产物1、2、3、4及5 μl扩增(相当于总RNA 80、160、240、320及400 ng)，PCR产物各取10 μl进行电泳(图3)，并扫描定量(图4)。从图4可以看出，FN与β-actin的扩增动力学相似，在模板量小于4 μl时，PCR产物与模板量之间呈正比。因此，我们选择实验模板量为160 ng。
图3 不同模板量PCR产物电泳图
1：PCR Markers 2～6：模板量分别为80、160、240、320及400 ng总RNA
, 百拇医药
Fig. 3 PCR products amplified from different amount of total RNA lane
1:PCR Markers lane 2～6:PCR products from
80、160、240、320、400 ng of total RNA
图4 不同模板量对PCR产物的影响
Fig. 4 The effect of different amount of
total RNA on PCR amplification
2.4 样品FN mRNA表达水平检测
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利用RT-PCR，以模板量为1.5 μl,循环参数为32进行扩增，分别从溃疡组织和正常皮肤组织中得到FN和β-actin的扩增产物(图5)，对扩增产物进行扫描定量，结果见附表。从附表中得知，糖尿病溃疡创面有FN表达，其表达量较正常皮肤组织明显减少。
图5 实验标本的PCR结果
1：PCR Markers 2:对照组 3：实验组
Fig. 5 PCR products of biopsies
lane 1:PCR Markers lane 2:Control group lane 3:Experimental group
附表 实验组与对照组FN mRNA表达水平(n=5,
±s)
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Tab. The mRNA expression levels of fibronectin in
experimental group and control group (n=5,±s) 组 别
Groups
FN
β-actin
FN/β-actin
对照组
Control group
0.067±0.003
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0.135±0.008
0.496
实验组
Experimental
group
0.039±0.012
0.228±0.014
0.171
3 讨论
糖尿病、下肢静脉曲张、放射性皮肤损伤等疾病所致的溃疡，常经久不愈，进而形成慢性难愈合创面，它不仅给患者带来极大的痛苦，同时也是创面愈合中尚未攻克的一大难题。其治疗手段除改善患者全身情况外，有关慢性难愈合创面发生的分子生物学机制研究将对预防和治疗此类疾病起积极作用。[8～12]
, 百拇医药
创伤修复由参与修复的细胞与细胞外基质之间的相互作用共同完成。FN是细胞外基质的重要成份，可通过介导分子间或细胞间粘附来参与修复。此外，它通过影响组织修复细胞的趋化、调理和促进炎性细胞的吞噬、促进表皮细胞移行等作用，参与一系列修复过程。Herrick等[11]证实在糖尿病和下肢静脉溃疡中，FN含量降低，并且发现这种FN的降低来自于降解FN的蛋白酶含量增加及其mRNA表达水平增加。我们认为，溃疡创面FN含量的降低不仅来自其酶解作用的增加，另一个可能的重要原因也来自于FN产生减少，进而影响其它细胞及细胞外基质的作用，我们的实验结果证实了这一观点，即溃疡创面FN含量减少的原因之一是其转录水平的下调，这可能是造成慢性难愈合创面长期不愈合的原因之一。
经典检测基因表达水平的方法为杂交，存在难度大、定量困难，且难以检出表达水平低的基因等缺点。我们实验采用定量PCR方法。具有灵敏度高、专一性好、简便快速等特点。在实验中，为了消除不同样本、不同实验批次及测量的系统误差，我们选用在大多数细胞中均为高表达的β-actin作 为内对照，在同一反应管中同时扩增FN和β-actin，并以两者的比值来衡量FN的表达水平，避免了许多因素的干扰，使测定的结果更加准确、可靠。
, 百拇医药
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39525024)
作者单位：杨银辉(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037))
傅小兵(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037))
参考文献：
[1]Kono I, Matsumoto Y,Yano K,et al.Benificial effect of topical fibronectin in patients with keratoconjunctivitis sicca of Sjogren's syndrome.J Rheumatol,1985;12(5):487
[2]Wysoki A,Bergstresser PR,Baxter CR.Topical fibronectin therapy for treatment of a patient with chronic statis ulcers.Arch Dermatol,1988;124(2):175
, 百拇医药
[3]Riet IV,Greef CD,Favero HD.Production of fibronectin and adherence to fibronectin by human myeloma cell lines.Br J Haematl,1994;87(2):258
[4]Becker JC,Giuitzer R,Brocker EB,et al.A member of the melanoma antigen-recoding gene family is expressed in human skin during wound healing.Int J Cancer,1994;58(3);346
[5]Dukas K,Sarfati P,Vaysse N,et al.Quantitation of changes in the expression of multiple genes by simultaneous polymerase chain reaction.Anal Biochem,1993;215(1):66
, 百拇医药
[6]Apostolakos MJ,Schuermann WHT,Frampton MW,et al.Measurement of gene expression by multiplex competitive polymerase chain reaction.Anal Biochem,1993;213(2):277
[7]Babu JS,Kanangat S,Rouse BT.Limitation and modifications of quantitative polymerase chain reaction.J Immunol Method,1993 165(2):207
[8]傅小兵，杨银辉，孙同柱，等.转化生长因子β1与白细胞介素6 mRNA在糖尿病溃疡创面组织中的表达.中国修复重建外科杂志，1999；13(5)：259
[9]傅小兵，郭振荣，盛志勇.碱性成纤维细胞生长因子加速慢性难愈合创面愈合.中国修复重建外科杂志，1999；13(5)：270
[10]冯 江，杜文华，王 劲，等.多种生长因子促糖尿病患者难愈合性创面愈合的临床研究.中国修复重建外科杂志，1999；13(5)：273
[11]Herrick S,Spencer MJ,Shaw J,et al.Protease and inhibitor expression in venous and diabetic ulcers. Wound Rep Reg,1996;4(1):138
收稿日期：1998-12-09
修稿日期：1999-08-12, 百拇医药
单位：王亚平(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037)； 孙同柱(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037)；盛志勇(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037))
关键词：糖尿病溃疡；纤维连接蛋白；定量聚合酶链式反应
中国修复重建外科杂志000107 摘 要：目的 研究纤维连接蛋白在糖尿病患者足溃疡组织中的表达特征与规律，探讨纤维连接蛋白表达量的变化与糖尿病足溃疡发生的关系。方法 取患者溃疡创面及创缘组织为实验组，以患者正常皮肤为对照组，采用定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测纤维连接蛋白mRNA表达水平的变化。结果 在正常皮肤组织和溃疡组织中均存在纤维连接蛋白mRNA的表达，但其表达水平在溃疡组织中显著低于正常皮肤，表达量约为正常皮肤的34%。结论 糖尿病患者足溃疡组织中纤维连接蛋白mRNA表达水平降低，这种转录水平的下调可能是慢性难愈合溃疡发生的机制之一。
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DETERMINATION OF FIBRONECTIN mRNA EXPRESSION IN PATIENTS WITH DIABETIC ULCERS BY QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTION TECHNIQUE
YANG Yin-hui FU Xiao-bing WANG Ya-ping et al
(Trauma Center, the 304th Hospital of PLA. Beijing, P.R.China 100037)
Abstract：Objective To determine the characteristics and regularity of fibronectin mRNA expression in diabetic ulcers, and to investigate the relationship between the changes of fibronectin mRNA expression and pathogenesis of diabetic ulcer. Methods Biopsies were removed from the margins of diabetic foot ulcers, included surrounding skin as experimental group, and the biopsies from normal skin of the same patients as control group. The mRNA expression of fibronectin was measured by quantitative RT-PCR technique. Results The mRNA expression of fibronectin could be detected in both normal skin and diabetic foot ulcers, but the level of expression in diabetic ulcers was lower than that of normal skin. Conclusion The level of mRNA expression of fibronectin in diabetic ulcers is decreased, which suggest that the down-regulation of transcription may be one of the mechanisms of chronic impaired ulcers.
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Key words：Diabetic ulcer Fibronectin Quantitative polymerase chain reaction
Foundation item：National Science Foundation of Outstanding Youth of China (39525024)▲
纤维连接蛋白(fibronectin,FN)是存在于血浆和多种组织中起粘附作用的一种糖蛋白，是创伤修复过程中一种重要的细胞基质成份。它能加速血液凝固，对单核细胞和中性粒细胞具有化学趋化作用，能吸引成纤维细胞和内皮细胞向损伤区域移动。临床上应用FN能促进慢性角膜溃疡和静脉溃疡的上皮化[1、2]。我们应用定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检测糖尿病溃疡与正常皮肤中FN mRNA的表达水平，探讨FN mRNA表达水平的变化与糖尿病慢性溃疡发生的关系，为进一步研究慢性难愈合创面发生的分子生物学机制提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验标本选择
糖尿病伴有足慢性溃疡患者5例，其中男3例，女2例。年龄52～68岁。取患者溃疡组织作为标本，包括溃疡创面、创缘及部分周围皮肤组织为实验组；同时取患者正常皮肤作为对照组。
1.2 组织总RNA提取
利用总RNA提取试剂盒(美国Promega公司)，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取组织总RNA，实验操作按试剂盒说明书进行。用变性电泳鉴定RNA未被降解，并用DU-7型可见紫外分光光度计(美国Beckman公司)对RNA进行纯度分析及定量。
1.3 PCR引物序列
依照人FN、β-actin序列，采用以下PCR扩增引物，序列为FN[3]：5′-TGGGAATTCCGGAAGA-
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CAGGA-3′，5′-TTCGGATCCTTCTTGGAGGGC-TGA-3′；β-actin[4]:5′-GAGGGGGAA-ATCGTGCGTGACATCAA-3′,5′-GGAACCGCTCGTTGCC-AATAGTGA-3′。由中国科学院微生物研究所合成，经PAGE纯化。
1.4 定量PCR方法[5～7]
取总RNA 1.6 μg，在反应体系中加入AMV逆转录酶200 nmol/s,42 ℃进行逆转录反应。取逆转录产物cDNA 1.5 μl加入到PCR反应体系中进行PCR扩增。每一反应体系加入FN和β-actin的引物终浓度分别为0.2 μmol/L和0.05 μmol/L,PCR扩增条件为：94 ℃变性1分钟，53 ℃退火1分钟，72 ℃延伸1分钟，共32个循环。最后72 ℃延伸10分钟，4 ℃保存。
1.5 PCR电泳鉴定及产物定量
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取PCR产物10 μl在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察、照相。然后用CS-930薄层扫描仪(SHIMADZU)扫描各条带的吸收峰面积，所得数据以均数±标准差表示，并计算FN与β-actin吸收峰面积比。
2 结果
2.1 引物浓度的选择
在同一反应体系中同时扩增两种基因，由于编码两种物质的mRNA水平不同，因此扩增效率也不同。β-actin在组织中的含量高，在同时扩增FN与β-actin时，主要扩增β-actin，而FN的带很弱。根据FN与β-actin的mRNA含量及其扩增片段大小，将FN与β-actin的引物浓度选择为4∶1，使PCR产物与其基因表达水平之间呈线性关系。
2.2 最适循环数的选择
循环数的正确选择是PCR技术成功与否的重要条件。循环数在合适的范围内时，PCR产物才与循环数之间有较好的线性关系，对产物进行定量才有意义。我们研究了不同循环数与FN及β-actin表达量的关系，分别在循环数为26、28、30、32及34时取样，产物在2%琼脂糖凝胶进行电泳(图1)，并进行扫描定量，结果见图2。从图2中可知，在循环数小于32时，PCR产物与循环数之间呈线性关系。因此，我们选择PCR循环数为32。
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图1 不同循环数PCR产物电泳图
1：PCR Markers 2～6:循环数分别为26、28、30、32及34
Fig. 1 PCR products amplified from different number of cycles lane
1:PCR Markers lane 2～6:26、28、30、32、34 cycles of amplification
图2 不同循环数对PCR产物的影响
Fig. 2 The effect of different number of cycles on PCR products
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2.3 最适模板量的选择
与循环数一样，模板量只有在一定的范围内，PCR产物与基因的表达量才成正比，定量才有意义。为了避免RNA降解造成的影响，我们采用同一反应体系的RT产物作模板。分别取逆转录产物1、2、3、4及5 μl扩增(相当于总RNA 80、160、240、320及400 ng)，PCR产物各取10 μl进行电泳(图3)，并扫描定量(图4)。从图4可以看出，FN与β-actin的扩增动力学相似，在模板量小于4 μl时，PCR产物与模板量之间呈正比。因此，我们选择实验模板量为160 ng。
图3 不同模板量PCR产物电泳图
1：PCR Markers 2～6：模板量分别为80、160、240、320及400 ng总RNA
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Fig. 3 PCR products amplified from different amount of total RNA lane
1:PCR Markers lane 2～6:PCR products from
80、160、240、320、400 ng of total RNA
图4 不同模板量对PCR产物的影响
Fig. 4 The effect of different amount of
total RNA on PCR amplification
2.4 样品FN mRNA表达水平检测
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利用RT-PCR，以模板量为1.5 μl,循环参数为32进行扩增，分别从溃疡组织和正常皮肤组织中得到FN和β-actin的扩增产物(图5)，对扩增产物进行扫描定量，结果见附表。从附表中得知，糖尿病溃疡创面有FN表达，其表达量较正常皮肤组织明显减少。
图5 实验标本的PCR结果
1：PCR Markers 2:对照组 3：实验组
Fig. 5 PCR products of biopsies
lane 1:PCR Markers lane 2:Control group lane 3:Experimental group
附表 实验组与对照组FN mRNA表达水平(n=5,
±s), 百拇医药
Tab. The mRNA expression levels of fibronectin in
experimental group and control group (n=5,
±s) 组 别Groups
FN
β-actin
FN/β-actin
对照组
Control group
0.067±0.003
, http://www.100md.com
0.135±0.008
0.496
实验组
Experimental
group
0.039±0.012
0.228±0.014
0.171
3 讨论
糖尿病、下肢静脉曲张、放射性皮肤损伤等疾病所致的溃疡，常经久不愈，进而形成慢性难愈合创面，它不仅给患者带来极大的痛苦，同时也是创面愈合中尚未攻克的一大难题。其治疗手段除改善患者全身情况外，有关慢性难愈合创面发生的分子生物学机制研究将对预防和治疗此类疾病起积极作用。[8～12]
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创伤修复由参与修复的细胞与细胞外基质之间的相互作用共同完成。FN是细胞外基质的重要成份，可通过介导分子间或细胞间粘附来参与修复。此外，它通过影响组织修复细胞的趋化、调理和促进炎性细胞的吞噬、促进表皮细胞移行等作用，参与一系列修复过程。Herrick等[11]证实在糖尿病和下肢静脉溃疡中，FN含量降低，并且发现这种FN的降低来自于降解FN的蛋白酶含量增加及其mRNA表达水平增加。我们认为，溃疡创面FN含量的降低不仅来自其酶解作用的增加，另一个可能的重要原因也来自于FN产生减少，进而影响其它细胞及细胞外基质的作用，我们的实验结果证实了这一观点，即溃疡创面FN含量减少的原因之一是其转录水平的下调，这可能是造成慢性难愈合创面长期不愈合的原因之一。
经典检测基因表达水平的方法为杂交，存在难度大、定量困难，且难以检出表达水平低的基因等缺点。我们实验采用定量PCR方法。具有灵敏度高、专一性好、简便快速等特点。在实验中，为了消除不同样本、不同实验批次及测量的系统误差，我们选用在大多数细胞中均为高表达的β-actin作 为内对照，在同一反应管中同时扩增FN和β-actin，并以两者的比值来衡量FN的表达水平，避免了许多因素的干扰，使测定的结果更加准确、可靠。
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基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39525024)
作者单位：杨银辉(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037))
傅小兵(解放军第304医院创伤研究室(北京，100037))
参考文献：
[1]Kono I, Matsumoto Y,Yano K,et al.Benificial effect of topical fibronectin in patients with keratoconjunctivitis sicca of Sjogren's syndrome.J Rheumatol,1985;12(5):487
[2]Wysoki A,Bergstresser PR,Baxter CR.Topical fibronectin therapy for treatment of a patient with chronic statis ulcers.Arch Dermatol,1988;124(2):175
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[3]Riet IV,Greef CD,Favero HD.Production of fibronectin and adherence to fibronectin by human myeloma cell lines.Br J Haematl,1994;87(2):258
[4]Becker JC,Giuitzer R,Brocker EB,et al.A member of the melanoma antigen-recoding gene family is expressed in human skin during wound healing.Int J Cancer,1994;58(3);346
[5]Dukas K,Sarfati P,Vaysse N,et al.Quantitation of changes in the expression of multiple genes by simultaneous polymerase chain reaction.Anal Biochem,1993;215(1):66
, 百拇医药
[6]Apostolakos MJ,Schuermann WHT,Frampton MW,et al.Measurement of gene expression by multiplex competitive polymerase chain reaction.Anal Biochem,1993;213(2):277
[7]Babu JS,Kanangat S,Rouse BT.Limitation and modifications of quantitative polymerase chain reaction.J Immunol Method,1993 165(2):207
[8]傅小兵，杨银辉，孙同柱，等.转化生长因子β1与白细胞介素6 mRNA在糖尿病溃疡创面组织中的表达.中国修复重建外科杂志，1999；13(5)：259
[9]傅小兵，郭振荣，盛志勇.碱性成纤维细胞生长因子加速慢性难愈合创面愈合.中国修复重建外科杂志，1999；13(5)：270
[10]冯 江，杜文华，王 劲，等.多种生长因子促糖尿病患者难愈合性创面愈合的临床研究.中国修复重建外科杂志，1999；13(5)：273
[11]Herrick S,Spencer MJ,Shaw J,et al.Protease and inhibitor expression in venous and diabetic ulcers. Wound Rep Reg,1996;4(1):138
收稿日期：1998-12-09
修稿日期：1999-08-12, 百拇医药