端粒、端粒酶与肿瘤
作者：王怀胜 岑瑛
单位：王怀胜(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041)； 岑瑛(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041)
关键词：
华西医学000189 综述 审校
分类号：R329.2+6；R730.43 文献标识码：D
文章编号：1002-0179(2000)01-0121-02▲
1 端粒的结构和功能
本世纪30年代，两位著名的遗传学家Muller和Mc Clintock分别发现真核细胞染色体末端不能和其他染色体片段发生连接，并把这种特殊的末端序列称为端粒(telomere)〔1，2〕。端粒有稳定和保护染色体的功能。失去端粒的染色体易降解，出现端端融合和重组，损害细胞正常功能，甚至导致细胞死亡。端粒由端粒DNA与特异的蛋白结合形成端粒核蛋白复合体，其DNA部份由许多短的正向重复序列组成，总长度可达10kb以上，重复序列长约5-8bp，富含G碱基，后来证明人和脊椎动物的重复序列为TTAGGG〔3〕。目前发现，端粒具有两种端粒结合蛋白。第一种端粒结合蛋白(telomere-binding proteins)是一类特异结合在端粒DNA上的蛋白质，发酵酵母中为RAP1蛋白，哺乳类动物为TRF1蛋白〔4，5〕。第二种端粒结合蛋白(telomere-associated proteins)与第一类蛋白结合。这类蛋白质有发酵酵母中的SIR3/SIR4蛋白〔6〕，在人类为TRF2〔7〕。这两类蛋白对端粒的长度和功能具有调控作用〔8〕。
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2 端粒酶的结构和功能
DNA聚合酶由5＇→3＇方向复制DNA过程中，需要互补单链作为模板和RNA引物，随着RNA引物的移走，模板DNA末端有一部分不能完全复制下来，这样势必造成复制的染色体越来越短，稳定性下降，Watson将其称为末端复制问题(end replication problem)〔9〕。Greider与Blackburn对此问题进行了深入的研究，并首先在四膜虫的细胞提取液中发现了一种酶活性成份，将其命名为端粒末端转移酶—端粒酶(telomerase)〔10〕。这种酶由蛋白质和RNA两部分组成核糖蛋白复合体(RNP)。端粒酶RNA含有一段模板序列，指导合成端粒的DNA重复序列片段，因而也是一种逆转录酶，对热、蛋白酶K和RNA酶敏感，端粒酶能维持和平衡端粒序列长度，对断裂染色体尖端的修复具有重要作用。1989年首次在人宫颈癌细胞株—Hela细胞中发现和鉴定了人类端粒酶的存在。1995年克隆了人端粒酶RNA组分基因，命名为hTR(human telomerase RNA)基因。该基因定位于第3号染色体(3q23.3)，约有450个碱基，包含5＇(CUAACCCUAAC)3＇具11个碱基的模板序列，每次与1.5个TTAGGG互补而特异地合成人的染色体端粒的DNA〔11〕。1995年在四膜虫中克隆了两种端粒酶的蛋白质亚单位P80和P95，分子量分别为80KD、95KD〔12〕，P95可与端粒的DNA相互作用，P80与端粒酶的RNA模板结合，人类P80的同源物称为TP1蛋白(telomerase-associated protein 1),含2627个氨基酸〔13〕，但其基因表达与端粒酶活性并不一致〔14〕。通过对游扑虫和酵母端粒酶蛋白催化亚单位P123蛋白和EST1蛋白基因功能区的研究，相继克隆了人类的端粒酶催化亚单位，不同作者分别命名为hEST2/TP2/hTRT〔15，16，17〕，并且发现hEST2/TP2/hTRT的表达水平与细胞端粒酶活性一致〔18〕。
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3 端粒，端粒酶与细胞增殖
1965年Hayflick首先描述了正常人成纤维细胞分裂次数是有限的，随后大多数体细胞都有所谓的分裂钟(mitolic clock)来限制它们的分裂次数。一般来说，正常情况下培养的体细胞分裂40～70式后衰老死亡，此即Hayflick限制或M1期(Mortality Stage 1)。由于端粒长度有限细胞在分裂一次导致50～200bp的端区丢失，因此推测端粒长度限制了细胞分裂次数，端粒长度是细胞分裂钟的物质基础。Allsopp等〔19〕证明端粒长度能预测体外培养细胞的复制能力，他们收集从胎儿到93岁供血者的纤维母细胞进行培养，培养初期测定端粒长度，发现细胞分裂次数与端粒长度直接相关。早衰综合征(Hutchinson-Gliford Syndrome)患者的细胞端粒长度明显短于正常人，并且体外培养细胞的增殖能力下降。人精子细胞增殖能力强于体细胞，它们相应的端粒长度分别为9Kb和4Kb。更有趣的研究发现，接受骨髓移植术的年轻患者的骨髓细胞端粒长度短于供体，平均每次分裂丢失0.4Kb，比健康对照组早15年开始衰老，并且造血性疾病的发病率增高〔20，21〕。
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正常情况下，细胞端粒酶失活时仍保留模板RNA，而仅仅是蛋白成分失活，通过转染端粒酶 蛋白亚单位的基因恢复端粒酶活性，从而添加端粒重复片段，延长端粒，细胞至少增加传代20次，比对照组有更稳定的染色体组型，代表细胞衰老的指标β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色减少。在视网膜色素上皮细胞，包皮成纤维细胞，血管内皮细胞等不同类型细胞中也得到同样结果，由此推断端粒缩短可能是细胞衰老的普遍现象〔22〕。
4 端粒酶与细胞永生化和肿瘤
端粒长度限制了细胞分裂次数，永生化细胞要永远分裂下去就必须维持和平衡端粒长度，由此推测永生化细胞中应该有端粒酶的活性表达，以维持其生长。M1/M2假说认为细胞获得永生化必须克服两个危机期，M1期和M2期(mortality stage2)。在M1期，细胞端粒开始短缩，到达临界水平时发生DNA损损反应，通过抑癌蛋白P53，pRb等阻止细胞分裂，细胞开始衰老死亡〔23〕。癌基因SV40T，HPV16E6和E7，抑癌基因P53和pRb突变均能使细胞逃逸M1期，并获得额外增殖能力。此时端粒酶仍为阴性，端粒极度缩短，最终到达M2期，极少数细胞由于激活了端粒酶，端粒结构和功能得以恢复，基因组保持稳定，使细胞永生化〔24〕。
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1990年Harley等断定端粒酶活化是细胞获得永生化的必需途径〔25〕。Bodnar等在正常人体细胞中导入端粒酶，使细胞获得永生化〔26〕。而获得永生化是肿瘤恶变的重要步骤〔28〕。Kim等〔24〕用高敏感性TRAP(Telomere Repeat Amplification Protocol)法对12种肿瘤的101个活检标本和100个永生细胞系中端粒酶的活性进行了大规模检测，以正常细胞为对照，在100个永生细胞系中的98个和101个标本中的90个检测到端粒酶活性，而在22个正常组织标本和50例培养正常体细胞中未检测出该酶活性。现有统计资料〔28〕表明多种恶性肿瘤的端粒酶阳性率高达84.4%，仅4.2%的正常组织，癌旁组织和良性肿瘤中端粒酶呈阳性，一些癌前病变，如胃和肠的非典型增生，骨髓异常增生综合征，慢性放射性皮肤溃疡中表达低水平端粒酶活性，正常人体生殖细胞，淋巴细胞，骨髓细胞，上皮细胞，小肠隐窝细胞因生长活跃，也可测到低水平的端粒酶活性。
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由于端粒酶和恶性肿瘤关系密切，结合传统细胞形态学检查，可以把它作为恶性肿瘤早期诊断和推测预后的指标，大约50%膀胱肿瘤由于缺乏有效的细胞学指标而造成误诊，通过膀胱冲洗，尿液中脱落细胞的端粒酶活性测定能检测出约90%膀胱肿瘤〔29〕。Hiyama发现儿童神经母细胞瘤Ⅲ、Ⅳ期检测到端粒酶活性高表达者预后不良，而一例Ⅳ-S期患者端粒酶检测阴性，肿瘤不治而愈〔30〕。通过细针穿刺抽吸组织活检，检测细胞端粒酶活性作为肿瘤组织残留，转移和复发的监测指标。
5 端粒酶抑制
端粒酶在肿瘤发生、发展中起着重要作用，从理论上讲，抑制端粒酶可以抑制肿瘤细胞生长。由于大部分正常组织，细胞不表达端粒酶活性，抑制端粒酶对全身影响极小，因而是抗肿瘤治疗的理想靶点。目前正在开展端粒酶的抑制或采用基因治疗方法主要有如下几种途径：(1)逆转录酶抑制剂类：二脱氧鸟苷酸(ddG)，叠氮胸苷(AZT)〔31〕能抑制端粒酶活性，但由于浓度要求高，同时又抑制线粒体中RNA聚合酶，因而其应用受到限制；(2)人端粒酶RNA(hTR)互补的反义核苷酸：在Heal细胞离体实验中转入反义寡核苷酸，导致端粒酶活性抑制，端粒缩短，引起细胞危机〔32〕。人为设计，合成简易的反义寡核苷酸(ONs)亦可抑制端粒酶活性，但需要长约18～40个碱基的ONs，浓度要求较高，存在非特异效应，易被核酸酶分解〔33〕。Norton等用与端粒酶模板互补的反义RNA-肽核酸(PNAs)，能增加特异性和亲和力，对端粒酶抑制显著增强〔34〕；(3)利用棒槌状核糖核酸酶(hammerhead ribozyme)裂解端粒酶RNA，在体外培养的子宫内膜癌细胞株中表现端粒酶活性受到抑制，且裂解部位靠近模板区能增强抑制效应〔35〕；(4)针对hTR基因应用反义技术对其mRNA进行抑制或诱导hTR基因突变，Lundblad等发现EST1酵母突变株表现衰老表型，端粒缩短，染色体丢失。(5)诱导RNA模板区突变型端粒酶高表达，与野生型竞争抑制其活性〔36〕。
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6 结语
自从被发现10多年来，端粒和端粒酶研究工作进展相当迅速。包括端粒酶的结构和基因克隆，端粒酶抑制，端粒酶蛋白催化亚单位的研究等，但还存在许多重要问题有待解决，如端粒酶的激活和调控机制，端粒酶定量检测方法和检测方法标准化，端粒酶蛋白亚单位与调控机制，端粒酶与端粒结合蛋白关系，端粒延长的非端粒酶依赖机制等。相信随着研究的深入和这些问题的解决，端粒酶必将对肿瘤的诊断和治疗产生重大的作用。■
参考文献：
[1] Muller HJ.Woods Hole，1938；13∶181-198.
[2] Mc Clintock B.Genetics，1941；41∶234-282.
[3] Morin GB.Cell，1989；59∶521.
, 百拇医药
[4] Chong L，Steensel B，Broccoli D，et al.science，1995，270∶1663-1670.
[5] Wright JH，Goltschling DE，et al.Genes，Dev，1992；6∶197-210.
[6] Moretti P，Freeman K，et al.Genes Dev，1994；8∶2257-2269.
[7] Van Steensel B，Smogorzewska A，et al.Cell，1998；92∶401-403.
[8] Mc Eachern MJ，Blackblurn EH.Nature，1995；376∶403-409.
[9] Watson JD，Nature New Biol，1972；239∶197.
, http://www.100md.com
[10] Greider CW，Blackburn Eh.Cell，1985；43∶405-413.
[11] Harley CB，et al.Proc Am Assoc Cancer Res，1995；36∶671.
[12] Collins K，Kobayashi R，Greider CW.Cell，1995；81∶677-686.
[13] Harrington L，Mcphail T，et al.Science，1997；275：973-977.
[14] Nakayama J，Saito M，et al.Cell 1995；88∶875.
[15] Meyerson M，counter CM，et al.Cell，1997；90∶785-795.
, 百拇医药
[16] Nakamura TM，Morin GB，et al.Science，1997；277∶955-959.
[17] Harrington L，et al.gene Dev，1997；11∶3109.
[18] Weinrich SL，et al，Nat Genet，1997；17∶498-502.
[19] Allsopp RC，et al.Proc Natl Acad Sci RSA，1992；89∶10114-10118.
[20] Shuy JW，Lancet 1998；351∶178-181.
[21] Wynm RF，Cross MA，et al.Lancet 1998；351∶178-184.
, 百拇医药
[22] Bodnar AG，Outllette M，et al.Science，1998；279∶349-352.
[23] Wright WE，Shay JW，1992；27∶383-389.
[24] Kim NW，Piatyszek MA，et al.Science，1994；266∶2011-2015.
[25] Harley CB，et al.Nature，1990；345∶458-460.
[26] Bodnar，Science，1998；279-352.
[27] Shay JW，et al.Int J Oncol，1993；3∶559-563.
[28] Rhy MS，J Natl Cnacer Inst，1995；87；884-894.
, 百拇医药
[29] Yosthida K，et al.Cancer，1997；79∶362-369.
[30] Hiyana E，Hiyana K，et al.Nat Med，1996；1∶249.31 Strahl C，Blackburn EH，Mol Biol，1996；16∶53-65.
[32] Feng J，Funk WK，et al.Science，1995；269∶1236-1241.
[33] Kriea AM，et al.Antisense Res Dev 1995；5∶241.
[34] Norton JC，et al.Nuture Biotechnol 1996；14∶615-619.
[35] Yokoyana Y，Takahashi Y，et al.Cancer 1998；58∶5406-5410.
[36] Yu GI，et al.Nature，1990；344∶126.
收稿日期：1999-12-04, http://www.100md.com
单位：王怀胜(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041)； 岑瑛(华西医科大学附属第一医院整形烧伤科，成都，610041)
关键词：
华西医学000189 综述 审校
分类号：R329.2+6；R730.43 文献标识码：D
文章编号：1002-0179(2000)01-0121-02▲
1 端粒的结构和功能
本世纪30年代，两位著名的遗传学家Muller和Mc Clintock分别发现真核细胞染色体末端不能和其他染色体片段发生连接，并把这种特殊的末端序列称为端粒(telomere)〔1，2〕。端粒有稳定和保护染色体的功能。失去端粒的染色体易降解，出现端端融合和重组，损害细胞正常功能，甚至导致细胞死亡。端粒由端粒DNA与特异的蛋白结合形成端粒核蛋白复合体，其DNA部份由许多短的正向重复序列组成，总长度可达10kb以上，重复序列长约5-8bp，富含G碱基，后来证明人和脊椎动物的重复序列为TTAGGG〔3〕。目前发现，端粒具有两种端粒结合蛋白。第一种端粒结合蛋白(telomere-binding proteins)是一类特异结合在端粒DNA上的蛋白质，发酵酵母中为RAP1蛋白，哺乳类动物为TRF1蛋白〔4，5〕。第二种端粒结合蛋白(telomere-associated proteins)与第一类蛋白结合。这类蛋白质有发酵酵母中的SIR3/SIR4蛋白〔6〕，在人类为TRF2〔7〕。这两类蛋白对端粒的长度和功能具有调控作用〔8〕。
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2 端粒酶的结构和功能
DNA聚合酶由5＇→3＇方向复制DNA过程中，需要互补单链作为模板和RNA引物，随着RNA引物的移走，模板DNA末端有一部分不能完全复制下来，这样势必造成复制的染色体越来越短，稳定性下降，Watson将其称为末端复制问题(end replication problem)〔9〕。Greider与Blackburn对此问题进行了深入的研究，并首先在四膜虫的细胞提取液中发现了一种酶活性成份，将其命名为端粒末端转移酶—端粒酶(telomerase)〔10〕。这种酶由蛋白质和RNA两部分组成核糖蛋白复合体(RNP)。端粒酶RNA含有一段模板序列，指导合成端粒的DNA重复序列片段，因而也是一种逆转录酶，对热、蛋白酶K和RNA酶敏感，端粒酶能维持和平衡端粒序列长度，对断裂染色体尖端的修复具有重要作用。1989年首次在人宫颈癌细胞株—Hela细胞中发现和鉴定了人类端粒酶的存在。1995年克隆了人端粒酶RNA组分基因，命名为hTR(human telomerase RNA)基因。该基因定位于第3号染色体(3q23.3)，约有450个碱基，包含5＇(CUAACCCUAAC)3＇具11个碱基的模板序列，每次与1.5个TTAGGG互补而特异地合成人的染色体端粒的DNA〔11〕。1995年在四膜虫中克隆了两种端粒酶的蛋白质亚单位P80和P95，分子量分别为80KD、95KD〔12〕，P95可与端粒的DNA相互作用，P80与端粒酶的RNA模板结合，人类P80的同源物称为TP1蛋白(telomerase-associated protein 1),含2627个氨基酸〔13〕，但其基因表达与端粒酶活性并不一致〔14〕。通过对游扑虫和酵母端粒酶蛋白催化亚单位P123蛋白和EST1蛋白基因功能区的研究，相继克隆了人类的端粒酶催化亚单位，不同作者分别命名为hEST2/TP2/hTRT〔15，16，17〕，并且发现hEST2/TP2/hTRT的表达水平与细胞端粒酶活性一致〔18〕。
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3 端粒，端粒酶与细胞增殖
1965年Hayflick首先描述了正常人成纤维细胞分裂次数是有限的，随后大多数体细胞都有所谓的分裂钟(mitolic clock)来限制它们的分裂次数。一般来说，正常情况下培养的体细胞分裂40～70式后衰老死亡，此即Hayflick限制或M1期(Mortality Stage 1)。由于端粒长度有限细胞在分裂一次导致50～200bp的端区丢失，因此推测端粒长度限制了细胞分裂次数，端粒长度是细胞分裂钟的物质基础。Allsopp等〔19〕证明端粒长度能预测体外培养细胞的复制能力，他们收集从胎儿到93岁供血者的纤维母细胞进行培养，培养初期测定端粒长度，发现细胞分裂次数与端粒长度直接相关。早衰综合征(Hutchinson-Gliford Syndrome)患者的细胞端粒长度明显短于正常人，并且体外培养细胞的增殖能力下降。人精子细胞增殖能力强于体细胞，它们相应的端粒长度分别为9Kb和4Kb。更有趣的研究发现，接受骨髓移植术的年轻患者的骨髓细胞端粒长度短于供体，平均每次分裂丢失0.4Kb，比健康对照组早15年开始衰老，并且造血性疾病的发病率增高〔20，21〕。
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正常情况下，细胞端粒酶失活时仍保留模板RNA，而仅仅是蛋白成分失活，通过转染端粒酶 蛋白亚单位的基因恢复端粒酶活性，从而添加端粒重复片段，延长端粒，细胞至少增加传代20次，比对照组有更稳定的染色体组型，代表细胞衰老的指标β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色减少。在视网膜色素上皮细胞，包皮成纤维细胞，血管内皮细胞等不同类型细胞中也得到同样结果，由此推断端粒缩短可能是细胞衰老的普遍现象〔22〕。
4 端粒酶与细胞永生化和肿瘤
端粒长度限制了细胞分裂次数，永生化细胞要永远分裂下去就必须维持和平衡端粒长度，由此推测永生化细胞中应该有端粒酶的活性表达，以维持其生长。M1/M2假说认为细胞获得永生化必须克服两个危机期，M1期和M2期(mortality stage2)。在M1期，细胞端粒开始短缩，到达临界水平时发生DNA损损反应，通过抑癌蛋白P53，pRb等阻止细胞分裂，细胞开始衰老死亡〔23〕。癌基因SV40T，HPV16E6和E7，抑癌基因P53和pRb突变均能使细胞逃逸M1期，并获得额外增殖能力。此时端粒酶仍为阴性，端粒极度缩短，最终到达M2期，极少数细胞由于激活了端粒酶，端粒结构和功能得以恢复，基因组保持稳定，使细胞永生化〔24〕。
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1990年Harley等断定端粒酶活化是细胞获得永生化的必需途径〔25〕。Bodnar等在正常人体细胞中导入端粒酶，使细胞获得永生化〔26〕。而获得永生化是肿瘤恶变的重要步骤〔28〕。Kim等〔24〕用高敏感性TRAP(Telomere Repeat Amplification Protocol)法对12种肿瘤的101个活检标本和100个永生细胞系中端粒酶的活性进行了大规模检测，以正常细胞为对照，在100个永生细胞系中的98个和101个标本中的90个检测到端粒酶活性，而在22个正常组织标本和50例培养正常体细胞中未检测出该酶活性。现有统计资料〔28〕表明多种恶性肿瘤的端粒酶阳性率高达84.4%，仅4.2%的正常组织，癌旁组织和良性肿瘤中端粒酶呈阳性，一些癌前病变，如胃和肠的非典型增生，骨髓异常增生综合征，慢性放射性皮肤溃疡中表达低水平端粒酶活性，正常人体生殖细胞，淋巴细胞，骨髓细胞，上皮细胞，小肠隐窝细胞因生长活跃，也可测到低水平的端粒酶活性。
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由于端粒酶和恶性肿瘤关系密切，结合传统细胞形态学检查，可以把它作为恶性肿瘤早期诊断和推测预后的指标，大约50%膀胱肿瘤由于缺乏有效的细胞学指标而造成误诊，通过膀胱冲洗，尿液中脱落细胞的端粒酶活性测定能检测出约90%膀胱肿瘤〔29〕。Hiyama发现儿童神经母细胞瘤Ⅲ、Ⅳ期检测到端粒酶活性高表达者预后不良，而一例Ⅳ-S期患者端粒酶检测阴性，肿瘤不治而愈〔30〕。通过细针穿刺抽吸组织活检，检测细胞端粒酶活性作为肿瘤组织残留，转移和复发的监测指标。
5 端粒酶抑制
端粒酶在肿瘤发生、发展中起着重要作用，从理论上讲，抑制端粒酶可以抑制肿瘤细胞生长。由于大部分正常组织，细胞不表达端粒酶活性，抑制端粒酶对全身影响极小，因而是抗肿瘤治疗的理想靶点。目前正在开展端粒酶的抑制或采用基因治疗方法主要有如下几种途径：(1)逆转录酶抑制剂类：二脱氧鸟苷酸(ddG)，叠氮胸苷(AZT)〔31〕能抑制端粒酶活性，但由于浓度要求高，同时又抑制线粒体中RNA聚合酶，因而其应用受到限制；(2)人端粒酶RNA(hTR)互补的反义核苷酸：在Heal细胞离体实验中转入反义寡核苷酸，导致端粒酶活性抑制，端粒缩短，引起细胞危机〔32〕。人为设计，合成简易的反义寡核苷酸(ONs)亦可抑制端粒酶活性，但需要长约18～40个碱基的ONs，浓度要求较高，存在非特异效应，易被核酸酶分解〔33〕。Norton等用与端粒酶模板互补的反义RNA-肽核酸(PNAs)，能增加特异性和亲和力，对端粒酶抑制显著增强〔34〕；(3)利用棒槌状核糖核酸酶(hammerhead ribozyme)裂解端粒酶RNA，在体外培养的子宫内膜癌细胞株中表现端粒酶活性受到抑制，且裂解部位靠近模板区能增强抑制效应〔35〕；(4)针对hTR基因应用反义技术对其mRNA进行抑制或诱导hTR基因突变，Lundblad等发现EST1酵母突变株表现衰老表型，端粒缩短，染色体丢失。(5)诱导RNA模板区突变型端粒酶高表达，与野生型竞争抑制其活性〔36〕。
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6 结语
自从被发现10多年来，端粒和端粒酶研究工作进展相当迅速。包括端粒酶的结构和基因克隆，端粒酶抑制，端粒酶蛋白催化亚单位的研究等，但还存在许多重要问题有待解决，如端粒酶的激活和调控机制，端粒酶定量检测方法和检测方法标准化，端粒酶蛋白亚单位与调控机制，端粒酶与端粒结合蛋白关系，端粒延长的非端粒酶依赖机制等。相信随着研究的深入和这些问题的解决，端粒酶必将对肿瘤的诊断和治疗产生重大的作用。■
参考文献：
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[7] Van Steensel B，Smogorzewska A，et al.Cell，1998；92∶401-403.
[8] Mc Eachern MJ，Blackblurn EH.Nature，1995；376∶403-409.
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[12] Collins K，Kobayashi R，Greider CW.Cell，1995；81∶677-686.
[13] Harrington L，Mcphail T，et al.Science，1997；275：973-977.
[14] Nakayama J，Saito M，et al.Cell 1995；88∶875.
[15] Meyerson M，counter CM，et al.Cell，1997；90∶785-795.
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[16] Nakamura TM，Morin GB，et al.Science，1997；277∶955-959.
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[19] Allsopp RC，et al.Proc Natl Acad Sci RSA，1992；89∶10114-10118.
[20] Shuy JW，Lancet 1998；351∶178-181.
[21] Wynm RF，Cross MA，et al.Lancet 1998；351∶178-184.
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[22] Bodnar AG，Outllette M，et al.Science，1998；279∶349-352.
[23] Wright WE，Shay JW，1992；27∶383-389.
[24] Kim NW，Piatyszek MA，et al.Science，1994；266∶2011-2015.
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[26] Bodnar，Science，1998；279-352.
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[34] Norton JC，et al.Nuture Biotechnol 1996；14∶615-619.
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收稿日期：1999-12-04, http://www.100md.com