协同刺激分子及其抗体在实验性变态反应性神经炎中的作用
作者：杨欢 肖波 谢光洁 彭永 李静 王容
单位：(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院神经病学研究所)
关键词：
中华医学杂志000128 实验性变态反应神经炎(EAN)是格林巴利综合征(GBS)的动物模型。T细胞的活化和克隆扩增导致细胞和体液免疫异常在EAN及GBS中起重要作用[1]。T细胞活化需要的两个信号为：(1)由T细胞表面的TCR/CD3复合物与抗原提呈细胞(APC)上的组织相容性抗原(MHC)II类抗原相互作用，赋予免疫应答的特异性；(2)由T细胞上的协同刺激分子与APC表面的配体结合所提供[2]。已发现，阻断CD28/CTLA-4：B7的结合后可预防实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的发生或减轻其发病程度[3]。本研究中我们观察了CD28/CTLA-4:B7及CTL A4-Ig和抗CD28抗体在EAN中的作用。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.实验动物分组：取40只健康Wistar大鼠(6～8周龄)，分为EAN组10只；抗CD28单抗治疗组10只；CTLA4-Ig治疗组10只；对照组10只。
2.建立EAN模型后，抗CD28单抗及CTLA4-Ig注射组每天分别腹腔注入抗CD28单抗和CTLA4-Ig(0.5 mg/kg体重×10天)，EAN组及对照组仅注射PBS；根据参考文献分级进行发病临床观察[4]；于发病濒死时或第28 d取血，分离淋巴细胞，取坐骨神经，作HE染色及Weil's髓鞘染色；采用间接免疫荧光法检测血中及病变组织中T细胞上B7-1，B7-2，CD28和CTLA-4的表达。
3.统计学处理：计数10个高倍视野下的阳性细胞数，取其平均值；采用方差分析及q检验。
二、结果
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1.抗CD28单抗及CTLA4-Ig对EAN发病的影响：对照组大鼠无发病，其它3组大鼠在免疫后的第12 d至18 d先后发病，22天左右达高峰。EAN组发病率80%，以中重度为主；其发病程度与EAN组比差异有显著意义(P<0.05)；CTLA4-Ig治疗组发病率80%，以重度为主，其发病程度与EAN组比有增高趋势，但统计学无差异。HE染色及Weil's髓鞘染色显示，发病动物的神经组织切片中有不同程度的炎性细胞浸润，并围绕小静脉形成血管套；髓鞘的改变主要为薄髓鞘及片状脱失。病理改变程度与临床评级基本一致。
2.外周血及周围神经浸润淋巴细胞上B7-1、B7-2、CD28、CTLA-4的表达(表1)：(1)外周血中 CTLA-4在NS组及CTLA4-Ig注射组无表达。在EAN组及抗CD28单抗注射组仅见极少量表达；B7-1、B7-2、CD28的表达CTLA4-Ig注射组最高，EAN组次之，抗CD28单抗注射组较低，而对照组极低，各组间差异有显著意义(P<0.01)。(2)周围神经中生理盐水组4种协同刺激分子均未检测出表达，CTLA-4在各组中也未见表达；EAN组B7-1、B7-2、CD28的表达高于抗CD28单抗注射组(P<0.01)而低于CTLA4-Ig注射组(P<0.01)。
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表1 大鼠外周血及周围神经浸润淋巴细胞上协同刺激分子的表达(个/HP，
±s) 组别
鼠数
B7-1
B7-2
CD28
CTLA-4
血液
对照组
10
0.9±0.3*
2.5±0.6*
, 百拇医药
2.1±0.5*…
EAN组
10
17.9±4.2**
17.0±3.5*
12.4±2.7*
1.49±0.28**
CTLA4-Ig注射组
10
23.6±4.3
24.0±4.1
, 百拇医药
16.8±3.6…
抗CD28单抗注射组
10
13.0±3.0
10.7±2.4
5.1±1.6
1.18±0.25
组织
EAN组
10
15.8±2.9△
5.1±1.9△
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7.2±2.0△…
CTLA4-Ig注射组
10
19.0±5.4
19.6±6.2
11.4±2.8…
抗CD28单抗注射组
10
9.5±2.9
2.9±0.7
3.9±1.0…
注：EAN组、CTLA4-Ig组、抗CD28单抗注射组与对照组比较，q值分别为13.82、11.65、9.87；8.43、7.96、6.82；7.91、6.79、7.24；* P<0.01。EAN组与抗CD28单抗注射组比较，q值分别为10.72、11.29、9.63，** P<0.01，与CTLA4-Ig注射组比较，q值分别为6.57、8.66、6.73，P<0.01；EAN组与抗CD28单抗注射组比较，q值分别为8.11、7.35、6.92，△ P<0.01，与CTLA4-Ig组比较，q值分别为6.79、5.83、6.04，P<0.01；…未检出CTLA-4 三、讨论
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一般认为，B7存在于活化的B细胞、T细胞、树突状细胞中，B7-1主要介导细胞免疫，而B7-2主要与体液免疫有关[5]。本研究我们观察到，EAN中B7-2和B7-1的表达均明显增加，提示体液免疫和细胞免疫均参与了EAN的发生。CD28表达于静息及活化的T细胞表面，而CTLA-4在静息T细胞中不表达，激活后表达可成百倍地增多。本研究中，对照组大鼠CD28可检测出少量表达，而CTLA-4则未见表达，与文献报道一致。发病后EAN组两者迅速增加，表明均参与了EAN的发病。CTLA-4的表达强度仅为CD28的1/15～1/20，与文献报道CTLA-4低丰度表达、高亲和力的特点相符[6]。
本研究在注射抗CD28单抗后，可能由于B7与CD28的结合受到抑制，免疫反应下调，B7-1、B7-2、CD28的表达减少；而CTLA4-Ig注射组相反，由于阻断了CTLA-4的抑制作用，提高了T细胞反应性，上述指标表达增强，加重了发病程度。接受抗CD28单抗注射治疗的大鼠仍未能完全控制发病，一方面可能与B7-1、B7-2、CD28的表达未能完全抑制有关；另一方面也提示EAN的发病可能不仅仅通过CD28/CTLA-4：B7途径激活T细胞，还可能通过其它协同刺激分子激活途径。此外，EAN的发病除了T细胞的激活外，还涉及许多其它机制的参与，因此，进一步的深入研究很有必要。
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参考文献：
[1]Khalili-Shirazi A, Hughes RA, Brostoff SW, et al. T cell responses to myelin protein in Guillain-Barre Syndrome. J Neurol Sci, 1992, 111:200-203.
[2]Peach RJJ, Bajorath J, Naemura G, et al. Both extracellular immunoglobulin-like domains of CD80 contain residues critical for binding T cell grface receptors CTLA-4 and CD28. J Bol Chem, 1995, 270:21181-21187.
[3]Tan P, Anasetti C, Hansen JA, et al. Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human T lymphocytes by blocking interaction of CD28 with its natural ligand B7/BB1. J Exp Med, 1993, 177:165-173.
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[4]Archelos JL, Maurer M, Jung S, et al. Inhibition of experimental autoimmune neuritis by an antibody to the lymphocyte function-associated antigen-1. Lab Invest, 1994, 70:667-675.
[5]Kuchroo VK, Das MP, Brown JA, et al. B7- and B7-2 costimulatory moleculec activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to actoimmune disease therapy. Cell, 1995, 80:707-718.
[6]Hathcock KSG, Laszlo HB, Dickler J, et al.Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation. Science, 1993, 262:905-907.
收稿：1998-10-07, 百拇医药
单位：(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院神经病学研究所)
关键词：
中华医学杂志000128 实验性变态反应神经炎(EAN)是格林巴利综合征(GBS)的动物模型。T细胞的活化和克隆扩增导致细胞和体液免疫异常在EAN及GBS中起重要作用[1]。T细胞活化需要的两个信号为：(1)由T细胞表面的TCR/CD3复合物与抗原提呈细胞(APC)上的组织相容性抗原(MHC)II类抗原相互作用，赋予免疫应答的特异性；(2)由T细胞上的协同刺激分子与APC表面的配体结合所提供[2]。已发现，阻断CD28/CTLA-4：B7的结合后可预防实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的发生或减轻其发病程度[3]。本研究中我们观察了CD28/CTLA-4:B7及CTL A4-Ig和抗CD28抗体在EAN中的作用。
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一、材料和方法
1.实验动物分组：取40只健康Wistar大鼠(6～8周龄)，分为EAN组10只；抗CD28单抗治疗组10只；CTLA4-Ig治疗组10只；对照组10只。
2.建立EAN模型后，抗CD28单抗及CTLA4-Ig注射组每天分别腹腔注入抗CD28单抗和CTLA4-Ig(0.5 mg/kg体重×10天)，EAN组及对照组仅注射PBS；根据参考文献分级进行发病临床观察[4]；于发病濒死时或第28 d取血，分离淋巴细胞，取坐骨神经，作HE染色及Weil's髓鞘染色；采用间接免疫荧光法检测血中及病变组织中T细胞上B7-1，B7-2，CD28和CTLA-4的表达。
3.统计学处理：计数10个高倍视野下的阳性细胞数，取其平均值；采用方差分析及q检验。
二、结果
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1.抗CD28单抗及CTLA4-Ig对EAN发病的影响：对照组大鼠无发病，其它3组大鼠在免疫后的第12 d至18 d先后发病，22天左右达高峰。EAN组发病率80%，以中重度为主；其发病程度与EAN组比差异有显著意义(P<0.05)；CTLA4-Ig治疗组发病率80%，以重度为主，其发病程度与EAN组比有增高趋势，但统计学无差异。HE染色及Weil's髓鞘染色显示，发病动物的神经组织切片中有不同程度的炎性细胞浸润，并围绕小静脉形成血管套；髓鞘的改变主要为薄髓鞘及片状脱失。病理改变程度与临床评级基本一致。
2.外周血及周围神经浸润淋巴细胞上B7-1、B7-2、CD28、CTLA-4的表达(表1)：(1)外周血中 CTLA-4在NS组及CTLA4-Ig注射组无表达。在EAN组及抗CD28单抗注射组仅见极少量表达；B7-1、B7-2、CD28的表达CTLA4-Ig注射组最高，EAN组次之，抗CD28单抗注射组较低，而对照组极低，各组间差异有显著意义(P<0.01)。(2)周围神经中生理盐水组4种协同刺激分子均未检测出表达，CTLA-4在各组中也未见表达；EAN组B7-1、B7-2、CD28的表达高于抗CD28单抗注射组(P<0.01)而低于CTLA4-Ig注射组(P<0.01)。
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表1 大鼠外周血及周围神经浸润淋巴细胞上协同刺激分子的表达(个/HP，
±s) 组别鼠数
B7-1
B7-2
CD28
CTLA-4
血液
对照组
10
0.9±0.3*
2.5±0.6*
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2.1±0.5*…
EAN组
10
17.9±4.2**
17.0±3.5*
12.4±2.7*
1.49±0.28**
CTLA4-Ig注射组
10
23.6±4.3
24.0±4.1
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16.8±3.6…
抗CD28单抗注射组
10
13.0±3.0
10.7±2.4
5.1±1.6
1.18±0.25
组织
EAN组
10
15.8±2.9△
5.1±1.9△
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7.2±2.0△…
CTLA4-Ig注射组
10
19.0±5.4
19.6±6.2
11.4±2.8…
抗CD28单抗注射组
10
9.5±2.9
2.9±0.7
3.9±1.0…
注：EAN组、CTLA4-Ig组、抗CD28单抗注射组与对照组比较，q值分别为13.82、11.65、9.87；8.43、7.96、6.82；7.91、6.79、7.24；* P<0.01。EAN组与抗CD28单抗注射组比较，q值分别为10.72、11.29、9.63，** P<0.01，与CTLA4-Ig注射组比较，q值分别为6.57、8.66、6.73，P<0.01；EAN组与抗CD28单抗注射组比较，q值分别为8.11、7.35、6.92，△ P<0.01，与CTLA4-Ig组比较，q值分别为6.79、5.83、6.04，P<0.01；…未检出CTLA-4 三、讨论
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一般认为，B7存在于活化的B细胞、T细胞、树突状细胞中，B7-1主要介导细胞免疫，而B7-2主要与体液免疫有关[5]。本研究我们观察到，EAN中B7-2和B7-1的表达均明显增加，提示体液免疫和细胞免疫均参与了EAN的发生。CD28表达于静息及活化的T细胞表面，而CTLA-4在静息T细胞中不表达，激活后表达可成百倍地增多。本研究中，对照组大鼠CD28可检测出少量表达，而CTLA-4则未见表达，与文献报道一致。发病后EAN组两者迅速增加，表明均参与了EAN的发病。CTLA-4的表达强度仅为CD28的1/15～1/20，与文献报道CTLA-4低丰度表达、高亲和力的特点相符[6]。
本研究在注射抗CD28单抗后，可能由于B7与CD28的结合受到抑制，免疫反应下调，B7-1、B7-2、CD28的表达减少；而CTLA4-Ig注射组相反，由于阻断了CTLA-4的抑制作用，提高了T细胞反应性，上述指标表达增强，加重了发病程度。接受抗CD28单抗注射治疗的大鼠仍未能完全控制发病，一方面可能与B7-1、B7-2、CD28的表达未能完全抑制有关；另一方面也提示EAN的发病可能不仅仅通过CD28/CTLA-4：B7途径激活T细胞，还可能通过其它协同刺激分子激活途径。此外，EAN的发病除了T细胞的激活外，还涉及许多其它机制的参与，因此，进一步的深入研究很有必要。
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参考文献：
[1]Khalili-Shirazi A, Hughes RA, Brostoff SW, et al. T cell responses to myelin protein in Guillain-Barre Syndrome. J Neurol Sci, 1992, 111:200-203.
[2]Peach RJJ, Bajorath J, Naemura G, et al. Both extracellular immunoglobulin-like domains of CD80 contain residues critical for binding T cell grface receptors CTLA-4 and CD28. J Bol Chem, 1995, 270:21181-21187.
[3]Tan P, Anasetti C, Hansen JA, et al. Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human T lymphocytes by blocking interaction of CD28 with its natural ligand B7/BB1. J Exp Med, 1993, 177:165-173.
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[4]Archelos JL, Maurer M, Jung S, et al. Inhibition of experimental autoimmune neuritis by an antibody to the lymphocyte function-associated antigen-1. Lab Invest, 1994, 70:667-675.
[5]Kuchroo VK, Das MP, Brown JA, et al. B7- and B7-2 costimulatory moleculec activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to actoimmune disease therapy. Cell, 1995, 80:707-718.
[6]Hathcock KSG, Laszlo HB, Dickler J, et al.Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation. Science, 1993, 262:905-907.
收稿：1998-10-07, 百拇医药